王威　孫曉麗

[摘要] 目的：采用酸性染料比色法測(cè)定剪刀股中總生物堿的含量并研究其抗氧化活性。方法：生物堿與酸性染料溴百里香酚藍(lán)結(jié)合，生成有色離子對(duì)，采用二氯甲烷萃取，測(cè)定二氯甲烷中有色離子對(duì)特征波長(zhǎng)處的吸光度，從而可計(jì)算其總生物堿含量;以維生素C為對(duì)照，測(cè)定其總抗氧化能力。結(jié)果：顯色后在425 nm處有最大吸收，鹽酸小檗堿與溴百里香酚藍(lán)顯色后在20-60 ?g/mL 范圍內(nèi)成線性關(guān)系，平均回收率為 99.12 %，RSD為 4.9 %（n=5）。當(dāng)剪刀股總生物堿濃度為 0.05 mg/mL 時(shí)，測(cè)定總還原能力，吸光度值為 0.355。結(jié)論：酸性染料比色法具有良好的專(zhuān)屬性、精密度和穩(wěn)定性，操作簡(jiǎn)便，可作為剪刀股生物堿含量測(cè)定的有效方法。剪刀股中生物堿具有一定的抗氧化活性。

[關(guān)鍵詞] 剪刀股;總生物堿;紫外可見(jiàn)分光光度法;酸性染料比色法;抗氧化

Determination of the Total Alkaloids of Ixeris Debilis A.Gray and Its Antioxidant Activity

WANG Wei1 SUN Xiaoli2

（1. NO.3 Hospital of Zhangjiakou， Zhangjiakou， Hebei Province， 75000 China;

2. Yi County Maternal and Child Care Hospitali， Baoding， Hebei Province， 074200 China）

Abstract： Subjective： To determine the content of total alkaloids in Ixeris Debilis A.Gray by acid dye colorimetric method and to study the antioxidant activity of total alkaloids. Method： The alkaloids were combined with the acid dye of bromothymol blue to produce the colored ion pairs. The total alkaloid content were calculated by the absorbance of the colored ion pairs， which was abstracted by Dichloromethane at the characteristic wavelength. Use Vitamin C as comparison， determine the total antioxidant capacity. Result： After color development， the maximum absorption occurred at 425 nm. The ion-pair of Berberine hydrochloride and bromothymol blue was linear in the range of 20-60 ?g/mL. The average recovery was 99.12 %， RSD=4.9 %（n=5）. When the concentration of total alkaloids was 0.05 mg/mL， the absorbance value which indicate the total reducing capacity was 0.355， Conclusion： Acid dye colorimetric method has good specificity，precision and stability， and it is easy to operate. It can be used as an effective method for the determination of total alkaloids in Ixeris Debilis A.Gray.The total alkaloids in Ixeris Debilis A.Gray had shown antioxidant activity.

Key Words： Ixeris debilis A.gray; Total alkaloid; Ultraviolet spectrophotometer; Acid dye colorimetry; Antioxidant activity

剪刀股（Ixeris debilis A.Gray）始載于《救荒本草》，別名鴨舌草、鵝公英，為菊科植物，以全草入藥。民間多用其清熱解毒，利尿消腫。馬金萍^[1]報(bào)道剪刀股醇提物對(duì)腦缺血再灌注小鼠心肌具有保護(hù)作用。蒲明秋等^[2]報(bào)道剪刀股提取物可對(duì)抗煙堿引起的致癌作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，剪刀股多糖具有一定降血糖作用^[3]，剪刀股揮發(fā)油具有抑菌作用^[4]。剪刀股總酚酸對(duì)小鼠缺血心肌具有一定保護(hù)作用^[5]。但剪刀股總生物堿尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立酸性染料比色法測(cè)定剪刀股總生物堿含量的方法，并測(cè)定其總抗氧化能力。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Alpha-1900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （?Shanghai Lab-Spectrum Instruments Co.， Ltd）;萬(wàn)分之一電子分析天平（sartoriu公司）; PHS-3C 數(shù)字酸度計(jì)（SHANGHAI DAPU INSTRUMENTS CO.， LTD）; QL-901 渦旋混合器（海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

剪刀股（河北省張家口市，經(jīng)張家口學(xué)院韓博副教授鑒定為剪刀股 Ixeris debilis A.Gray 全草）;鹽酸小檗堿對(duì)照品（南京澤朗生物科技有限公司）; 其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

將鹽酸小檗堿對(duì)照品干燥至恒重。精密稱取適量，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，得濃度為 0.5000mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取剪刀股粗粉 1.0 g，精密稱定，加10%鹽酸10 mL，浸泡20 min 后，超聲 30 min，放冷至室溫、過(guò)濾。濾渣加10%鹽酸10 mL，超聲 30 min，放冷至室溫、過(guò)濾。合并兩次濾液，10%鹽酸定容至 25 mL。精密量取上述溶液 5 mL，置 10 mL 容量瓶中，10%鹽酸定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液^[6]。

2.3 總生物堿的含量測(cè)定

2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液及剪刀股供試品溶液各 2.0 mL，分別依次加入p H=6.8 的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液 10.0 mL，酸性染料溴麝香草酚藍(lán)溶液 4.0 mL，二氯甲烷 5.0 mL，充分振搖，靜置分層，分出二氯甲烷層。再分別采用二氯甲烷 5.0 mL萃取2次，合并二氯甲烷萃取液，至 25 m L 量瓶中，定容。另取二氯甲烷2.0 mL平行操作進(jìn)行空白對(duì)照，對(duì)鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、剪刀股供試品溶液及空白對(duì)照溶液于200-800nm范圍進(jìn)行掃描，鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、剪刀股供試品溶液均在425 nm處有最大吸收，而空白對(duì)照溶液于425 nm處無(wú)干擾。因此以 425 nm 可為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液 1.0 mL、1.5 mL、2.0mL、2.5 mL、3.0mL于25mL容量瓶中。分別精密加入酸性染料溴麝香草酚藍(lán)溶液 2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液定容。按“2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定吸光度。以鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程：y=0.0134X-0.0078（r=0.9998），結(jié)果顯示鹽酸小檗堿在20-60 ?g/mL 的范圍內(nèi)線性良好。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液 2.0 mL，加入酸性染料酸性染料溴麝香草酚藍(lán)溶液 4.0 mL和枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液 9 mL，按“2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定，所測(cè)結(jié)果RSD=2.26 %（n=6），顯示方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取剪刀股供試品溶液 2 mL，按“2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定，每隔15 min 測(cè)定吸光度，共測(cè)定9次?？梢?jiàn) 2 h 內(nèi)所測(cè)定的結(jié)果的 RSD 為 2.33 %，可知此測(cè)定方法在2h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取剪刀股供試品溶液 2 mL，按“2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定，結(jié)果RSD=2.28 %（n=6），顯示方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱定含量已知的剪刀股樣品粉末五份，各1.0 g，加10%鹽酸50 mL，浸泡 20 min，超聲30 min，放冷至室溫、過(guò)濾，濾渣加10%鹽酸10 mL，超聲 30 min，放冷至室溫、過(guò)濾，合并兩次濾液，用10%鹽酸定容至 100 mL 量瓶中。精密量取 1 mL，精密加入 0.2000 mg/mL 的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液1 mL，用10%鹽酸定容至10 mL，搖勻，即得，按“2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”項(xiàng)下方法顯色后測(cè)定，結(jié)果表明，平均加樣回收率為99.12%，RSD=4.9%。

2.3.7 樣品含量測(cè)定

精密稱取剪刀股粗粉三份，各1.0 g，按“2.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并采用“2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇”項(xiàng)下方法進(jìn)行吸光度顯色后測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得總生物堿的含量。 結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.4 總還原能力：參照文獻(xiàn)^[7]的方法，分別吸取適量剪刀股總生物堿提取液，配制成濃度為 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的待測(cè)溶液。分別吸取1 mL待測(cè)溶液，加入 2.5 mL pH值為 6. 6的磷酸鹽緩沖溶液和 2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，搖勻。于50℃水浴中反應(yīng) 20 min后取出， 加入2. 5mL 10% 的三氯乙酸， 離心 （ 3 000 r/min） 10 m in。取上清液 2. 5 mL，加入 2 mL蒸餾水和 0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液， 混勻后室溫反應(yīng) 10 min。以維生素C為對(duì)照，在 700 nm 處測(cè)定吸光值，結(jié)果可知，在 0.01-0.05 mg/mL的范圍內(nèi)，剪刀股總生物堿的總還原能力與其質(zhì)量濃度間呈正相關(guān)。但與相同濃度的維生素C相比，剪刀股總生物堿的總還原能力略低。

3 討論

具有堿性的有機(jī)含氮化合物在酸中產(chǎn)生正離子。酸性染料的分子可發(fā)生解離，產(chǎn)生負(fù)離子。以上二者通過(guò)電荷的吸引作用結(jié)合為有色絡(luò)合物，而此絡(luò)合物可以被氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等定量提取，并在可見(jiàn)光范圍內(nèi)某個(gè)特定的波長(zhǎng)處有吸收。酸性染料比色法即通過(guò)測(cè)定此波長(zhǎng)的吸光度計(jì)算總生物堿的含量^[8]。

此方法是測(cè)定藥用植物中總生物堿含量的重要方法。目前有多種測(cè)定藥用植物中總生物堿含量的方法。此測(cè)定方法較紫外分光光度法^[9]專(zhuān)屬性強(qiáng)，同時(shí)避免了分離的操作;較高效液相色譜法^[10]簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，不需要昂貴的設(shè)備;酸堿滴定法^[11]也可以測(cè)定生物堿的含量，但酸堿滴定法需要操作者有熟練的操作技術(shù)，并且容易產(chǎn)生偶然誤差。重量法^[12]在萃取過(guò)程中容易損失產(chǎn)品，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性均較差。

本實(shí)驗(yàn)建立的酸性染料比色法，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。因此本方法較其他方法更適合于藥用植物中總生物堿的含量測(cè)定。

天然物質(zhì)的體外抗氧化作用的研究?jī)?nèi)容主要包括：2，2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）?自由基（ABTS）^[13]、超氧陰離子自由基（O₂.^-）^[14]、1，1-二苯-1-苦基苯肼自由基（DPPH）^[15]、羥基自由基（OH）^[16]清除能力及總還原能力^[7]的研究。其中總還原能力的研究可以較為全面的體現(xiàn)天然物質(zhì)的抗氧化活性。所以本研究采用測(cè)定剪刀股總生物堿的總還原力的方法研究其抗氧化活性。但是體外抗氧化活性并不能完全體現(xiàn)天然物質(zhì)作為藥物的抗氧化活性，還需要進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性研究，包括天然物質(zhì)對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力、還原型谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）^[17]的影響。對(duì)一種物質(zhì)抗氧化能力全面評(píng)價(jià)需要結(jié)合體內(nèi)外抗氧化能力綜合評(píng)定，本研究進(jìn)一步的研究重點(diǎn)放在剪刀股總生物堿的體內(nèi)抗氧化作用的研究。

對(duì)剪刀股總生物堿總還原能力作用的研究表明剪刀股總生物堿提取液具有較好的抗氧化活性。本研究結(jié)果可以為剪刀股總生物堿類(lèi)化合物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬金萍. 剪刀股醇提物對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷后心肌組織中SOD和GSH-PX含量的影響[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，?2015，29（03）：31-32+36.

[2] 蒲明秋，毛飛鵬. 蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)-剪刀股對(duì)抗煙堿引起遺傳物質(zhì)損傷的誘變效應(yīng)

[J]. 中國(guó)慢性病預(yù)防與控制，1995，15（02）：89.

[3] 孫曉麗，許麗娟. 剪刀股中多糖的提取及其對(duì)糖尿病小鼠的降糖作用研究[J].西部中醫(yī)藥，?2017，30（09）：35-38.

[4] 孫曉麗，王威.剪刀股中揮發(fā)油的穩(wěn)定性及抑菌作用研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2017，19（08）：1193-1195.

[5] 王威，許麗娟. 剪刀股總酚酸提取條件的優(yōu)化及對(duì)小鼠缺血心肌的保護(hù)作用[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，41（11）：1301-1306.

[6] 鐘南海.酸性染料比色法測(cè)定功勞木總生物堿的含量[J].廣東化工，2019，46（07）：221-222.

[7] 田文，韓璐，高原，等.刺參不定根不同溶劑萃取物的抗氧化活性研究[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2019，41（01）：18-23.

[8] 何沁嶷. 金釵石斛中生物堿積累規(guī)律及抗腫瘤活性研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[9] 范培. 紫外分光光度法測(cè)定功能性飲料中的咖啡因含量[J].化工設(shè)計(jì)通訊， 2019，45（12）：61-62.

[10] 陳婧超.石斛中生物堿分離純化及神經(jīng)保護(hù)作用研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2019.

[11] 朱桂花.改進(jìn)酸堿滴定法測(cè)定苦豆子總生物堿含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（01）：81-83.

[12] 蒲俊松. 桑葉生物堿的檢測(cè)提取及含量分析[D].重慶：西南大學(xué)，2016.

[13] Jing Zou， Yixin Huang， Lirong Zhu， et al. Multi-wavelength spectrophotometric measurement of persulfates using 2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate） （ABTS） as indicator[J]Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2019， 216： 214-220.

[14] 賀東霞. 超氧陰離子在不同溶劑中的歧化反應(yīng)及其動(dòng)力學(xué)[D].華中師范大學(xué)，2006.[15] [15] 管敬喜，廖秋眉，黃羽，等.圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性及其抗氧化性研究[J].中國(guó)釀造，2020，39（12）：69-73.

[16] 陳月英，王彥平，孫瑞琳，等.葡萄皮渣原花青素微波輔助提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].北方園藝，2016（11）：123-126.

[17] 萬(wàn)代林，李秀芳，李強(qiáng)明，等.流蘇石斛多糖抗氧化活性研究[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，43（12）：1694-1698.