孫宇寧，宋 婕，李曉娜，陳維毅，賀 瑞，楊繼忠，姚 蔚

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024；2.山西省眼科醫(yī)院 a.準分子激光室，b.角膜病科，太原 030002；3.山西醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，太原 030001)

圓錐角膜(Keratoconus)是一種角膜擴張性疾病，其主要特征是角膜中央變薄向前突出呈圓錐形，進而導(dǎo)致不規(guī)則散光和近視，影響視覺。圓錐角膜的發(fā)生機制尚不清楚。膠原是角膜細胞外基質(zhì)的主要成分，承擔角膜的主要抗張強度。圓錐角膜中膠原含量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，角膜生物力學(xué)性能降低[1]。膠原蛋白的合成與降解異常是圓錐角膜發(fā)生的可能機制之一。與正常角膜相比，圓錐角膜患者基質(zhì)層中膠原蛋白含量顯著降低，膠原降解相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達增加[1-2]。RNA測序和多重質(zhì)譜分析結(jié)果顯示圓錐角膜中膠原合成、成熟以及分解代謝途徑發(fā)生變化，膠原合成基因的表達降低[3-5]。

圓錐角膜通常被認為是一種非炎性疾病，但研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中促炎因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素(Interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-17、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)等均顯著高于正常人[5-9]，表明炎癥反應(yīng)參與了圓錐角膜的發(fā)生。NISHTALA et al[8]推測炎癥是圓錐角膜基質(zhì)畸形的決定性因素。炎性因子在角膜組織修復(fù)機制中發(fā)揮著重要的作用，角膜基質(zhì)細胞中炎性因子釋放增加可能導(dǎo)致基質(zhì)降解和基質(zhì)細胞凋亡[10-11]，破壞角膜組織的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，使角膜組織穩(wěn)態(tài)失衡，促進圓錐角膜發(fā)生發(fā)展。

IL-8又稱趨化因子CXCL8，可調(diào)節(jié)細胞遷移、細胞黏附以及血管生成等生理過程[12-13]。IL-8介導(dǎo)趨化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，參與角膜炎、角膜潰瘍、角膜瘢痕等多種眼部疾病的發(fā)生[14-15]。GHOSH et al[16]發(fā)現(xiàn)IL-8在圓錐角膜患者淚液中有較高含量，但其作用的分子機制還需進一步研究。

本研究通過siRNA干擾正常角膜成纖維細胞中IL-8的表達，采用實時熒光定量PCR、Western blot、ELISA、明膠酶譜等方法分析IL-8對膠原合成和降解的影響，探討IL-8調(diào)節(jié)角膜成纖維細胞膠原代謝的信號途徑，為揭示圓錐角膜的發(fā)病機制提供參考。

1 實驗材料和方法

1.1 角膜成纖維細胞的提取及培養(yǎng)

從山西省眼科醫(yī)院獲得角膜移植手術(shù)后廢棄的正常人角膜組織，經(jīng)0.5 mg/mL Ⅱ型膠原酶消化后，離心，棄上清，加入成纖維細胞培養(yǎng)基(fibroblast medium，F(xiàn)M)(含體積分數(shù)2%胎牛血清，體積分數(shù)1%成纖維細胞生長因子，體積分數(shù)1%青霉素/鏈霉素)(ScienCell，USA)，于37 ℃、CO2體積分數(shù)5%的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，當細胞融合率達到90%時進行傳代及凍存，傳代3～4次的細胞用于后續(xù)siRNA轉(zhuǎn)染。

1.2 siRNA序列的設(shè)計及細胞轉(zhuǎn)染

設(shè)計并合成針對人IL-8基因(Genbank NO.NM_000584)編碼區(qū)的3對靶向siRNA序列和對照序列(無特異性靶序列)(Gene Pharma，上海)，序列如表1所示。將提取的正常人角膜成纖維細胞以105個細胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板上，當細胞融合率達到70%～90%時，采用脂質(zhì)體(Lip-2000，Invitrogen)轉(zhuǎn)染法將siRNA導(dǎo)入角膜成纖維細胞，siRNA最終濃度為80 nmol/L.轉(zhuǎn)染后36 h收集細胞用于基因表達分析，轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞和上清，進行Western blot、ELISA、明膠酶譜等蛋白水平檢測。

表1 siRNA序列Table 1 siRNA sequences

1.3 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測基因表達

收集的細胞中加入細胞裂解液，采用EastepSuper總RNA提取試劑盒(Promega，上海)提取總RNA.以提取的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.根據(jù)GenBank中的序列，使用Primer 6.0 軟件設(shè)計引物并由上海生工生物工程公司合成，引物名稱及序列如表2所示。以合成的cDNA為模板，通過qPCR(SYBR染料法，TB GreenTMPremic Ex TaqTM Ⅱ)(Takara，大連)檢測促炎因子基因(IL-8，IL-6，IL-1β)、膠原合成基因(COL1A2，COL3A1，COL5A3，COL6A1)、膠原降解相關(guān)基因MMP-2、血管內(nèi)皮生長因子及其受體基因(VEGFA、VEGFR2)的表達，以管家基因GAPDH作為內(nèi)參，目標基因的相對表達量采用相對定量法進行分析。

表2 qPCR引物Table 2 List of Primers for qPCR

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測總膠原含量

收集轉(zhuǎn)染72 h后細胞培養(yǎng)液上清，采用BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物，南京)檢測蛋白濃度，采用ELISA法按照Human Col ELISA試劑盒(江萊生物，上海)說明書檢測細胞上清中的總膠原含量。

1.5 明膠酶譜檢測MMP-2活性

細胞培養(yǎng)液上清蛋白定量后通過含體積分數(shù)5%明膠的SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)(體積分數(shù)10%)電泳分離，將凝膠轉(zhuǎn)移至體積分數(shù)2.5% Triton-X 100溶液中，震蕩洗滌3次，加入蛋白孵育液(50 mmol/L CaCl2，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris)37 ℃孵育16 h，凝膠置于考馬斯亮藍R250染色液中染色30 min后換至脫色液(體積分數(shù)40%甲醇，體積分數(shù)7.5%冰醋酸)中進行脫色，直至出現(xiàn)透明條帶。用Image J 1.8.0軟件進行灰度值分析。

1.6 Western blot檢測蛋白的表達

收集的細胞加入RIPA裂解液(Solarbio，北京)冰上裂解1 h后離心，收集上清，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將定量的蛋白(50 ng)加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，進行Western blot分析。樣本經(jīng)體積分數(shù)10% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國)，質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，洗膜。分別加入鼠抗人IL-8抗體(1∶500)、AKT抗體(1∶500)、ERK1/2抗體(1∶500)、β-Actin抗體(1∶500)(Servicebio，武漢)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min，加入與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗(1∶5 000)(Servicebio，武漢)室溫孵育1 h，使用ECL檢測試劑壓片曝光，以β-Actin作為內(nèi)參，用Image J 1.8.0軟件以相對灰度值進行定量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±SD表示，使用Origin Pro 9.1作圖，使用SPSS 17.0軟件單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05表明樣本間有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 IL-8 siRNA干擾效率

針對人IL-8基因(Genbank NO. NM_000584)編碼區(qū)設(shè)計3對特異性靶向siRNA序列，分別轉(zhuǎn)染人角膜成纖維細胞，通過分析干擾后IL-8基因的表達檢測siRNA干擾效率。結(jié)果顯示(圖1(a))，與對照組(無特異性靶序列)相比，轉(zhuǎn)染IL-8特異性siRNA序列后角膜成纖維細胞中IL-8基因的表達均被顯著抑制，其中si-IL8-1片段的干擾效率最高(98.9%，P<0.05).進一步利用Western blot檢測si-IL8-1片段干擾后IL-8蛋白的表達變化(如圖1(b)所示)，結(jié)果顯示，si-IL8-1片段轉(zhuǎn)染后IL-8的蛋白表達量顯著下降，約為對照組的69%(P<0.05).因此后續(xù)實驗使用si-IL8-1片段干擾人角膜成纖維細胞中的IL-8的表達。

2.2 IL-8對人角膜成纖維細胞膠原合成基因表達及膠原含量的影響

采用qPCR法檢測干擾IL-8后，角膜成纖維細胞中膠原合成基因COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1的表達，結(jié)果如圖2(a)所示，干擾IL-8后COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1基因的表達均顯著上升，分別為對照組的2.27，1.64，2.57，2.94，1.21倍(P<0.05).進一步采用ELISA法檢測干擾IL-8對角膜成纖維細胞外總膠原含量的影響，結(jié)果如圖2(b)所示，IL-8 siRNA轉(zhuǎn)染組總膠原的含量為對照組的9.2倍(P<0.05).降低角膜成纖維細胞中IL-8基因的表達能夠顯著提高總膠原的含量。

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖2 沉默IL-8對角膜成纖維細胞膠原合成基因表達(a)和膠原含量(b)的影響Fig.2 Effect of IL-8 silence on collagen synthesis gene expression (a) and collagen content (b) in corneal fibroblasts

2.3 IL-8對人角膜成纖維細胞MMP-2基因表達及活性的影響

與對照組相比，干擾IL-8后角膜成纖維細胞中明膠酶基因MMP-2的表達顯著下降(圖3(a)，下降43%，P<0.05).在此基礎(chǔ)上，通過明膠酶譜分析MMP-2的活性變化，結(jié)果如圖3(b)，與對照組相比，IL-8干擾后MMP-2的活性下降20%(P<0.05).

2.4 IL-8對下游信號途徑表達的影響

如圖4(a)所示，干擾IL-8后角膜成纖維細胞中VEGF-A(VEGFA)及其受體VEGFR2基因表達降低(P<0.05)，進一步采用Western blot法檢測VEGFR2下游AKT與ERK1/2信號途徑的變化，結(jié)果如圖4(b)所示，與對照組相比，干擾IL-8后角膜成纖維細胞中AKT和ERK1/2蛋白的表達均顯著下降(P<0.05).

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖3 IL-8對角膜成纖維細胞MMP-2基因表達(a)及蛋白活性(b)的影響Fig.3 Effect of IL-8 on MMP-2 gene expression (a) and protein activity (b) in corneal fibroblasts

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖4 干擾IL-8對下游信號途徑的影響Fig.4 Effect of IL-8 interference on downstream signaling pathways

2.5 IL-8對其他促炎因子表達的影響

通過qPCR法檢測干擾IL-8后，角膜成纖維細胞中促炎因子基因IL-1β、IL-6的表達變化，結(jié)果如圖5顯示，IL-1β、IL-6的表達均顯著降低，與對照組相比，IL-8干擾組中IL-1β、IL-6基因的相對表達量分別下降為93%，50%(P<0.05).

*代表與對照組有顯著性差異，P<0.05圖5 IL-8對角膜成纖維細胞促炎因子基因表達的影響Fig.5 Effect of IL-8 on the gene expression of other inflammatory factors in corneal fibroblasts

3 討論

盡管圓錐角膜被認為是一種非炎性疾病，但越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中促炎因子含量顯著升高[5-9,17]。ELISA檢測結(jié)果顯示圓錐角膜患者角膜細胞和淚液中IL-6、IL-8的含量較高[18]；LOH et al[19]采用細胞因子抗體芯片對圓錐角膜樣本進行分析發(fā)現(xiàn)：IL-1等炎性因子在圓錐角膜中含量顯著升高，炎癥相關(guān)信號途徑被激活，圓錐角膜可能是一種慢性炎癥性角膜疾病。作為一種重要的促炎因子，IL-8在圓錐角膜中的作用尚不明確。

圓錐角膜中膠原的形態(tài)和排列發(fā)生改變，膠原蛋白的合成和降解失衡，進而導(dǎo)致角膜生物力學(xué)性能下降，抗變形能力降低。COLs、MMPs等與膠原代謝相關(guān)的基因是圓錐角膜可能的易感基因[20]。圓錐角膜中膠原合成基因COL1、COL5A2、COL6A1的表達降低[5]。對圓錐角膜組織進行質(zhì)譜、免疫組化等分析發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型膠原蛋白含量顯著減少[2，21]。本研究通過siRNA干擾角膜成纖維細胞中IL-8的表達，探討IL-8在角膜成纖維細胞膠原代謝過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾IL-8的表達能夠誘導(dǎo)角膜成纖維細胞中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型膠原合成基因COL1A2、COL3A1、COL5A3、COL6A1的表達，總膠原含量升高，表明IL-8負調(diào)控角膜成纖維細胞中膠原的合成。MMP-2參與膠原蛋白的降解，在圓錐角膜中具有較高的表達[1，11]。本研究結(jié)果顯示，降低IL-8的表達后角膜成纖維細胞中MMP-2基因的表達及酶活性均降低，表明IL-8參與角膜成纖維細胞中MMP-2介導(dǎo)的膠原降解過程。

研究表明，在口腔角質(zhì)形成細胞中IL-1β、IL-6與IL-8共表達[22]。IL-1β、IL-6等炎癥因子可以促進角膜成纖維細胞中MMPs的表達[23-25]。本研究結(jié)果顯示，干擾IL-8可顯著降低IL-1β、IL-6兩種促炎因子表達，推測IL-8可通過調(diào)節(jié)其他促炎因子的表達調(diào)節(jié)角膜成纖維細胞中膠原的合成和降解。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可以激活其同源酪氨酸激酶受體VEGFR2從而促進細胞的增殖、存活和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，IL-8通過激活PI3K/AKT通路促進結(jié)腸癌細胞增殖和遷移[26]。同時，IL-8也可以通過作用于其受體CXCR2來上調(diào)內(nèi)皮細胞中的VEGF的基因和蛋白水平，并導(dǎo)致VEGFR2的自分泌激活[27]。VEGF可以影響內(nèi)皮細胞中細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎性反應(yīng)密切相關(guān)的ERK1/2信號通路[28]；此外，VEGF通過PI3K/AKT信號通路促進胎盤間充質(zhì)干細胞的增殖和生長[29]；SONG et al[30]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路參與腎臟組織中Ⅰ型膠原的表達調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，干擾角膜成纖維細胞中IL-8的表達后，VEGFA及其受體VEGFR2的基因表達降低，其下游途徑關(guān)鍵蛋白AKT、ERK1/2的表達均顯著下降。表明IL-8調(diào)節(jié)角膜成纖維細胞中VEGF的表達，并通過PI3K/AKT、ERK信號通路負調(diào)控角膜成纖維細胞中膠原的合成，參與MMP-2介導(dǎo)的膠原降解過程(圖6).

圖6 IL-8在角膜成纖維細胞中作用的信號通路Fig.6 Proposed signaling pathway of IL-8 in corneal fibroblasts

本研究探討了正常角膜成纖維細胞中IL-8對膠原代謝的作用及其分子機制，IL-8及其下游信號通路在圓錐角膜病變中的作用還需進一步研究，本研究結(jié)果可為深入揭示圓錐角膜的發(fā)病機理提供參考。