柯 野，彭陽選，李昊然，劉曜榮，梅穎詩，郭 陽

（韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

隨著國家政策對畜牧養(yǎng)殖業(yè)扶持與推廣，使得我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展，我國家禽生產(chǎn)量已躍居全球第2位，據(jù)估算，此行業(yè)每年產(chǎn)生的干羽毛量約130萬t［1］.羽毛中的粗蛋白含量高達(dá)80%，氨基酸含量則達(dá)到70%，由此可見，羽毛具有十分可觀的開發(fā)利用價值［2］.羽毛的主要成分是角蛋白，角蛋白亦被稱為硬性角蛋白，不容易被一般的蛋白酶所降解.然而，廢棄的羽毛不僅對環(huán)境有極大的危害作用，而且羽毛中的蛋白質(zhì)資源也不能得到充分有效的利用［3］.因此，越來越多的研究者關(guān)注于對羽毛的有效降解.一方面，以期實現(xiàn)羽毛中蛋白質(zhì)的高值化利用.另一方面，則希望通過經(jīng)濟環(huán)保的方式，解決廢棄羽毛對生態(tài)環(huán)境帶來的危害.據(jù)報道，在自然界中已離獲得具有降解廢棄羽毛的微生物30多種，并且在細(xì)菌、放線菌和真菌［4-6］中均有分布，如細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌屬和放線菌中鏈霉菌屬，它們主要產(chǎn)生堿性蛋白酶，可應(yīng)用于高蛋白動物飼料、原料皮的脫毛和植物含氮肥料添加劑等領(lǐng)域的開發(fā)［7］.

本文前期研究中已分離篩選獲得一株Dactinosclerus actinosclerusRM（下文簡稱RM菌株）野生型菌株，它是一株具有高效降解羽毛的細(xì)菌菌株（初測對4.0%的羽毛粉有高達(dá)64.0%的降解率）.目前未見對該菌株所屬的屬和種的分泌蛋白系統(tǒng)研究.因此，本文采用生物信息學(xué)知識和在線網(wǎng)站對RM菌株全基因組序列編碼的分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測和分析，以此可知該菌株對羽毛高效降解作用的相關(guān)酶，進(jìn)一步對該酶的基因、結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行深入的研究，更全面地為探究RM菌株降解羽毛的機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源

RM菌株是本實驗室分離篩選獲得的一株具有高效降解羽毛的優(yōu)勢菌株，由本實驗室保藏提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨10.0 g，水1 000 mL，pH自然.

1.1.3 試劑

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂糖等試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司，化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 試驗方法

1.2.1 RM菌株的培養(yǎng)

將RM菌株接種在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，180 rpm震蕩培養(yǎng)4 d后，12 000 rpm離心3 min，收集菌體備用.

1.2.2 RM菌株基因組DNA的提取

按照酵母DNA快速提取法［8］，提取RM菌株的基因組DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對其質(zhì)量進(jìn)行分析.

1.2.3 RM菌株的基因組測序

將電泳鑒定合格的RM菌株基因組DNA，送至生工生物工程（上海）股份有限公司的廣州測序部進(jìn)行全基因組測序.采用Illumina Hiseq 2500平臺對RM菌株基因組進(jìn)行高通量測序，采用高通量序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制工具FastQC（軟件版本 0.11.2）對測序的原始數(shù)據(jù)質(zhì)量可視化評估；為獲得相對準(zhǔn)確的有效數(shù)據(jù)，再利用Trimmomatic（軟件版本0.36）數(shù)據(jù)過濾工具對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切；通過基因組測序數(shù)據(jù)的拼接軟件SPAdes（軟件版本3.5.0）對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼裝，之后采用Kmer值進(jìn)行組裝，最終根據(jù)各Kmer值組裝獲得最佳的序列結(jié)果.將獲得的RM菌株基因組序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的Prokaryotic Genome Annotation Pipeline注釋系統(tǒng)對基因功能進(jìn)行預(yù)測和注釋，同時也利用NCBI Blast+將基因蛋白序列與KEGG、COG、Swissprot和NR等多個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)一步確定注釋基因的結(jié)構(gòu)與功能.

1.2.4 RM菌株分泌蛋白的確定方法

運用Bio-Edit 7.0軟件對基因和蛋白質(zhì)的序列組成、比對等進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)編碼序列的N端信號肽預(yù)測分析、篩選，通過在線程序：SignalP-4.1完成；蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測分析通過網(wǎng)站：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php完成.蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析通過網(wǎng)站：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/完成.

2 結(jié)果與分析

2.1 RM菌株的基因組測序結(jié)果

通過SPAdes對二代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼裝后，獲得RM菌株測序全長為4 013 522 bp，最長測序片段長度為79 609 bp，平均長度為12 088.92 bp，N50的長度為21 827 bp，GC含量為0.70，連續(xù)交疊群共有332個.將RM菌株基因組序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為QYCQ00000000.1.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的基因注釋系統(tǒng)分析，RM菌株基因組全長為341 632 bp，共計有3 869個蛋白質(zhì)編碼基因，再將每個CDS編碼的氨基酸序列與KEGG、COG、Swissprot和NR等數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，其中有3 820個基因序列能被同源基因注釋分類.

2.2 RM菌株蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測結(jié)果

對RM菌株全基因組預(yù)測編碼的3 869條蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果表明：所有的編碼蛋白質(zhì)中僅439條蛋白具備典型信號肽序列，占比11.35%.而3 430條蛋白均為胞內(nèi)蛋白，占比88.65%.這表明RM菌株的分泌蛋白占少數(shù)，大多數(shù)為胞內(nèi)蛋白.

2.3 含有信號肽的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基情況分析

439條具有信號肽的蛋白質(zhì)中，氨基酸殘基總數(shù)為144 145個，各種氨基酸的含量如圖1.由圖1可知，在20種氨基酸中，數(shù)量多的分別是丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和纈氨酸，摩爾比分別為13.25%、9.95%、9.50%、9.19%和7.83%，總計達(dá)到49.72%.這些氨基酸殘基都具有側(cè)鏈基團簡單、不含環(huán)狀結(jié)構(gòu)、分子量相對較小、占據(jù)空間結(jié)構(gòu)少等特點.其含量較高的原因，可能是由于占據(jù)空間結(jié)構(gòu)小，柔性相對較大，利于蛋白局部的構(gòu)象改變，便于形成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)象.

圖1 20種氨基酸在RM菌株信號肽蛋白中所含數(shù)量情況

含量較少的酪氨酸、色氨酸和組氨酸殘基，摩爾比分別為2.77%、1.28%和1.01%，總計5.06%.酪氨酸、色氨酸和組氨酸側(cè)鏈基團具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，含有較大的疏水性側(cè)鏈基團，剛性較強、占據(jù)空間大，對蛋白質(zhì)局部構(gòu)象的柔性貢獻(xiàn)小，這可能是含量較少的原因之一.

半胱氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的一種特殊氨基酸，能形成穩(wěn)定的二硫鍵，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)局部構(gòu)象的穩(wěn)定性和剛性具有重要作用，由圖1和圖2可知，RM菌株產(chǎn)生的含信號肽的蛋白質(zhì)中，不含或只含有1個半胱氨酸的蛋白共有196個，所占比例高達(dá)44.65%，即約一半含信號肽的蛋白不能形成二硫鍵.但也有6個蛋白質(zhì)中含有10個以上的半胱氨酸，這些蛋白質(zhì)可能形成多個二硫鍵.

圖2 含有信號肽的蛋白質(zhì)中的半胱氨酸數(shù)量

2.4 對含有信號肽的蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位分析

對439條含有信號肽的蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位預(yù)測可知，有321個胞外分泌蛋白質(zhì)，34個亞細(xì)胞定位不明確的蛋白質(zhì)，84個分泌型膜蛋白，在這些分泌性膜蛋白中65個蛋白有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，有7個蛋白有2個跨膜結(jié)構(gòu)域，有3個蛋白具有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，有2個蛋白有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，有1個蛋白有5個跨膜結(jié)構(gòu)域，有2個蛋白有9個跨膜結(jié)構(gòu)域，有4個蛋白有12個跨膜結(jié)構(gòu)域.結(jié)果表明含有信號肽的蛋白大多數(shù)為胞外分泌蛋白，占總數(shù)的摩爾比73.12%.

2.5 分泌蛋白的信號肽氨基酸殘基分析

2.5.1 分泌蛋白的信號肽氨基酸殘基組成

所有分泌蛋白質(zhì)的信號肽共有氨基酸殘基7 472個，平均每條信號肽含23個殘基，最長的信號肽有38個氨基酸殘基，而最短信號肽序列只含10個氨基酸殘基.信號肽的氨基酸殘基組成見圖3.由圖3可知：含量較高的氨基酸殘基為亮氨酸和丙氨酸，占摩爾比分別為21.39%和21.08%，因為信號肽主要為線性結(jié)構(gòu)，這兩種氨基酸殘基的側(cè)鏈基團簡單，可能更利于線性的信號肽形成.

圖3 分泌蛋白的信號肽序列中20種氨基酸數(shù)量的分布情況

信號肽序列中疏水性氨基酸殘基（如亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）占摩爾比為63.65%；帶正電荷的殘基（如賴氨酸、精氨酸和組氨酸）占摩爾比為9.15%；帶負(fù)電荷的殘基（如天冬氨酸和谷氨酸）共有86個，所占摩爾比分?jǐn)?shù)為1.15%.由此可見，RM菌株的信號肽殘基組成情況符合信號肽構(gòu)成的一般規(guī)律，疏水性氨基酸殘基為主，構(gòu)成主要的疏水核心區(qū)，而少量的正電荷殘基和負(fù)電荷殘基組成信號肽的N端和C端［9-11］.

2.5.2 分泌蛋白的信號肽切割位點分析

對分泌蛋白信號肽末端4個氨基酸殘基進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4.以“1”為切割位點，依次向信號肽序列的N端排序，在4位點上數(shù)量最多的氨基酸殘基是丙氨酸，共62個.在3點上含量最多的是丙氨酸，共212個.在2位點含量最多的氨基酸殘基是谷氨酰胺，共52個.在1位點上含量最多的氨基酸是丙氨酸，共266個.由此推出RM菌株的信號肽切割位點序列主要屬于X-A-X-A型，為SPI型信號肽識別位點.

圖4 分泌型蛋白的信號肽切割位點分析

2.6 胞外分泌蛋白酶的信號肽序列分析

RM菌株對羽毛的降解主要是由于分泌蛋白酶對羽毛的降解作用，在胞外分泌型蛋白中，共10個蛋白酶（6種類型），1個M36金屬肽酶類，1個C39肽酶類，1個木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶類，1個胰蛋白酶類，3個MepM肽鏈內(nèi)切酶，3個枯草桿菌蛋白酶.6類蛋白酶信號肽序列的氨基酸殘基數(shù)如圖5.由圖5可知，6類蛋白酶的信號肽中的各種氨基酸殘基的含量基本一致，如丙氨酸和亮氨酸的含量最高，天冬氨酸和色氨酸含量最低；并且其信號肽切割位點也屬于X-A-X-A型.這表明RM菌株的蛋白酶中各種氨基酸含量不因蛋白酶的種類而具有差異.

圖5 6類蛋白酶信號肽中各氨基酸殘基的含量情況

3 結(jié)論

本文對具有降解羽毛的優(yōu)勢菌株RM菌株進(jìn)行了全基因組的測序，通過對該基因組編碼的蛋白分析其信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域等相關(guān)信息，得知該菌株共有439個蛋白具有信號肽序列，321個為胞外分泌蛋白，34個亞細(xì)胞定位不明確的蛋白，84個為膜蛋白.RM菌株分泌蛋白的信號肽切割位點的氨基酸殘基主要序列為于X-A-X-A型，并且以疏水性的氨基酸殘基為主，不同類型分泌蛋白酶的信號肽之間的序列差異較小.因此，通過本文的研究，了解了RM菌株分泌蛋白的情況，信號肽的氨基酸殘基組成規(guī)律，這為對RM野生型菌株的改造，人工合成能在RM菌株中分泌表達(dá)蛋白的信號肽構(gòu)建奠定了一定的基礎(chǔ)，同時為進(jìn)一步分析RM菌株對羽毛高效降解的分泌蛋白（如角蛋白酶、脂肪酶、二硫鍵還原酶等）的確定、功能作用奠定了基礎(chǔ).