左旋含羞草堿通過調(diào)控LATS1表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

李永慧 王倩林 賈笑強 劉明成

(西寧市第一醫(yī)療集團總院消化內(nèi)科, 青海 西寧 810000)

結(jié)直腸癌是消化道中常見的惡性腫瘤之一，其早期難以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率較高[1-4]。研究表明藥物治療在結(jié)直腸癌治療中發(fā)揮著重要作用，臨床上中藥常用于放化療及手術(shù)輔助治療結(jié)腸癌患者，不僅可以增強化療效果，還可減輕化療的毒副反應(yīng)，降低結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，對提高患者生存質(zhì)量具有較好療效[5-7]。因此，開發(fā)新的抗結(jié)直腸癌藥物對其臨床治療具有重要意義。左旋含羞草堿是從豆科含羞草屬植物中提取的植物氨基酸，研究報道左旋含羞草堿可以有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[8]，還可抑制頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[9]。然而左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機制尚不清楚。大腫瘤抑制基因1(large tumor suppressor gene 1，LATS1)是Hippo信號通路中的重要激酶的關(guān)鍵組分之一，其具有抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用[10]。研究報道結(jié)直腸癌組織中LATS1 mRNA低表達(dá)，抑制LATS1的表達(dá)可促進結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移[11]。此外，LATS1在食管鱗癌組織中也低表達(dá)，過表達(dá)LATS1可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時能夠促進細(xì)胞凋亡[12]。研究報道蟲草素可上調(diào)LATS1表達(dá)，通過激活Hippo信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進凋亡[13]。因此，本實驗旨在研究左旋含羞草堿是否通過調(diào)控LATS1影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(武漢益普生物科技有限公司)，左旋含羞草堿(上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)，MTT試劑盒(美國sciencell公司)，RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(江西江藍(lán)純生物試劑有限公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞處理與分組 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞SW480，分別用終濃度為100、200、400 μM的左旋含羞草堿處理，記為左旋含羞草堿低、中、高濃度組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組；將pcDNA、pcDNA-LATS1轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，記為pcDNA組、pcDNA-LATS1組；將si-NC、si-LATS1轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞后用400 μM的左旋含羞草堿處理，記為左旋含羞草堿+si-NC組、左旋含羞草堿+si-LATS1組。

1.3 MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率 收集各組細(xì)胞，按試劑盒說明操作，用酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-OD實驗組值/OD空白對照組值)×100%。

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、LATS1蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，對蛋白樣品定量，然后進行電泳，接著轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入一抗，在4 ℃條件下孵育過夜，然后加入二抗孵育2 h，再用ECL發(fā)光液顯影，成像后檢測蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH的比值作為相對表達(dá)水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，漂洗后按試劑盒說明操作，然后上流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞凋亡率。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LATS1 mRNA的表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA，合成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算。LATS1以GAPDH為內(nèi)參，LATS1上游引物序列：5′-GAAACAAATTCTTCTCGGAGTACT TC-3′，下游引物序列：5′-CTTCTGTTGTTAGTTTT CTGAAGAGC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGT TGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

2 結(jié)果

2.1 左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，左旋含羞草堿-低、中、高濃度組SW480細(xì)胞增殖抑制率升高，SW480細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)水平降低，p21表達(dá)水平升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響

2.2 左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，左旋含羞草堿低、中、高濃度組SW480細(xì)胞凋亡率升高，SW480細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響

圖2 左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響

2.3 左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中LATS1表達(dá)的影響 與對照組比較，左旋含羞草堿-低、中、高濃度組SW480細(xì)胞中LATS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 LAST1蛋白表達(dá)

表3 左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中LATS1表達(dá)的影響

2.4 LATS1過表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-LATS1組SW480細(xì)胞中LATS1表達(dá)水平升高，SW480細(xì)胞增殖抑制率升高，SW480細(xì)胞凋亡率升高，SW480細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的相對表達(dá)水平降低，p21、Bax蛋白的相對表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖4、表4。

表4 LATS1過表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖4 LATS1和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 抑制LATS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了左旋含羞草堿(400 μM)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的作用與左旋含羞草堿+si-NC組比較，左旋含羞草堿+si-LATS1組SW480細(xì)胞中LATS1表達(dá)水平降低，SW480細(xì)胞增殖抑制率降低，SW480細(xì)胞凋亡率降低，SW480細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的相對表達(dá)水平升高，而p21、Bax蛋白的相對表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 抑制LATS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的作用

圖5 LATS1和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，中醫(yī)藥治療在結(jié)直腸癌綜合治療中占有重要地位，從中藥中尋找預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的有效成分，并研究其作用機制成為當(dāng)前結(jié)直腸癌研究的熱點[14-17]。研究報道番茄堿能通過抑制HCT116細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，促進細(xì)胞凋亡[18]。苦參堿抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲，并增加細(xì)胞凋亡[19]。研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿可抑制PC-3和LNCaP前列腺癌細(xì)胞的增殖[20]，且左旋含羞草堿可誘導(dǎo)caspase-9介導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖[21]。為研究左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響，本實驗用不同濃度的左旋含羞草堿處理結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480，結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞增殖抑制率升高，SW480細(xì)胞凋亡率升高，且呈濃度依賴性。表明左旋含羞草堿可劑量依賴的抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、促進細(xì)胞凋亡。

研究報道LATS1在宮頸癌組織中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)LAST1可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[22]。LATS1可通過下調(diào)Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)的表達(dá)水平促進A549細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)G1期阻滯，降低細(xì)胞的增殖能力[23]。LMO3通過直接與LATS1相互作用并抑制Hippo信號傳導(dǎo)來促進肝細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[24]。本實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)LATS1后，SW480細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率升高，表明過表達(dá)LATS1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡。本實驗還發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿可提高LATS1的表達(dá)水平，而抑制LATS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了左旋含羞草堿對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，左旋含羞草堿可通過上調(diào)LATS1表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡。