重癥急性胰腺炎患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p與并發(fā)肺損傷的相關(guān)性*

沈琪琦 童小文 王偉 吳洪

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是急診科常見(jiàn)急腹癥，其中20%的患者為重癥AP(severe acute pancreatitis,SAP)，這類患者病情進(jìn)展快，極易發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多臟器功能衰竭，病死率較高[1]。肺是AP進(jìn)展過(guò)程中最易受到損傷的器官，研究表明，15%～60%的SAP患者伴有不同程度的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，一周內(nèi)死亡率超過(guò)60%，嚴(yán)重威脅患者生命安全[2-3]。對(duì)于SAP患者，及早診斷肺損傷的存在并進(jìn)行針對(duì)性治療可改善患者預(yù)后，提高存活率，因此尋找有效的診斷標(biāo)志物具有重要臨床意義。當(dāng)前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，外周血核苷酸等物質(zhì)在疾病中的應(yīng)用價(jià)值逐漸受到關(guān)注，微小RNA(microRNA，miRNA)是一類參與多種生理活動(dòng)的非編碼小分子RNA，其可通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等影響細(xì)胞活動(dòng)及新陳代謝等過(guò)程[4-5]。miR-21-3p、miR-22-3p是兩種在胰腺組織內(nèi)特異性表達(dá)的miRNA，其可在胰腺損傷時(shí)釋放入血，導(dǎo)致血液中含量升高，檢測(cè)其水平可為胰腺損傷及程度的評(píng)估提供一定幫助[6-8]。目前miR-21-3p、miR-22-3p水平與SAP并發(fā)肺損傷的關(guān)系較少有研究報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)SAP并發(fā)肺損傷患者各指標(biāo)差異，探討其在SAP并發(fā)肺損傷診斷、病情評(píng)估及預(yù)后中的價(jià)值，為SAP的早期治療提供參考。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年7月～2020年2月本院收治的124例SAP患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)胰腺外科學(xué)組制定的急性胰腺炎診治指南相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]，經(jīng)CT、生化檢查明確診斷；對(duì)本研究知情并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重肝腎功能疾病、心血管系統(tǒng)疾??；合并呼吸系統(tǒng)疾病者；合并自身免疫病、惡性腫瘤者；近期使用非甾體類抗炎藥物者。另選擇50例同期我院進(jìn)行體檢的健康志愿者作為對(duì)照組。患者均進(jìn)行詳細(xì)臨床檢查及生化檢查，參考《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷及治療指南(2006年版)》中ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，按照是否合并ALI分為單純SAP組(78例)、SAP合并ALI組(46例)。

1.2 方法 收集患者性別、年齡、病因、影像學(xué)檢查情況、急性生理學(xué)與慢性健康狀況Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分等資料。

1.3 標(biāo)本采集及RNA提取 各組受試者均采集晨起空腹靜脈血，保存于EDTA抗凝管內(nèi)，采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司全血RNA試劑盒(RP1101)提取RNA，采用變性膠檢測(cè)RNA質(zhì)量，采用微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄定量PCR：①逆轉(zhuǎn)錄：采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1621)合成cDNA。②PCR：引物序列miR-21-3p：sense(5′-ATCGTAGCTACTAGTACGTG-3′)，antisense(5′-GCATGCTCATGAGCATCG-3′)；miR-22-3p：sense(5′-CATTCAGCCAGTCTCCACGTGA-3′)；antisense(5′-GCTTCCAGTGATACGGCCTGT AACG-3′)；內(nèi)參U6：sense(5′-CTCGCTTCGGCAG CACA-3′)；antisense(5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′)。反應(yīng)體系：20 μL體系，TaqMan GE MASTER Mix 10 μL、產(chǎn)物1 μL、引物1 μL、補(bǔ)無(wú)RNA酶水至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s，40Cycle。以內(nèi)參U6表達(dá)量作為參照，計(jì)算ΔCt值，ΔCt=目的擴(kuò)增Ct值-內(nèi)參Ct值，以2-ΔΔCt表示為目的產(chǎn)物的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及率表示，組間比較行2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Logistic多因素回歸分析ALI發(fā)生的影響因素，繪制受試者特征工作曲線(ROC)分析指標(biāo)診斷價(jià)值，P<0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)情況 單純SAP組、SAP合并ALI組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；SAP合并ALI組高于單純SAP組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)情況

2.2 不同臨床資料分級(jí)患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)情況 不同CT分級(jí)、伴有胸水與否、APACHEⅡ評(píng)分患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CT分級(jí)為E級(jí)、合并胸水、APACHEⅡ評(píng)分≥15分患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平高于CT分級(jí)為D級(jí)、無(wú)胸水、APACHEⅡ評(píng)分<15分的患者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同臨床資料患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)情況

2.3 SAP患者并發(fā)ALI的影響因素分析 根據(jù)外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)水平，以兩者中位值分別作為截點(diǎn)值，將miR-21-3p、miR-22-3p分別分為高表達(dá)組、低表達(dá)組；以是否并發(fā)ALI(否=0，是=1)作為因變量，以患者年齡(<50歲=1，50歲=2)、性別(男性=1，女性=2)、病因類型(膽源性=1，酒精性=2，高脂血癥=3，其他類型=4)、CT分級(jí)(D=1，E=2)、胸水(無(wú)=1，有=2)、APACHEⅡ評(píng)分(<15分=1，15分=2)、外周血miR-21-3p(低表達(dá)=1，高表達(dá)=2)、miR-22-3p表達(dá)水平(低表達(dá)=1，高表達(dá)=2)等資料作為自變量進(jìn)行Logistic回歸，CT分級(jí)、胸水、外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)水平與SAP患者并發(fā)ALI相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3、4。

2.4 外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)診斷ALI發(fā)生的價(jià)值 繪制外周血miR-21-3p、miR-22-3p診斷ALI發(fā)生的ROC曲線，兩者單獨(dú)診斷的曲線下面積(AUC)為0.770、0.812，當(dāng)截點(diǎn)值為2.668、1.815時(shí)，約登指數(shù)最大，兩者聯(lián)合診斷AUC為0.869，見(jiàn)圖1、表5。

表4 SAP并發(fā)ALI的多因素分析

圖1 外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)診斷ALI的ROC曲線

表5 外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)診斷ALI發(fā)生的價(jià)值

3 討論

miRNA分子小，在血液中均勻分布，穩(wěn)定且較易被檢測(cè)，明確其水平在疾病中的變化可為疾病診斷及評(píng)估提供一定參考[11-12]。目前SAP導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生與胰酶的激活、炎癥介質(zhì)釋放等作用相關(guān)，炎癥反應(yīng)在兩者發(fā)病過(guò)程中均占據(jù)重要地位[13-15]。miR-21-3p是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因調(diào)節(jié)的miRNA，吳仕燕等[16]開(kāi)展的一項(xiàng)研究證實(shí)血清miR-21-3p水平與膿毒癥患兒急性腎損傷密切相關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)對(duì)器官產(chǎn)生影響；國(guó)外有研究表明，miR-21-3p在胰腺組織中存在高度特異性表達(dá)，在胰腺炎發(fā)生時(shí)，胰腺細(xì)胞受損，可促使細(xì)胞釋放miR-21-3p，其表達(dá)升高，而細(xì)胞狀態(tài)也可導(dǎo)致miR-21-3p主動(dòng)或被動(dòng)釋放入血液中，引起外周血miR-21-3p水平的升高[17-18]。miR-22-3p是哺乳動(dòng)物常見(jiàn)miRNA，見(jiàn)于多種細(xì)胞及組織內(nèi)，既往有研究表明，miR-22-3p等多種miRNA表達(dá)異常與炎癥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)明顯升高，且合并ALI的患者表達(dá)量更高，提示外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)量可能與胰腺炎的發(fā)生及程度相關(guān)。CT分級(jí)、APACHEⅢ均為反映SAP患者嚴(yán)重程度的指標(biāo)[20-21]。本研究探討了不同臨床資料SAP患者各指標(biāo)表達(dá)差異，結(jié)果顯示CT分級(jí)較高，APACHEⅡ評(píng)分較高，存在胸水的患者各表達(dá)量較高。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)量與胰腺炎的發(fā)生及程度密切相關(guān)。另外多因素分析結(jié)果也提示在校正其他因素后，外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平與SAP患者ALI的發(fā)生存在一定關(guān)系。Dixit等[22]開(kāi)展的一項(xiàng)動(dòng)物研究表明，在小鼠AP模型中，可檢測(cè)到miRNA-21-3p表達(dá)量的明顯升高；吳開(kāi)李等[23]開(kāi)展的一項(xiàng)臨床研究也證實(shí)AP患者外周血miRNA-21-3p表達(dá)量升高，其水平可作為診斷及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)；孫月玲等[24]證實(shí)在AP患者中也存在miR-22-3p表達(dá)量的升高，且其與SAP患者ALI并發(fā)相關(guān)。本研究在前人研究結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)SAP患者miR-21-3p、miR-22-3p表達(dá)與ALI的發(fā)生密切相關(guān)。

外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平與SAP患者嚴(yán)重程度及是否并發(fā)ALI密切相關(guān)，分析其水平或可明確SAP患者臟器衰竭情況，可幫助臨床醫(yī)師及時(shí)確定治療方案，提高治療效果。本研究繪制指標(biāo)診斷ALI發(fā)生的ROC曲線，結(jié)果顯示外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平診斷SAP并發(fā)ALI的AUC均大于0.75，提示兩者對(duì)于ALI的發(fā)生有一定診斷價(jià)值，另外兩者聯(lián)合診斷AUC更大，在臨床中可檢測(cè)兩者水平并進(jìn)行聯(lián)合診斷。目前較少有研究報(bào)道m(xù)iR-21-3p、miR-22-3p水平對(duì)SAP并發(fā)ALI的診斷價(jià)值，本研究結(jié)果可為臨床提供一定參考。本研究存在一定局限性：樣本量較少，對(duì)患者臨床資料收集不全面，在進(jìn)行多因素分析時(shí)可能存在較大偏移。

4 結(jié)論

SAP患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p與ALI并發(fā)密切相關(guān)，臨床可檢測(cè)其水平明確SAP程度及是否發(fā)生ALI等器官功能衰竭；外周血miR-21-3p、miR-22-3p明顯升高的患者需考慮ALI的發(fā)生，早期明確診斷并給予針對(duì)性干預(yù)能提高患者預(yù)后。