CRISPR技術(shù)的研究進(jìn)展和應(yīng)用

趙正偉， 馬 青， 馬麗娜， 王 錦， 王曉薇， 李穎康

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750001)

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)由Jansen R等命名[1]，其中,CRISPR-associated(Cas)基因總是位于CRISPR基因座附近，表明兩者可能具有相互作用關(guān)系.2007年，Rodolphe Barrangou等證實(shí),CRISPR-Cas廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一套抵御病毒和噬菌體入侵的獲得性免疫系統(tǒng)[2].CRISPR系統(tǒng)極具多樣性，目前可分成2大類,即干擾效應(yīng)物由多亞基蛋白復(fù)合物組成;干擾效應(yīng)物依賴單個(gè)蛋白質(zhì)[3].根據(jù)特征基因的不同，CRISPR系統(tǒng)又可細(xì)分(圖1a)：Ⅰ型系統(tǒng)的特征蛋白是Cas3，它是一種具有核酸酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；在Ⅱ型系統(tǒng)中，特征Cas9基因編碼干擾所必需的唯一蛋白質(zhì)；Ⅲ型系統(tǒng)以Cas10為特征蛋白，且Cas10組裝成類似Cascade的干擾復(fù)合體；Ⅳ型系統(tǒng)具有Csf1蛋白質(zhì)，它是一種未被鑒定的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是Cascade復(fù)合物的一部分[4]；Ⅴ型系統(tǒng)的特征蛋白為Cas9單核酸酶,即Cpf1，C2c1或C2c3[5]；Ⅵ型系統(tǒng)的特征蛋白為C2c2，它是含有2個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域的RNase蛋白[5].Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型系統(tǒng)基于其多亞基效應(yīng)復(fù)合物發(fā)揮功能，而Ⅱ，Ⅴ，Ⅵ型系統(tǒng)基于單個(gè)效應(yīng)蛋白發(fā)揮功能.圖1a展示了以上6種類型的代表性Cas基因座[6].

圖1 CRISPR系統(tǒng)的基本分類和應(yīng)用情況

圖1中僅存在于某些細(xì)菌亞型中的Cas蛋白以虛線輪廓顯示，參與干擾的模塊為白色，參與crRNA生物發(fā)生的模塊為黑色，參與適應(yīng)性的模塊為灰色.TypeⅠ中的Cas6同時(shí)參與干擾和crRNA生物發(fā)生.Ⅳ型系統(tǒng)在沒有CRISPR基因座的情況下頻繁發(fā)生.

由于CRISPR-Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，目前它的研究和應(yīng)用最為廣泛.首次發(fā)現(xiàn)Cas蛋白可以通過短的RNA引導(dǎo)切割特定的DNA序列后不久[7]，Doudna和張鋒證實(shí)CRISPR介導(dǎo)的基因組修飾可應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞[8—9].目前，CRISPR技術(shù)作為新興的基因編輯工具，與ZFN(鋅指核酸酶)和TALEN(轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶)技術(shù)一同引領(lǐng)基因工程的新時(shí)代[10—12].CRISPR技術(shù)在基因編輯上的應(yīng)用大致可分為基因插入[13]、基因敲除[14]、基因定點(diǎn)突變[15]、靶向定位[16]、基因表達(dá)調(diào)控[17]、基因表觀修飾[18]、基因融合[19]等(圖1b).在最近的研究中，CRISPR還被應(yīng)用于選擇性消除單條染色體[20]和產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[21].CRISPR技術(shù)不但在實(shí)驗(yàn)室基因編輯過程中發(fā)揮了重要作用，更在日常飲食、醫(yī)療等方面中扮演了越來越重要的角色.筆者綜述CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧及高通量篩選等領(lǐng)域的最新進(jìn)展和應(yīng)用情況，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望.

1 CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

基因治療是從基因水平上治療某些疾病的技術(shù).基于DNA或RNA的遺傳操縱原理，可將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞治療和預(yù)防人類疾病.與傳統(tǒng)治療相比，基因治療有針對(duì)性強(qiáng)、效果顯著、患者無痛苦等優(yōu)勢(shì).但也存在安全隱患，面臨著穩(wěn)定性差、效率低、操作復(fù)雜的缺陷.CRISPR作為高效、簡(jiǎn)便、靶向性強(qiáng)的新興基因編輯工具，對(duì)于解決基因治療的缺陷問題將發(fā)揮重要的作用.目前，CRISPR技術(shù)在基因治療領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用，并在病毒性疾病、基因突變性疾病、建立疾病模型、疾病新療法開發(fā)和疾病檢測(cè)等方面取得了重大進(jìn)展(表1).

表1 CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1 治療病毒性疾病

CRISPR作為細(xì)菌抵御病毒和噬菌體入侵的免疫系統(tǒng)，可以特異性切割外源基因，目前用于病毒感染類疾病治療的研究,具體可從靶向切割病毒基因和編輯人體基因組2方面入手：靶向切割病毒基因是在確定病毒的保守序列后，針對(duì)其設(shè)計(jì)gRNA，從而達(dá)到清除病毒的目的；編輯人體基因組,則是基于人體細(xì)胞自身特性，賦予被編輯的細(xì)胞特定性狀，或者用于激活免疫系統(tǒng)，以此作為治療手段.雖然CRISPR技術(shù)治療病毒性疾病應(yīng)用于臨床還有一定的距離，但是其潛力不容忽視.

2017年， Xu L等通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)在造血干細(xì)胞移植中靶向切割人CCR5基因[22].將CCR5敲除處理的人HSPC(hematopoietic stem/progenitor cells)重建人免疫系統(tǒng)移植到高度免疫缺陷小鼠后，賦予了小鼠抗1型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)感染的能力.2018年， Ophinni Y等通過CRISPR-Cas9設(shè)計(jì)6種gRNA[23]，其中3種靶向切割HIV-1調(diào)節(jié)基因Tat,Rev，通過抑制Tat,Rev蛋白的表達(dá)，成功減少持續(xù)和潛伏感染的CD4+T細(xì)胞系中HIV病毒衣殼的產(chǎn)生，可為艾滋病的治療提供新方法.

高風(fēng)險(xiǎn)人乳頭瘤病毒致癌基因(E6，E7)的失調(diào)表達(dá)是宮頸癌發(fā)病和惡化的關(guān)鍵因素.2014年，Zhen S等通過CRISPR-Cas9靶向E6，E7基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)[24]，導(dǎo)致P53，P21蛋白的積累，從而顯著降低宮頸癌細(xì)胞的體外增殖能力，證明CRISPR技術(shù)可以作為宮頸癌和其他HPV相關(guān)癌癥治療的新策略.

1.2 治療基因突變遺傳病

作為一種多用途的基因組編輯工具，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，如可通過基因定點(diǎn)突變、異?；虬邢蚯贸确绞綉?yīng)用于基因突變遺傳病的治療[25].其中,單基因突變疾病的治療研究最為成熟，相信很快可應(yīng)用于臨床.

鐮刀型貧血癥是一種基因單位點(diǎn)突變疾病，很多科學(xué)家已經(jīng)嘗試應(yīng)用CRISPR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行治療[26—28].2017年12月，CRISPR Therapeutics公司請(qǐng)求歐洲監(jiān)管部門允許其開展針對(duì)鐮狀細(xì)胞病和β地中海貧血患者的研究性CRISPR治療方法(CTX001)的臨床試驗(yàn).

Tmc1基因顯性突變會(huì)引起人和小鼠漸進(jìn)性聽力喪失.2018年，Gao X等通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)使產(chǎn)生突變的Tmc1基因失活[29]，從而改善了小鼠模型中的聽力喪失情況.

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種成人發(fā)病的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者全身進(jìn)行性肌肉無力和萎縮，一般發(fā)病3～5 a內(nèi)癱瘓并死亡，目前還沒有治愈的方法.SOD1基因的突變常被用于模擬ALS神經(jīng)變性疾病.2017年， Gaj T等通過CRISPR-Cas9破壞患有肌萎縮側(cè)索硬化癥的G93A-SOD1小鼠模型中SOD1的表達(dá)[30]，與對(duì)照動(dòng)物相比，疾病發(fā)作延遲37%，存活率增加25%.

1.3 建立疾病模型

構(gòu)建疾病模型對(duì)致病機(jī)理和治療方法的研究有重要意義.疾病狀態(tài)常由單個(gè)或多個(gè)基因突變導(dǎo)致，在確定導(dǎo)致疾病性狀的具體基因和基因突變類型后，研究者可依照所需性狀對(duì)特定基因進(jìn)行編輯，以此模擬疾病性狀.CRISPR技術(shù)具有簡(jiǎn)便、可遺傳和高度穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，是疾病模型構(gòu)建領(lǐng)域的有效工具.

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy, DMD)是由編碼抗肌萎縮蛋白的Dmd基因突變引起的X連鎖致死性肌肉疾病.2014年，Nakamura K等通過CRISPR-Cas9同時(shí)靶向敲除大鼠Dmd基因中的2個(gè)外顯子[31]，結(jié)果表明,F0代大鼠中出現(xiàn)抗肌萎縮蛋白表達(dá)缺失的性狀;Dmd突變的大鼠表現(xiàn)出肌肉力量下降，骨骼肌、心臟和膈肌中退行性/再生性的表型;F1代雄性大鼠的骨骼肌具有相似的表型,證明這些突變可被下一代遺傳.從而成功構(gòu)建了杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的疾病模型.

2017年，Jarno Drost等通過CRISPR-Cas9探索癌癥相關(guān)突變信號(hào)的來源[32]，發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1缺陷的類器官中突變積累是由復(fù)制錯(cuò)誤驅(qū)動(dòng)的，并通過敲除離體器官中的NTHL1基因模擬了在錯(cuò)配修復(fù)缺陷的結(jié)腸直腸癌中觀察到的突變譜.

1.4 開發(fā)疾病新療法

隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和融合，CRISPR技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于多種新型治療方法的研究，如與免疫治療相結(jié)合、改變基因表觀修飾、尋找藥物新靶點(diǎn)等.大量的研究成果讓我們感受到CRISPR技術(shù)在藥物研發(fā)和疾病治療中無限潛能，更讓我們對(duì)攻克長(zhǎng)期危害人類健康的疑難雜癥充滿信心.

2018年，Kim M Y等在《Cell》上發(fā)表了一種能結(jié)合CRISPR技術(shù)和CAR-T細(xì)胞療法(chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy)治療急性髓性白血病的新方法[33]，即通過CRISPR技術(shù)敲除CD33基因，產(chǎn)生白血病特異性抗原，從而賦予CAR-T細(xì)胞靶向治療急性髓性白血病的能力.

2018年，Liu X S等首次通過自主研發(fā)的一種移除甲基化的改進(jìn)型CRISPR-Cas9系統(tǒng)[18]，恢復(fù)受脆性X染色體綜合征影響的神經(jīng)元中FMR1基因的活性，表明該方法可用于治療由異常甲基化引起的疾病.

2018年，Barbieri I等構(gòu)建了多種小鼠白血病細(xì)胞模型[34]，用于系統(tǒng)性地測(cè)試每個(gè)可能相關(guān)的基因，從而發(fā)現(xiàn)哪些基因是AML細(xì)胞存活所必需的，最終通過CRISPR-Cas9鑒定出AML白血病的藥物新靶標(biāo)METTL3.

1.5 檢測(cè)病毒性疾病

CRISPR家族中的一些成員(Cas12，Cas13)可以靶向切割單鏈DNA或RNA，研究人員應(yīng)用這種特性開發(fā)出一系列核酸檢測(cè)新方法.這些核酸檢測(cè)方法可應(yīng)用于病毒檢測(cè)等領(lǐng)域，也為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)提供更多選擇.

2017年，張鋒等開發(fā)一種基于CRISPR-Cas13的快速、廉價(jià)且高度靈敏的診斷工具SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing)[35—36]，可用于檢測(cè)RNA或DNA的單分子.出于增強(qiáng)實(shí)用性目的，他們又開發(fā)出一種微型試紙條測(cè)試方法，該方法使肉眼觀察測(cè)試結(jié)果成為可能，且無需使用昂貴的設(shè)備.

2018年，Doudna使用被稱作DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)的DNA檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了靈敏且準(zhǔn)確的病毒DNA檢測(cè)[37]，該方法通過在人類樣品中檢測(cè)2種致癌性的人類乳頭狀瘤病毒得到驗(yàn)證.

2 CRISPR在農(nóng)業(yè)、畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用

在國(guó)家政策的扶持、巨大的市場(chǎng)需求以及相關(guān)研究不斷取得進(jìn)展的背景下，CRISPR技術(shù)在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方向迎來了新的機(jī)遇.與傳統(tǒng)技術(shù)相比，CRISPR擴(kuò)展了農(nóng)業(yè)育種工具庫(kù)，可以更快、更精準(zhǔn)地培育出農(nóng)作物新性狀，并極大地縮短育種的時(shí)間.同時(shí)，使用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)農(nóng)作物基因進(jìn)行編輯，不涉及外源DNA引入,且經(jīng)USDA(united states department of agriculture)認(rèn)定不在轉(zhuǎn)基因監(jiān)管范圍之內(nèi)，沒有食品安全方面的風(fēng)險(xiǎn).因此，未來CRISPR技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域更多的突破和發(fā)展值得期待.

2.1 農(nóng)作物的遺傳改良

隨著人口的增長(zhǎng)，糧食危機(jī)成為不得不面對(duì)的問題.CRISPR基因編輯技術(shù)已經(jīng)在優(yōu)化農(nóng)作物產(chǎn)量、抗病性、口味等性狀上取得了一定突破，已成為未來農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域的一大助力.

2.1.1提高作物產(chǎn)量 2017年， Zachary B L等通過CRISPR編輯番茄開花抑制因子基因SELFPRUNING5G，促進(jìn)番茄的日長(zhǎng)敏感性[38]，使番茄快速、集中開花，提高了產(chǎn)量.他們還通過CRISPR基因編輯技術(shù)成功改良西紅柿苗的分枝、花的數(shù)量以及果實(shí)的大小等性狀[39].

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(amino acid transporters, AATS)在植物發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)分配過程中起到不可或缺的作用.2018年, Lu K等通過CRISPR技術(shù)抑制氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsAAP3的表達(dá)[40]，提高了作物的氨基酸含量，并通過促進(jìn)水稻的芽生長(zhǎng)和分蘗數(shù)的增加提高了谷物產(chǎn)量.

2.1.2增強(qiáng)抗病性 植物病毒感染不僅影響作物的產(chǎn)量，更對(duì)糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅.CRISPR技術(shù)應(yīng)用于作物抗病性研究已有很多實(shí)例:2015年,Zahir A等證實(shí)CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于植物中以賦予其對(duì)DNA病毒的分子免疫[41]；2016年,Zhao K等設(shè)計(jì)的針對(duì)水稻OsERF922基因的CRISPR-Cas9 SSN(C-ERF922)[42]，改善了稻瘟病抗性；2017年，Peng A等通過CRISPR-Cas9靶向編輯柑橘關(guān)鍵抗性基因CsLOB1啟動(dòng)子[43]，大大改善了柑橘的潰瘍病抗性.

除此之外，CRISPR系統(tǒng)還可實(shí)現(xiàn)對(duì)作物抗蟲害基因的編輯和篩選，如2018年Khanal C等通過該技術(shù)編輯棉花中的腎臟線蟲抗性基因[44].

2.1.3保障育種安全性 對(duì)于食品安全問題，轉(zhuǎn)基因作物備受爭(zhēng)議，而CRISPR編輯的作物經(jīng)USDA認(rèn)定不在轉(zhuǎn)基因監(jiān)管范圍之內(nèi).2016年，Mickael M將純化的CRISPR-Cas9 核酸酶蛋白直接遞送至葡萄和蘋果的原生質(zhì)體內(nèi)[45]，實(shí)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因的靶向基因編輯.還有研究者使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)CRISPR-Cas9基因表達(dá)系統(tǒng)創(chuàng)建非轉(zhuǎn)基因的突變植物[46].這些非轉(zhuǎn)基因的育種方法為育種篩選提供了便利，同時(shí)提高了公眾的接受度，這對(duì)于商業(yè)化和大規(guī)模生產(chǎn)十分重要.

2.2 動(dòng)物育種

自2013年CRISPR-Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞研究以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物育種.

2.2.1畜禽遺傳育種 健康生活的需求使人們選擇食用更多瘦肉，因此提高家畜的瘦肉率是有意義的工作.2017年，趙建國(guó)等通過CRISPR向豬細(xì)胞內(nèi)插入U(xiǎn)CP1基因[47]，該基因負(fù)責(zé)棕色脂肪組織介導(dǎo)的產(chǎn)熱，并在防止感冒和調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用.UCP1基因的插入可減少脂肪沉積、增加瘦肉率，培育出的豬比正常豬的脂肪少24%，同時(shí)抗寒性更好.2018年， Zou Y等通過CRISPR-Cas9進(jìn)行FBXO40基因的敲除[48]，培育出的豬肌肉肥大，且沒有可檢測(cè)的病理效應(yīng).

除了改良家畜的肉質(zhì)品質(zhì)，CRISPR技術(shù)還用于提高家畜的抗病性.禽白血病病毒亞群J(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J)已給家禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失.2017年，Lee H J等通過CRISPR精確編輯雞細(xì)胞中ChNHE1受體基因的關(guān)鍵位點(diǎn)[49]，賦予了雞對(duì)ALV-J的抗性，表明該技術(shù)可以用于開發(fā)抗病品系.

2.2.2其他高價(jià)值動(dòng)物遺傳育種 CRISPR技術(shù)的應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)寵物基因靶向編輯[50]，滿足客戶的個(gè)性化需求，同時(shí)也有助于寵物疾病的治療.

基因編輯技術(shù)還可與克隆技術(shù)相結(jié)合，通過基因編輯敲除或敲入動(dòng)物的某個(gè)基因,培育出有優(yōu)良性狀的品種，再通過克隆技術(shù)大量繁殖.世界首只基因編輯克隆犬“龍龍”在中國(guó)誕生，它不僅是一只克隆犬，且其供體細(xì)胞來自于世界首例基因編輯疾病模型犬“蘋果”.因此，對(duì)于有較高價(jià)值的動(dòng)物，通過克隆技術(shù)可以擴(kuò)展基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍.

3 基于CRISPR技術(shù)的高通量篩選

明確產(chǎn)生相應(yīng)性狀的基因是基因編輯技術(shù)應(yīng)用的前提.研究人員通常使用高通量篩選技術(shù)確認(rèn)基因與性狀的聯(lián)系.結(jié)合CRIPSR-Cas9和二代測(cè)序技術(shù)的大規(guī)?；蚯贸Y選方法，能夠極大地推動(dòng)特異細(xì)胞類型及處理?xiàng)l件下篩選相關(guān)基因、藥物反應(yīng)及抗藥發(fā)生等工作，還可快速、準(zhǔn)確地找到與某種表型相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)[51].相對(duì)于傳統(tǒng)的小干擾RNA敲降篩選、常規(guī)的突變篩選，CRISPR篩選實(shí)驗(yàn)具有通量大、效率高及花費(fèi)低廉的特點(diǎn)，這些優(yōu)勢(shì)使該方法具有巨大的應(yīng)用潛力.

CRISPR-Cas9文庫(kù)高通量篩選可以分為陽性篩選與陰性篩選2種模式[52]:陽性篩選對(duì)細(xì)胞文庫(kù)施加篩選壓力，只有少數(shù)目的表型細(xì)胞能夠存活；陰性篩選中存活的細(xì)胞并不是目的表型細(xì)胞，因此需要比較不同時(shí)間點(diǎn)sgRNA的豐度，找出差異sgRNA確定關(guān)鍵基因(圖2).2種篩選方式都常需要與高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合應(yīng)用[53].

圖2 CRISPR-Cas9高通量篩選流程

CRIPSR技術(shù)應(yīng)用于高通量篩選已有許多實(shí)例，證明其具有實(shí)用性和廣泛的適用性.2014年，張鋒等利用基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)文庫(kù)[54]，鑒定癌癥和多能干細(xì)胞中細(xì)胞存活所必需的基因，并在一個(gè)黑色素瘤模型中，篩選與vemurafenib耐藥性有關(guān)的基因，觀察到獨(dú)立的引導(dǎo)RNA對(duì)同一基因的高度一致性和高命中率，證明了使用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因尺度篩選的前景.2014年， Zhou Y等通過基因敲除文庫(kù)篩選[55]，成功鑒定炭疽和白喉毒素是細(xì)胞中毒所需的宿主基因.

2018年，Pandolfi等開發(fā)了一種CRISPR激活lncRNA的篩選策略[56]，可靶向14 701種lncRNA基因.他們著重關(guān)注控制阿糖胞苷(cytarabine, Ara-C)耐藥性的遺傳學(xué)特征，通過基于CRISPR的高通量篩選方法評(píng)估哪些基因可能決定阿糖胞苷的耐藥性.CRISPR技術(shù)允許研究人員一次分析成千上萬個(gè)編碼基因和lncRNA，并可激活任意感興趣的基因.2018年，Kurata J S和Lin R J構(gòu)建了靶向1 594個(gè)(85%)已知的人類miRNA莖環(huán)的sgRNA庫(kù)[57]，并利用這個(gè)sgRNA庫(kù)篩選影響HeLa或NCI-N87細(xì)胞適應(yīng)度的miRNA.

4 展望

近年來，CRISPR技術(shù)飛速發(fā)展，在取得顯著成績(jī)的同時(shí)也不免引人擔(dān)憂.最新的研究表明，CRISPR-Cas9基因療法中發(fā)揮作用的細(xì)胞通常不攜帶功能性p53基因，如將這種基因療法改造過的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，或許會(huì)誘發(fā)癌癥[58].CRISPR技術(shù)的脫靶現(xiàn)象也是重要的安全問題，近期《Nature Biotechnology》上的一篇研究報(bào)告對(duì)CRISPR技術(shù)的安全性提出質(zhì)疑[59]，并指出需要進(jìn)行全面的基因組分析，以便在對(duì)患者給藥前鑒定具有正?；蚪M的細(xì)胞.以上是CRISPR技術(shù)發(fā)展中不得不面臨的問題，可從提高CRISPR技術(shù)安全性和技術(shù)性創(chuàng)新兩方面著手進(jìn)行改善.相信經(jīng)過科學(xué)家的不懈努力，CRISPR技術(shù)將會(huì)給我們帶來更多驚喜.

在提高CRISPR技術(shù)安全性方面，研究者開發(fā)新型Cas9核酸酶提高基因編輯安全性[60].Roth T L等利用電穿孔成功對(duì)人T細(xì)胞進(jìn)行CRISPR基因編輯且無需病毒載體[61].Carlson-Stevermer J等利用RNA aptamer分子膠組裝出一種CRISPR修復(fù)工具包并將其運(yùn)送到DNA切割位點(diǎn)上[62]，大大提高了修復(fù)精準(zhǔn)度.與傳統(tǒng)CRISPR技術(shù)相比，該方法的準(zhǔn)確率提高了10倍.

在技術(shù)創(chuàng)新方面，研究人員也在努力發(fā)現(xiàn)新的CRISPR系統(tǒng)，并通過與其他技術(shù)結(jié)合擴(kuò)展其應(yīng)用范圍.Silvana Konermann等發(fā)現(xiàn)歸類為VI-D型的靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)[63].受CRISPR系統(tǒng)參與細(xì)菌免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的啟發(fā)，Doron S等通過測(cè)試抗噬菌體活性[64]，發(fā)現(xiàn)9個(gè)新的抗噬防御系統(tǒng)家族和1個(gè)在微生物中廣泛存在的抗質(zhì)粒系統(tǒng)，并顯示出強(qiáng)烈的抗外來DNA入侵的能力.一旦它們的機(jī)制被破譯，將來可能會(huì)被改造成有用的分子工具.Hansen-Bruhn M等開發(fā)一種使用超聲推進(jìn)的方法將CRISPR-Cas9輸送進(jìn)癌細(xì)胞的納米馬達(dá)[65]，通過可逆的二硫鍵將Cas9-sgRNA復(fù)合物加載到納米馬達(dá)表面上，隨后超聲處理5 min使其穿透細(xì)胞質(zhì)膜，這對(duì)臨床治療應(yīng)用有很大價(jià)值.

毫無疑問，未來將會(huì)出現(xiàn)更多以新方式應(yīng)用CRISPR技術(shù)來提高人類生存質(zhì)量的例子.除了利用CRISPR技術(shù)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和能力，研究人員還應(yīng)該專注于將新的基因編輯工具與其他成熟技術(shù)相結(jié)合，以提供更靈活、強(qiáng)大的技術(shù)手段，從而更好地造福人類.