巨噬細胞識別釀酒酵母孢子的研究

汪 沁， 中西秀樹， 高曉冬

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

釀酒酵母是公認的有益于人類的真菌[1]，在營養(yǎng)條件充足的情況下它進行有絲分裂，此時的酵母以營養(yǎng)態(tài)細胞狀態(tài)存在。 但是，在碳源或氮源等營養(yǎng)條件匱乏的情況下， 釀酒酵母為了傳宗接代，會進行減數(shù)分裂，產(chǎn)4 個孢子包裹于子囊中[2-3]。 營養(yǎng)態(tài)酵母細胞壁有兩層，分別是內層葡聚糖層和外層的甘露糖蛋白層[4-5]。 酵母孢子壁有4 層，從內到外依次是甘露糖層、葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層[6]。 二酪氨酸層是酵母孢子壁特有的結構，其單體是由兩個甲基酪氨酸分子構成[7]。 這種特殊的孢子壁結構能幫助減數(shù)分裂后的細胞核抵御嚴酷的大自然環(huán)境，等待適宜的生長環(huán)境，從而發(fā)芽成長，再次成為營養(yǎng)細胞形態(tài)，維持酵母的繁衍[4]。

巨噬細胞屬于免疫細胞的一種，能夠吞噬和降解外源顆粒以及微生物并激活免疫反應。 巨噬細胞的吞噬過程依賴于細胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）， 該受體能夠識別微生物表面保守的分子模式 （microbe associated molecular pattern，MAMP）并且激活受體上酪氨酸基序 （immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）[8-9]。 被激活的ITAM 序列進一步招募脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）啟動巨噬細胞的吞噬過程[10-11]。 Syk 信號能夠激活諸如磷脂酶Cγ（PLCγ） 和磷脂酰肌醇 3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）等下游信號，從而增加吞噬效率[11-13]。吞噬過程中，較大顆粒（>2 μm）吞噬依賴于 PI3K的活性[14]。 巨噬細胞對微生物表面分子模式的識別是啟動直接吞噬的第一步[15]。 微生物表面的糖鏈結構的特殊性使其被巨噬細胞所識別從而引起吞噬[16-17]。

自然條件下，多數(shù)酵母處于營養(yǎng)細胞態(tài)。 營養(yǎng)態(tài)酵母壁的葡聚糖成分能夠被巨噬細胞表面葡聚糖受體識別從而引起吞噬，促進巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6 和 IL-12 的釋放[18-20]，葡聚糖也能夠與細菌結合從而抑制細菌在胃腸道增殖從而達到抑菌的作用[21]。 營養(yǎng)態(tài)酵母壁的幾丁質成分也能刺激巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α 和IL-6，并且增強巨噬細胞對假絲酵母的殺傷作用[22]。 營養(yǎng)態(tài)酵母壁上這些免疫活性物質的存在使得營養(yǎng)態(tài)酵母作為飼料添加物能夠增強牛和豬的免疫力[23-25]。

釀酒酵母雖為與人類共生的真菌，但目前其子囊孢子形態(tài)對免疫系統(tǒng)的作用很大程度上未知，酵母孢子的葡聚糖層被殼聚糖層和二酪氨酸層嚴密包裹，其免疫活性物質未知。作者以小鼠RAW264.7細胞作為巨噬細胞模型，研究了巨噬細胞識別和吞噬酵母孢子的作用機制，為后續(xù)探究野生型酵母孢子免疫作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

作者使用高效產(chǎn)孢率的AN120二倍體釀酒酵母菌株，以及dit1Δ 和chs3Δ 突變體菌株，均來自作者所在實驗室保藏菌株，相關信息見表1。

表1 本研究中所用的酵母菌株Table 1 S. cerevisiae strains used in this study

1.2 細胞及培養(yǎng)

RAW264.7 小鼠巨噬細胞， 購自中科院菌種保藏庫，用含有 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為 5% CO2，37 ℃。

1.3 培養(yǎng)基

YPAD 培養(yǎng)基：蛋白胨A 10 g，酵母提取物5 g，腺嘌呤15 mg 溶解于450 mL 去離子水中， 滅菌后加入50 mL 質量濃度為20 g/dL 的葡萄糖混勻。 固體培養(yǎng)基則加入瓊脂（Agar）10 g 一起滅菌，之后加入葡萄糖混勻，倒平板。

YPAce 培養(yǎng)基：蛋白胨A 20 g，酵母提取物10 g，腺嘌呤30 mg， 醋酸鉀10 g 溶解于1 L 去離子水中，高壓濕熱滅菌。

KAc 培養(yǎng)基：稱取20 g KAc 溶于1 L 去離子水中，固體培養(yǎng)基加入20 g 的瓊脂粉，高壓滅菌，倒平板。

1.4 主要試劑和儀器

主要試劑有：DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），昆布糖（Sigma），葡聚糖微球（Sigma），PBS（生工），胰蛋白酶（生工），蛋白酶 K（Sigma），溶菌酶（Sigma）；主要儀器有：細胞培養(yǎng)箱（Thermo），離心機（Takara），顯微鏡（日立）等。

1.5 酵母培養(yǎng)

酵母菌株于固體YPAD 平板劃線培養(yǎng)3 d 后，用粗頭牙簽接種于5 mL YPAD 液體培養(yǎng)基， 轉接于100 mL 液體YPAD 培養(yǎng)基培養(yǎng)3~5 h，使酵母處于對數(shù)生長期并且OD660為0.6~0.8， 此時收集營養(yǎng)態(tài)酵母， 用0.5% 吐溫-20 洗3 次后再用去離子水洗 3 次，3 000 r/min 離心，稱質量備用。 酵母孢子的制備： 營養(yǎng)態(tài)酵母過夜培養(yǎng)后， 取10 mL 轉接到200 mL 的YPAce 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h 后離心轉移到2% KAc 培養(yǎng)基后續(xù)培養(yǎng)2 d； 離心收集子囊酵母，當產(chǎn)孢率大于95% 時，離心收集菌體，PBS 洗2次， 加入 5 mL 原生質體溶液 （1.2 mol/L 山梨醇，0.1 mol/L PBS）和 50 μL（10 000 U/mL）溶菌酶，于25 ℃ 搖床處理3 h；原生質體溶液洗2 次，去離子水洗2 次，加入5 mL 去離子水超聲20 min（45%功率，超聲 5 s，停 2 s），用 0.5%吐溫-20 洗 3 次后再用去離子水洗3 次， 顯微鏡觀察孢子純化效果，將純化后孢子制備成100 mg/mL 的孢子懸液。

1.6 巨噬細胞培養(yǎng)和吞噬實驗

RAW264.7 小鼠巨噬細胞置于含10% 滅活牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，用含EDTA 的胰酶消化后傳代。 12 孔板每孔接種5×105個細胞，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入相同質量的營養(yǎng)態(tài)酵母或者酵母孢子， 每組設置 5 個平行，1 300 r/min 離心 3 min，使酵母落到細胞表面， 后續(xù)培養(yǎng)30 min，PBS 洗3次，胰酶消化收集細胞于離心管，4% 多聚甲醛固定10 min，PBS 洗 3 次。顯微鏡鏡檢并統(tǒng)計每 100 個巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母或孢子的個數(shù)。

1.7 藥物抑制實驗

用培養(yǎng)基將母液濃度為10 mmol/L 的Syk 抑制劑白皮杉醇稀釋為 25 μmol/L 或 50 μmol/L 的工作濃度；用培養(yǎng)基將母液質量濃度為1 mg/mL 的PI3K抑制劑渥曼青霉素稀釋為100 ng/mL 或200 ng/mL。進行抑制實驗時，細胞接種于12 孔板培養(yǎng)24 h，更換為含有白皮杉醇或渥曼青霉素的培養(yǎng)基并于37 ℃孵育30 min，加入1 mg 營養(yǎng)態(tài)酵母或1 mg 酵母孢子或200 μg 葡聚糖微球，離心并后續(xù)培養(yǎng)30 min，統(tǒng)計相對吞噬效率。

1.8 無血清吞噬實驗

營養(yǎng)態(tài)酵母或孢子與巨噬細胞共培養(yǎng)前，更換不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基或含有10% 血清的培養(yǎng)基處理2 h， 隨后更換為處理組對應的培養(yǎng)基并分別加入1 mg 的營養(yǎng)態(tài)酵母或酵母孢子，1 300 r/min 離心 2 min 后共培養(yǎng) 30 min， 統(tǒng)計吞噬效率。

1.9 高鹽以及蛋白酶處理對孢子吞噬效率的影響

野生型酵母孢子經(jīng)高鹽 （0.6 mol/L NaCl 或1 mol/L PBS）洗滌后，去離子水洗3 次，離心稱質量。 蛋白酶處理野生型酵母孢子時，取野生型酵母孢子100 mg， 按照以下反應進行：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），5 mmol/L CaCl2，加入 200 μL 蛋白酶K （600 U/mL）， 于 37 ℃ 處理 1 h， 之后用 0.5%吐溫-20 洗滌 3 次，去離子水洗滌 3 次，超聲 30 s，制備成100 mg/mL 的孢子懸液。 比較處理組與未處理組吞噬效率。

1.10 單糖或者多糖抑制實驗

用培養(yǎng)基配制終質量濃度為1 mg/mL 的昆布糖培養(yǎng)液以及5 mg/mL 的甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及鹽藻糖培養(yǎng)液，取1 mL 上述含糖培養(yǎng)液和細胞共孵育30 min 之后， 加入1 mg 的營養(yǎng)態(tài)酵母或1 mg 酵母孢子或200 μg 葡聚糖微球，離心后進行吞噬實驗并且統(tǒng)計相對吞噬效率。

1.11 野生型孢子和突變體孢子吞噬實驗

取 1 mg 的野生型酵母孢子、dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子，按照1.6 方法進行吞噬實驗。

1.12 統(tǒng)計分析

采用Graphprism 軟件對數(shù)據(jù)進行分析作圖，所有數(shù)據(jù)以平均值+標準差表示。 用單因素或雙因素方差分析（One-Way or Two-Way ANOVA）檢驗組間的差異。 檢驗標準P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義，每次實驗重復5 次。 對于本實驗統(tǒng)計結果，標記如下：P≥0.05 標記為 ns；0.01＜P＜0.05 標記為 *；0.001＜P≤0.01 標記為 **；P≤0.001 標記為 ***；P≤0.000 1 標記為 ****。

2 結果與分析

2.1 巨噬細胞內吞野生型酵母孢子效率高于營養(yǎng)態(tài)酵母

營養(yǎng)態(tài)酵母壁和野生型酵母孢子壁的結構有所不同，比較巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的響應，結果見圖1（a）。 隨著營養(yǎng)態(tài)酵母或野生型酵母孢子質量濃度的增加，巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型孢子的數(shù)目呈上升趨勢。 當營養(yǎng)態(tài)酵母和孢子質量均為1 mg 時， 巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和孢子的情形見圖1（b）。 統(tǒng)計分析表明，此時每100 個巨噬細胞吞噬酵母或孢子的個數(shù)分別為35 個和320 個。 質量為1 mg 時，酵母孢子個數(shù)約為營養(yǎng)態(tài)酵母個數(shù)的3.7 倍， 此時孢子被吞噬個數(shù)約為營養(yǎng)態(tài)酵母個數(shù)的9 倍。 這表明巨噬細胞對酵母孢子內吞效率顯著高于營養(yǎng)態(tài)酵母。

圖1 巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子吞噬效率比較（± SD，n=5）Fig. 1 Phagocytosis efficiency of vegetative yeast and wild type spores（± SD，n=5）

2.2 巨噬細胞對酵母孢子的內吞是依賴于Syk 和PI3K 的吞噬過程

巨噬細胞對大顆粒微生物的內吞主要是通過巨胞飲和吞噬過程[29]。 巨胞飲指的是細胞依賴于細胞膜流動性的非特異內吞大顆粒過程[30]；吞噬過程指的是免疫細胞膜上受體介導的并且依賴于Syk途徑的內吞過程[10，31]。 已有的研究表明，巨噬細胞吞噬葡聚糖微球依賴于Syk， 通過白皮杉醇抑制Syk能夠抑制巨噬細胞對葡聚糖微球的吞噬[32]。 利用Syk 抑制劑白皮杉醇阻斷Syk 所介導的信號通路見圖2（a）。 與對照組相比，增加白皮杉醇的濃度會增強抑制巨噬細胞對葡聚糖微球、營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型孢子的吞噬作用，這表明巨噬細胞對野生型酵母孢子和酵母的內吞途徑是依賴于Syk 受體介導的吞噬過程。 有研究表明，巨噬細胞吞噬較大顆粒依賴于PI3K[33]，配制不同濃度的渥曼青霉素測定其對巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的影響。如圖2（b）所示，與對照組相比，渥曼青霉素對巨噬細胞吞噬酵母和葡聚糖微球無顯著影響；隨著渥曼青霉素質量濃度的增加，其對巨噬細胞吞噬野生型酵母孢子的抑制作用增強。 這表明盡管野生型孢子直徑小于營養(yǎng)態(tài)酵母，其吞噬途徑是極其依賴于PI3K 的過程，而營養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬過程不是顯著依賴于PI3K 的過程。 因此，巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的吞噬依賴Syk 下游不同激酶，表明巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和孢子所依賴的信號途徑不同。

圖 2 Sky 抑制劑白皮杉醇或PI3K 抑制劑渥曼青霉素對巨噬細胞內吞營養(yǎng)態(tài)酵母、野生型酵母孢子和葡聚糖微球的影響（± SD，n=5）Fig. 2 Sky inhibitor picetannol or PI3K inhibitor wortmannin effect on the phagocytosis efficiency of vegetative yeasts，wild type yeast spores and glucan microspheres（± SD，n=5）

2.3 巨噬細胞對野生型酵母孢子的吞噬不依賴于血清調理

為了探究巨噬細胞對酵母孢子識別是否依賴于血清中補體或抗體成分，檢測無血清培養(yǎng)基對吞噬野生型孢子效率的影響。 如圖3（a） 所示，每100個巨噬細胞于有、無血清情況下吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的個數(shù)分別為 42、38 和338、322，統(tǒng)計分析無顯著性差異，這表明巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母或野生型酵母孢子的吞噬不依賴于血清中補體和免疫球蛋白成分。 圖3（b）顯示，無血清條件下攝入營養(yǎng)態(tài)酵母或野生型孢子的巨噬細胞占總細胞的比率分別為18%和83%，這表明巨噬細胞對野生型孢子有更高效的內吞作用。 因此，巨噬細胞對野生型孢子的吞噬不是依賴于血清中補體和抗體調理導致的間接吞噬，這種吞噬極有可能是孢子表面存在的物質被巨噬細胞識別從而引起吞噬。

圖 3 血清對吞噬的影響（± SD，n=5）Fig. 3 Effect of serum on phagocytosis efficiency of vegetative yeast and spores（± SD，n=5）

2.4 巨噬細胞吞噬酵母孢子的配體為共價結合到孢子壁的非蛋白質成分

為了進一步探究孢子壁上何種物質作為分子配體導致野生型酵母孢子的高效吞噬，通過高鹽洗滌除去吸附在野生型酵母孢子壁上的分子，利用蛋白酶處理孢子壁并比較其吞噬效率。 如圖4 所示，處理后的酵母孢子吞噬效率與對照組吞噬效率無顯著差異，這表明野生型孢子表面被巨噬細胞識別的主要配體不是吸附于二酪氨酸層的物質，而是共價結合到二酪氨酸層的物質，并且這種分子配體物質不是蛋白質。

圖4 高鹽洗脫和蛋白酶處理對巨噬細胞吞噬野生型酵母孢子的影響（± SD，n=5）Fig. 4 Effect of high salt treatment and proteinase K treatment on the phagocytosis efficiency of wild type spores（± SD，n=5）

2.5 巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母依賴于葡聚糖配體，而酵母孢子不依賴

微生物表面的糖鏈能夠被巨噬細胞所識別，從而引起吞噬[34]。 為了探究巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子與糖鏈配體是否有關，通過一系列糖鏈作為配體競爭抑制劑。 昆布糖（直鏈的葡聚糖）能夠抑制由于酵母葡聚糖配體引起的吞噬[35-36]，因此選取昆布糖作為對照組。 從圖5 可知，昆布糖能夠顯著地抑制巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球的吞噬，但對野生型酵母孢子的吞噬無顯著影響。 圖5 表明，甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及巖藻糖對營養(yǎng)態(tài)酵母以及野生型酵母孢子的吞噬均無顯著影響。 因此巨噬細胞通過識別營養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球上葡聚糖配體介導吞噬，但野生型酵母孢子表面被巨噬細胞識別的配體不是葡聚糖或甘露聚糖等糖鏈，巨噬細胞識別營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的配體不同。

圖 5 不同糖鏈對巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的影響（± SD，n=5）Fig. 5 Effect of different sugars on the phagocytosis efficiency of vegetative yeast，wild type spores and glucan microspheres（± SD，n=5）

2.6 巨噬細胞對野生型酵母孢子的識別依賴于二酪氨酸層結構

為了探究野生型孢子表面被識別的配體，比較巨噬細胞吞噬野生型酵母孢子（AN120孢子）、dit1Δ孢子和chs3Δ 孢子的效率。dit1Δ 菌株是野生型酵母敲除二酪氨酸層合成基因DIT1后得到的菌株，因此dit1Δ 孢子無二酪氨酸層[37]。chs3Δ 菌株是野生型酵母敲除酵母孢子殼聚糖層合成基因CHS3后得到的菌株，因此chs3Δ 孢子無殼聚糖層。 由于二酪氨酸層的合成是依賴于殼聚糖層的存在， 因此chs3Δ孢子也無二酪氨酸層的存在[3]。 統(tǒng)計每100 個巨噬細胞吞噬野生型酵母孢子、dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子的個數(shù)，從圖6 可知，巨噬細胞對野生型酵母孢子的吞噬效率顯著高于dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子。 如圖 6（b）所示，酵母dit1Δ 孢子和chs3Δ 孢子與野生型酵母孢子大小相似，但巨噬細胞對野生型孢子的吞噬更為高效，這表明巨噬細胞對野生型酵母孢子的高效吞噬不是因為其直徑小于營養(yǎng)態(tài)酵母，而是因為野生型酵母孢子壁最外層二酪氨酸層的存在使其能被巨噬細胞識別，從而介導吞噬的發(fā)生。

圖 6 巨噬細胞對野生型酵母孢子、dit1Δ 和 chs3Δ 突變體孢子的吞噬（± SD，n=5）Fig. 6 Phagocytosis efficiency of wild type spores，dit1Δ spores and chs3Δ spores（± SD，n=5）

3 結 語

釀酒酵母孢子形態(tài)對免疫細胞的作用未被詳細研究，作者通過比較巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的內吞效率，發(fā)現(xiàn)野生型酵母孢子能夠更高效地被巨噬細胞內吞。 進一步研究表明：野生型酵母孢子和營養(yǎng)態(tài)酵母的內吞是依賴于Syk的受體介導的吞噬作用，但野生型酵母孢子的吞噬相對于營養(yǎng)態(tài)酵母而言極其依賴PI3K，這表明巨噬細胞吞噬野生型孢子和營養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬信號途徑也有所不同。 營養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬配體是葡聚糖，但野生型酵母孢子的吞噬不依賴于葡聚糖配體，其高效吞噬與野生型孢子壁二酪氨酸層有關。

本研究表明，巨噬細胞高效吞噬野生型酵母孢子是依賴于二酪氨酸層，對這種配體的分子研究讓我們能夠找到一種可利用的、作為載體的生物分子配體， 可將外源物質高效傳遞到巨噬細胞體內，為日后開發(fā)一種無毒、高效的靶向巨噬細胞的生物介質提供理論依據(jù)。