唐湘薇，楚丹，顏賽娜，尹艷飛，卞橋，翁波，陳斌，冉茂良

研究報(bào)告

miR-191靶向基因通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖

唐湘薇，楚丹，顏賽娜，尹艷飛，卞橋，翁波，陳斌，冉茂良

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128

睪丸支持細(xì)胞數(shù)量是影響精子生成能力的主要因素之一，microRNA (miRNA)參與調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，然而，大多數(shù)被鑒定出的miRNA對(duì)支持細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚不明確?；诒菊n題組前期高內(nèi)涵篩選結(jié)果，本文進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、蛋白免疫印跡和雙熒光素酶報(bào)告基因等方法，研究了調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)理。結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期和G2期，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率顯著降低；而抑制表達(dá)則與之相反。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證直接靶向基因3′-UTR。抑制表達(dá)基因促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期，并促進(jìn)細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡，與過(guò)表達(dá)的作用一致。共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果顯示，基因可以拮抗對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。此外，過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)基因均可顯著促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白PI3K和AKT的磷酸化水平，且基因同樣拮抗對(duì)PI3K和AKT蛋白的調(diào)控作用。本研究結(jié)果證實(shí)靶向基因，通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖且抑制其凋亡，為進(jìn)一步解析調(diào)控豬精子生成的生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)。

；基因；PI3K/AKT信號(hào)通路；增殖；豬睪丸支持細(xì)胞

睪丸支持細(xì)胞作為生精小管內(nèi)一種體細(xì)胞，不僅通過(guò)細(xì)胞間的緊密連接形成血睪屏障，為精子細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育提供物理支撐和穩(wěn)定的微環(huán)境，還分泌多種細(xì)胞因子以保障和促進(jìn)精子細(xì)胞的成熟。豬睪丸支持細(xì)胞增殖活性的高峰期在出生至1月齡與初情期前后兩個(gè)階段，隨后睪丸支持細(xì)胞增殖活性逐漸喪失，公豬性成熟后睪丸組織中支持細(xì)胞數(shù)量保持相對(duì)恒定[1]。然而，每個(gè)成熟的支持細(xì)胞僅能支撐30～50個(gè)精子細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，因此支持細(xì)胞數(shù)量與成年雄性動(dòng)物睪丸組織大小、精子密度、精子活力、生精小管中生殖細(xì)胞數(shù)量和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量息息相關(guān)[2,3]。這表明豬睪丸支持細(xì)胞的增殖活性決定著性成熟后睪丸支持細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而影響公豬整個(gè)使用年限內(nèi)的精子發(fā)育和成熟以及精液品質(zhì)。

MicroRNA (miRNA)作為一類長(zhǎng)約22 nt的非編碼RNA，通過(guò)靶向蛋白編碼基因3′-非翻譯區(qū)(3′-un-translated region, 3′-UTR)抑制其翻譯過(guò)程，從而廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)，利用RNA-seq技術(shù)已從不同發(fā)育階段的豬睪丸組織中鑒定出300余個(gè)miRNA[4～6]，且經(jīng)細(xì)胞分離后，相比于生精細(xì)胞，18個(gè)miRNA高表達(dá)于支持細(xì)胞[7]。在此基礎(chǔ)上，多個(gè)miRNA已被證實(shí)在豬睪丸支持細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。例如：[8]、[9]和[10]等調(diào)控豬睪丸支持細(xì)胞增殖；[11]、[12]和[13]等調(diào)控豬睪丸支持細(xì)胞氧化應(yīng)激水平；調(diào)控豬睪丸支持細(xì)胞自噬活性[14]。本課題組前期采用高內(nèi)涵篩選技術(shù)對(duì)60個(gè)miRNA調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行了篩選，鑒定出包括在內(nèi)的27個(gè)miRNA對(duì)豬未成熟支持細(xì)胞具有較強(qiáng)的促增殖效應(yīng)[15]，但的作用機(jī)制尚不清楚。研究表明，可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖，例如肝癌細(xì)胞[16]、食管鱗狀細(xì)胞[17]、成纖維細(xì)胞[18]等?；趍iRNA序列在物種間的高度保守性，我們推測(cè)對(duì)豬未成熟支持細(xì)胞增殖具有重要的調(diào)控作用。因此，本研究利用流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8 (cell counting kit-8)、EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real time PCR, qRT-PCR)、Western blotting和雙熒光素酶報(bào)告基因等技術(shù)解析了調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡的靶基因及信號(hào)機(jī)制，為進(jìn)一步闡明調(diào)控豬睪丸發(fā)育和精子生成的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

豬睪丸細(xì)胞系(swine testicular, ST) ATCC?CRL- 1746TM和293T工具細(xì)胞購(gòu)自上海安為生物科技有限公司，其中ST已被證實(shí)為豬未成熟支持細(xì)胞[19]，且廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究[8,15]。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)：胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)：雙抗(Penicillin-Streptomycin，美國(guó)Gibco公司)= 10∶1∶0.11，并將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)計(jì)合成模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor)序列過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)，設(shè)計(jì)合成基因siRNA (5′-GCCAACTGAAGCAGTACTT- 3′)抑制表達(dá)基因。接種細(xì)胞于6孔板，在融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入1 mL PBS (美國(guó)Gibco公司)洗滌，重復(fù)操作2次，吸棄PBS。向DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(每孔250 μL)中加入Lipofectamine 2000試劑(每孔5 μL，美國(guó)Invitrogen公司)，充分混勻成試劑①，室溫靜置5 min；再向DMEM 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(每孔250 μL)中分別加入mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC、siRNA、siRNA NC、inhibitor +siRNA、inhibitor + siRNA NC和inhibitor NC + siRNA NC (每孔5 μL，廣州銳博生物科技有限公司)，充分混勻成試劑②，室溫靜置5 min；將試劑①與試劑②混勻，靜置30 min后加入細(xì)胞液中。每組至少設(shè)置3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)染6～8 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 流式細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶(美國(guó)HyClone公司)消化并收集細(xì)胞于1.5 mL EP管，每管加入250 μL PBS重懸，將細(xì)胞懸液逐滴加入750 μL預(yù)冷乙醇中，4℃過(guò)夜保存，1000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄PBS，每管加入150 μL濃度為100 μg/mL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(長(zhǎng)沙維爾生物科技有限公司)，在4℃避光條件下染色30 min。使用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

接種細(xì)胞于96孔板，采用CCK-8(東仁化學(xué)科技(上海)有限公司)和EdU試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。CCK-8檢測(cè)方法：分別轉(zhuǎn)染24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)置于37℃、5%CO2條件下孵育1 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔細(xì)胞的吸光度值，將24 h作為對(duì)照，計(jì)算48 h的相對(duì)增殖率。EdU檢測(cè)方法：轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入100 μL EdU培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃、5%CO2條件下孵育2 h，并嚴(yán)格按照EdU試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞固定、Apollo染色和DNA染色，置于熒光顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司)下拍照，并使用Image J軟件對(duì)圖片中的所有活細(xì)胞和有絲分裂細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)

接種細(xì)胞于6孔板，采用Annexin V-FITC/PI染色法(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)：轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化并收集細(xì)胞，每管加100 μL 1× Binding Buffer (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)重懸洗滌，加入5 μL Annexin V-APC試劑孵育15 min，加5 μL PI染色液重懸細(xì)胞，置于4℃避光，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞ATP水平檢測(cè)

接種細(xì)胞于6孔板，轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加入200 μL ATP裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，靜置裂解5 min，收集細(xì)胞于1.5 mL EP管，4℃、15,000 r/min離心5 min，使用ATP試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)按照使用說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞ATP水平。

1.7 Western blotting檢測(cè)

收集細(xì)胞于1.5 mL EP管，采用RIPA lysis buffer (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)在酶標(biāo)儀上對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。每孔加10 μL煮沸的蛋白樣品于10%SDS-PAGE的分離膠和5%SDS-PAGE的濃縮膠(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)中，先60～80 V、30 min，然后調(diào)整為100～ 120 V、60 min進(jìn)行電泳，觀察溴酚藍(lán)至膠板底部即可停止。使用電流300 mA、40 min條件進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，隨后加入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液(北京索萊寶科技有限公司)，搖床室溫封閉條帶1.5 h，加入一抗于4℃孵育過(guò)夜。一抗包括：Bcl2 (1∶1000，美國(guó)Protein Tech Group公司)、BAX (1∶2000，美國(guó)Protein Tech Group公司)、Caspase-3 (1∶100，英國(guó)Abcam公司)、p-PI3K (1∶1000，phospho-Tyr458，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)、p-AKT (1∶1000，phosphoSer473，美國(guó)Affinity Biosciences公司)和β-actin (1∶2000，美國(guó)Protein Tech Group公司)。最后，加入適量二抗稀釋液，室溫?fù)u床2 h。二抗包括：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶1000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (1∶1000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。二抗洗滌后，使用ECL化學(xué)發(fā)光液(上海翊圣生物科技有限公司)與膜孵育1 min，采用保鮮膜完全包裹印跡膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光10 min，顯影沖洗。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用TRIzol試劑盒(美國(guó)Thermo公司)提取細(xì)胞總RNA，采用核酸/蛋白濃度測(cè)定儀(NanDrop ND- 2000，美國(guó)Thermo Scientific公司)檢測(cè)總RNA質(zhì)量，合格的總RNA使用PrimeScriptTMRT試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。構(gòu)建25 μL qRT-PCR反應(yīng)體系，包括12.5 μL SYBR Premix Ex(2×，日本TaKaRa公司)、1 μL上游引物、1 μL下游引物、2 μL cDNA模板和8.5 μL ddH2O。反應(yīng)體系置于IQ-5熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上采用如下程序進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；55℃～95℃溶解30 s，81個(gè)循環(huán)?；蜃鳛閮?nèi)參基因，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用2–ΔΔCt公式計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 本研究所用的引物序列

1.9 雙熒光素酶活性檢測(cè)

將合成的(brain-derived neurotrophic factor)基因3′-UTR-WT和3′-UTR-MUT序列(廣州市銳博生物科技有限公司)連接至psiCHECK2載體，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序確認(rèn)后，與mimic和mimic NC在DMEM high glucose基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下兩兩組合共轉(zhuǎn)染至293 T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，每孔加35 μL PBS、35 μL luciferase reagent (美國(guó)Promega公司)，震蕩10 min，移至96孔白色細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用多功能酶標(biāo)儀(Spectra max m5e，美國(guó)Molecular Devices公司)測(cè)定熒光值；每孔加30 μL Stop reagent (美國(guó)Promega公司)，震蕩10 min后，測(cè)定熒光值。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較以評(píng)估各組之間的差異。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，*<0.05，**<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-191促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖

為明確對(duì)豬未成熟支持細(xì)胞增殖的作用，分別轉(zhuǎn)染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC。流式細(xì)胞周期結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)后，處于G1期的細(xì)胞比例極顯著降低(<0.01)，S期和G2期的細(xì)胞比例顯著增加(< 0.05) (圖1A)，抑制表達(dá)后，處于S期和G2期的細(xì)胞比例則顯著降低(<0.05) (圖1C)。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)極顯著促進(jìn)、、和基因的表達(dá)水平(<0.01) (圖1B)，而抑制表達(dá)則顯著抑制以上基因的表達(dá)水平(<0.05) (圖1D)。以上結(jié)果表明，促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞周期進(jìn)程。

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)顯著增加、、、和基因的表達(dá)水平(< 0.05) (圖1E)，而抑制表達(dá)則顯著降低細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)(<0.05) (圖1F)。CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)極顯著提高細(xì)胞增殖能力(<0.01)，而抑制表達(dá)則極顯著降低細(xì)胞增殖能力(<0.01) (圖1G)。此外，EdU染色結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖活性(<0.05)，而抑制表達(dá)則極顯著降低細(xì)胞增殖活性(<0.01) (圖1：H和I)。

2.2 miR-191抑制豬未成熟支持細(xì)胞凋亡

為進(jìn)一步明確對(duì)豬未成熟支持細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用Annexin V-FIT/PI方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)顯著降低細(xì)胞凋亡率(<0.05) (圖2：A和B)，而抑制表達(dá)則顯著增加細(xì)胞凋亡率(<0.05) (圖2：A和D)。細(xì)胞ATP水平檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)極顯著增加細(xì)胞ATP水平(<0.01) (圖2C)，而抑制表達(dá)則顯著降低細(xì)胞ATP水平(<0.05) (圖2E)。采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)增加Bcl2蛋白表達(dá)水平而抑制BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平(圖2F)，而抑制表達(dá)則與之相反(圖2G)。綜上所述，抑制豬未成熟支持細(xì)胞凋亡。

2.3 miR-191靶向BDNF基因3′-UTR

本研究利用miRwalk、TargetScan和miRanda在線軟件預(yù)測(cè)了不同物種中的靶基因，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)保守性分析，初步篩選出基因作為候選靶基因(圖3A)。為進(jìn)一步確定與基因之間的靶向關(guān)系，本研究構(gòu)建了-WT和-MUT雙熒光素酶報(bào)告基因載體，并與mimic和mimic NC兩兩組合共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，-WT +mimic共轉(zhuǎn)染組的雙熒光素酶活性顯著低于其他3組(<0.05) (圖3B)。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)對(duì)基因mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)極顯著降低基因mRNA表達(dá)水平(<0.01)，而抑制表達(dá)極顯著增加基因mRNA表達(dá)水平(<0.01)。綜上所述，靶向基因3′-UTR并抑制其表達(dá)水平。

圖1 miR-191促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖

A：轉(zhuǎn)染mimic和mimic NC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式周期；B：轉(zhuǎn)染mimic和mimic NC，qRT-PCR檢測(cè)周期相關(guān)基因(、、和) mRNA相對(duì)表達(dá)水平；C：轉(zhuǎn)染inhibitor和inhibitor NC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式周期；D：轉(zhuǎn)染inhibitor和inhibitor NC，qRT-PCR檢測(cè)周期相關(guān)基因(、、和) mRNA相對(duì)表達(dá)水平；E：轉(zhuǎn)染mimic和mimic NC，qRT-PCR檢測(cè)增殖相關(guān)基因(、、、和) mRNA相對(duì)表達(dá)水平；F：轉(zhuǎn)染inhibitor和inhibitor NC，qRT-PCR檢測(cè)增殖相關(guān)基因(、、、和) mRNA相對(duì)表達(dá)水平；G：轉(zhuǎn)染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC，CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)；H：轉(zhuǎn)染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC，EdU試劑盒檢測(cè)增殖細(xì)胞比例；I：細(xì)胞EdU實(shí)驗(yàn)染色圖(藍(lán)色細(xì)胞為Hoechst染色，紅色細(xì)胞為EdU染色，Merge為Hoechst和EdU染色合并圖，標(biāo)尺：50 μm)。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

圖2 miR-191抑制豬未成熟支持細(xì)胞凋亡

A：轉(zhuǎn)染mimic、mimic NC、inhibitor和inhibitor NC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；B：轉(zhuǎn)染mimic和mimic NC，細(xì)胞凋亡比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C：轉(zhuǎn)染inhibitor和inhibitor NC，細(xì)胞凋亡比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D：轉(zhuǎn)染mimic和mimic NC，細(xì)胞ATP水平；E：轉(zhuǎn)染inhibitor和inhibitor NC，細(xì)胞ATP水平；F：轉(zhuǎn)染mimic和mimic NC，Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平；G：轉(zhuǎn)染inhibitor和inhibitor NC，Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2.4 BDNF基因抑制豬未成熟支持細(xì)胞增殖而促進(jìn)其凋亡

為解析基因?qū)ωi未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡的影響，針對(duì)基因序列設(shè)計(jì)了siRNA和siRNA NC，并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。結(jié)果表明，相較于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染siRNA后，處于G1期和G2期的細(xì)胞比例顯著下降(<0.05)，S期細(xì)胞比例極顯著上升(<0.01) (圖4A)，、和基因的表達(dá)水平顯著增加(<0.05) (圖4B)。此外，抑制基因的表達(dá)后，細(xì)胞增殖相關(guān)基因、、、和基因表達(dá)水平顯著增加(<0.05) (圖4C)；CCK-8和EdU檢測(cè)結(jié)果表明，抑制基因極顯著促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖(<0.01) (圖4：D，E和F)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制基因的表達(dá)可極顯著抑制細(xì)胞的凋亡率(<0.01) (圖5A)，促進(jìn)Bcl2蛋白的表達(dá)而抑制BAX和Caspase-3蛋白的表達(dá)(圖5B)，增加細(xì)胞ATP水平(圖5C)。以上結(jié)果表明，抑制表達(dá)基因促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖而抑制其凋亡，與過(guò)表達(dá)的結(jié)果一致。

圖3 miR-191靶向BDNF基因3′-UTR

A：與基因3′-UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)；B：共轉(zhuǎn)染-WT + mimic NC、-WT +mimic、-MUT + mimic NC和-MUT +mimic后，檢測(cè)雙熒光素酶活性；C：轉(zhuǎn)染mimic NC、mimic、inhibitor NC和inhibitor，qRT-PCR檢測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2.5 BDNF基因拮抗miR-191的調(diào)控作用

為進(jìn)一步明確是否通過(guò)靶向進(jìn)而調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡，本研究將inhibitor +siRNA、inhibitor + siRNA NC和inhibitor NC + siRNA NC三組共轉(zhuǎn)染于豬未成熟支持細(xì)胞。EdU和CCK-8結(jié)果表明，相較于inhibitor NC + siRNA NC對(duì)照組，inhibitor + siRNA NC組的細(xì)胞增殖活性顯著降低(<0.05)，而inhibitor +siRNA組的細(xì)胞增殖活性則極顯著升高(<0.01) (圖6：A和B)。同時(shí)，相較于inhibitor NC + siRNA NC對(duì)照組，inhibitor + siRNA NC組的細(xì)胞增殖相關(guān)基因、、、和的表達(dá)水平顯著降低(<0.05)，而inhibitor +siRNA組的、和基因表達(dá)水平顯著增加(<0.05) (圖6C)。此外，相比于inhibitor NC + siRNA NC對(duì)照組，inhibitor + siRNA NC組的Bcl2蛋白表達(dá)水平降低且BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，而inhibitor +siRNA組的Bcl2蛋白表達(dá)水平升高且BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(圖6D)。以上結(jié)果表明，抑制表達(dá)基因可以拮抗對(duì)豬未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

2.6 miR-191靶向BDNF基因3′-UTR激活PI3K/AKT信號(hào)通路

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，和基因可能作用于PI3K/AKT信號(hào)通路，因此，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)了二者對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路中p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)極顯著增加p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平(<0.01) (圖7A)，而抑制表達(dá)極顯著抑制p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平(<0.01)(圖7B)；抑制表達(dá)基因極顯著增加p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平(<0.01) (圖7C)，與過(guò)表達(dá)一致；同時(shí)，相比于inhibitor NC + siRNA NC對(duì)照組，inhibitor + siRNA NC組的p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平極顯著降低(<0.01)，而inhibitor +siRNA組的p-PI3K和p-AKT蛋白的磷酸化水平則顯著增加(<0.05) (圖7D)。以上結(jié)果表明，靶向基因通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞的增殖而抑制其凋亡。

圖4 抑制表達(dá)BDNF基因促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流式周期分布情況；B：qRT-PCR檢測(cè)周期相關(guān)基因、、和的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；C： qRT-PCR檢測(cè)增殖相關(guān)基因、、、和的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；D：CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)；E：細(xì)胞EdU實(shí)驗(yàn)染色圖(藍(lán)色細(xì)胞為Hoechst染色，紅色細(xì)胞為EdU染色，Merge為Hoechst和EdU染色合并圖，標(biāo)尺：50 μm)；F：EdU細(xì)胞染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

3 討論

支持細(xì)胞數(shù)量是影響精子生成能力的主要因素，而提高公豬的精子產(chǎn)量，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中提高豬的生產(chǎn)效率至關(guān)重要。但是，目前關(guān)于支持細(xì)胞增殖的分子機(jī)制尚不清楚[20]。研究表明，miRNA在發(fā)育過(guò)程中調(diào)控許多基因的表達(dá)，且一些特異性的miRNA參與了未成熟支持細(xì)胞增殖的調(diào)控過(guò)程，例如[15]、[10]、[8]和[13]等。然而，分析表明，現(xiàn)有的關(guān)于miRNA調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞增殖的研究，還不足以解析其潛在的分子調(diào)控機(jī)制[21]。本課題組前期采用高內(nèi)涵篩選技術(shù)鑒定出包括在內(nèi)的27個(gè)miRNA具有促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖的潛在作用，但其作用的特定分子信號(hào)途徑有待進(jìn)一步研究。目前，關(guān)于的研究主要集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如，促進(jìn)肝癌細(xì)胞[16]、食管鱗狀細(xì)胞[17]和成纖維細(xì)胞[18]等的增殖，抑制膽管癌細(xì)胞[22]、乳腺癌細(xì)胞(MCF7和ZR-75)[23]和子宮內(nèi)膜樣癌細(xì)胞[24]等的凋亡。本研究綜合采用流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8、EdU和Western blotting等方法在細(xì)胞水平明確了促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖而抑制其凋亡，表明廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，并有可能是調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞的一個(gè)特異性分子。

圖5 抑制表達(dá)BDNF基因促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞凋亡

A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同凋亡期細(xì)胞分布及細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)；B：Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平；C：細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測(cè)。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

miRNA通常靶向結(jié)合蛋白編碼基因3′-UTR以抑制其翻譯過(guò)程。本研究采用miRwalk、TargetScan和miRanda軟件預(yù)測(cè)的靶基因，并取結(jié)果的交集，再根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的保守性篩選出基因?yàn)槠錆撛诎谢颉ｋS后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)直接靶向基因3′-UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。但是，目前尚沒(méi)有豬基因商業(yè)化蛋白抗體，導(dǎo)致無(wú)法在現(xiàn)有條件下進(jìn)一步驗(yàn)證是否抑制了基因的蛋白翻譯過(guò)程。但是，在成肌細(xì)胞和海馬神經(jīng)元細(xì)胞中已證實(shí)可以靶向基因并抑制其翻譯過(guò)程[25～27]。基于與基因結(jié)合位點(diǎn)在物種間的高度保守性，因此我們推測(cè)在豬未成熟支持細(xì)胞中同樣可以抑制基因的翻譯過(guò)程。同時(shí)，本研究明確了抑制表達(dá)基因可促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的，其調(diào)控作用與過(guò)表達(dá)一致。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步設(shè)計(jì)了關(guān)于與基因的共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，結(jié)果表明基因可以拮抗對(duì)豬未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。綜上所述，本文基本確定靶向基因3′-UTR并調(diào)控了其表達(dá)。

圖6 BDNF基因拮抗miR-191對(duì)豬未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用

A：細(xì)胞EdU實(shí)驗(yàn)染色圖(藍(lán)色細(xì)胞為Hoechst染色，紅色細(xì)胞為EdU染色，Merge為Hoechst和EdU染色合并圖，標(biāo)尺：50 μm)；B：CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)；C：qRT-PCR檢測(cè)增殖相關(guān)基因、、、和的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；D：Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因Bcl2、BAX和Caspase-3蛋白表達(dá)水平。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

細(xì)胞周期是一個(gè)受多個(gè)因子調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，主要參與生物的生長(zhǎng)和發(fā)育，C作為細(xì)胞進(jìn)程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，活化后可以縮短G1期的時(shí)間，是從G1期轉(zhuǎn)化至S期必不可少的調(diào)節(jié)因子之一[28]，還可以通過(guò)活化細(xì)胞周期蛋白、和而促進(jìn)周期進(jìn)程，若抑制的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞周期的G1期向S期的轉(zhuǎn)化將受到抑制，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)基因后，支持細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的比例均顯著增加，且、、和的表達(dá)水平顯著增加。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)基因可顯著增加、、、和的表達(dá)水平。研究表明，支持細(xì)胞本身表達(dá)以上細(xì)胞增殖相關(guān)基因，且和基因可通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[30]，基因則可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程以及促進(jìn)DNA復(fù)制進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖[31]，基因則可以通過(guò)激活基因家族促進(jìn)細(xì)胞增殖[32]。此外，本研究采用CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)和基因可以調(diào)控豬睪丸支持細(xì)胞增殖。

圖7 miR-191靶向BDNF基因激活PI3K/AKT信號(hào)

A：轉(zhuǎn)染mimic和mimic NC，Western blotting檢測(cè)p-PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平及結(jié)果分析；B：轉(zhuǎn)染inhibitor和inhibitor NC，Western blotting 檢測(cè)p-PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平及結(jié)果分析；C：轉(zhuǎn)染siRNA和siRNA NC，Western blotting檢測(cè)p-PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平及結(jié)果分析；D：共轉(zhuǎn)染inhibitor NC + siRNA NC、inhibitor + siRNA NC和inhibitor +siRNA，Western blotting 檢測(cè)p-PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平及結(jié)果分析。*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

細(xì)胞凋亡是由內(nèi)源性或外源性通路引起的細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，多個(gè)基因參與到細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中，但基因在整個(gè)過(guò)程起決定性作用，細(xì)胞凋亡基因調(diào)控的方式分為促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞凋亡兩種[33]。是促細(xì)胞凋亡基因，是抑細(xì)胞凋亡基因，二者都是通過(guò)激活下游基因以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。對(duì)各種因素引起的凋亡都有抑制作用，但能與線粒體上的結(jié)合從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[34]。Caspase-3是Caspase家族中重要的一員，是一類與細(xì)胞密切相關(guān)的蛋白水解酶，通過(guò)自身活化或相互激活形成活性復(fù)合物引起瀑布式的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著最后的樞紐作用[35]。本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)基因后，豬睪丸支持細(xì)胞中Bcl2蛋白表達(dá)水平增加，而B(niǎo)AX和Capase-3蛋白表達(dá)水平降低，且細(xì)胞ATP水平顯著增加，細(xì)胞凋亡率顯著減少。

為進(jìn)一步解析靶向基因調(diào)控豬未成熟支持細(xì)胞增殖和凋亡的信號(hào)機(jī)制，本文對(duì)所有的潛在靶基因進(jìn)行了功能富集分析，預(yù)測(cè)出PI3K/AKT信號(hào)通路為潛在路徑。同時(shí)，研究表明，基因與PI3K/AKT信號(hào)通路之間具有調(diào)控關(guān)系。本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)基因均可顯著促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白PI3K和AKT的磷酸化水平，且基因同樣拮抗對(duì)PI3K和AKT蛋白的調(diào)控作用。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，740Y-P激活劑誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路激活顯著促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖，而抑制細(xì)胞凋亡[15]，且LY294002抑制劑誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路減活則顯著抑制豬未成熟支持細(xì)胞增殖而促進(jìn)其凋亡[10]。此外，甲狀腺激素、促卵泡激素和鄰苯二甲酸二丁酯等均可以通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性抑制支持細(xì)胞增殖而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[36～38]，17β-雌二醇則通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)支持細(xì)胞增殖[39]。同時(shí)，[40]、[10]和[41]等均被報(bào)道通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路活性以調(diào)控支持細(xì)胞增殖和凋亡。因此，PI3K/AKT信號(hào)通路的活性可能對(duì)于豬未成熟支持細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要作用。綜上所述，靶向基因通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞增殖而抑制其凋亡。

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MiR-191 promotes the porcine immature Sertoli cell proliferation by targeting thegene through activating the PI3K/AKT signaling pathway

Xiangwei Tang, Dan Chu, Saina Yan, Yanfei Yin, Qiao Bian, Bo Weng, Bin Chen, Maoliang Ran

The number of Sertoli cells in the testis is a major regulator on the sperm production capacity. MicroRNAs (miRNAs) participate in regulating the proliferation and apoptosis of porcine immature Sertoli cells. However, the functions and mechanisms of action of most identified miRNAs in porcine Sertoli cells remain largely unknown. In the present study, based on our previous results from an EdU-based high-content screening assay, we further studied the mechanism of action ofon the proliferation and apoptosis of porcine immature Sertoli cells through flow cytometry, Western blotting, and dual-luciferase activity analyses. The results demonstrated that overexpression ofpromoted cell cycle progression from G1phase to the S and G2phases, enhanced cell proliferation, and inhibited apoptosis in the porcine immature Sertoli cells, whereasinhibition resulted in the opposite effects. The results from a luciferase reporter assay showed thatdirectly targeted the 3′-UTR of thegene.knockdown also promoted cell cycle progression to the S phase, cell proliferation and inhibited cell apoptosis, which were consistent with the effects of theoverexpression. A co-transfection experiment showed thatknockdown abolished the effects ofinhibition. Furthermore, bothoverexpression andinhibition elevated the phosphorylation of PI3K and AKT, the key components of the PI3K/AKT signaling pathway, whereasinhibition offset the effects of theknockdown. Overall, these data indicated thatpromotes cell proliferation and inhibits apoptosis in porcine immature Sertoli cells by targeting thegene through activating the PI3K/AKT signaling pathway. This study provides a novel scientific basis for further investigation on the biological functions ofon porcine spermatogenesis.

;gene; PI3K/AKT signaling pathway; proliferation; porcine Sertoli cells

2021-04-25;

2021-06-02

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2020JJ4348)，湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2020NK2024)和湖南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位專家項(xiàng)目資助[Supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province (No. 2020JJ4348), the Key Research and Development Plan Projects of Hunan Province(No. 2020NK2024), and the Project from Porcine Industry and Technology System of Hunan Province]

唐湘薇，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：豬遺傳育種。E-mail: 993808546@qq.com

冉茂良，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：豬遺傳育種。E-mail: ranmaoliang0903@126.com

陳斌，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：豬遺傳育種。E-mail: chenbin7586@126.com

10.16288/j.yczz.21-154

2021/6/11 17:50:36

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210611.1452.002.html

(責(zé)任編委: 李明洲)