豌豆寡肽對飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性及腸道菌群調(diào)節(jié)效果評價

陳炫宏，嵇 威，董雷超，南希駿，王 猛，孫婉婷，王 賽，周泉城,*

（1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2.山東省食品快速分析技術(shù)工程實(shí)驗室，山東 淄博 255049）

高血壓（hypertension，HTN）是一種以體循環(huán)動脈血壓增高為主要特征的臨床綜合征[1]。1958—2015年間全國HTN抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，我國成年人HTN總患病率逐年升高趨勢明顯[2]。并且HTN還可引發(fā)其他并發(fā)癥，其中以腦卒中和心肌梗死最為常見，嚴(yán)重威脅著我國居民的健康[3]。隨著對HTN研究的不斷深入，已有研究證明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）與HTN的形成有重要聯(lián)系[4]，ACE的主要作用是催化血管緊張素I（angiotensin I，Ang I）轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)收縮血管作用的Ang II，從而使心肌收縮力增強(qiáng)，造成血壓升高[5]。此外，HTN還可能與腸道微生物有關(guān)[6]，多項對HTN大鼠腸道菌群的研究表明，HTN組大鼠腸道菌群的混亂度、豐富度和多樣性等與正常大鼠相比均會發(fā)生顯著變化[7-9]。

近年來，越來越多的研究表明可食用的植物源蛋白酶解液對HTN具有一定的治療效果，朱玲[10]研究發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白酶解液具有抑制ACE活性的作用，其中含有2～4 個氨基酸的寡肽效果最好，但未指明其抑制ACE的寡肽組成及與ACE的作用方式。為探明豌豆寡肽（Val-Glu-Pro-Gln，VGPG）對HTN的調(diào)節(jié)效果及作用方式，本研究在VGPG與ACE分子對接作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，對其調(diào)節(jié)HTN大鼠的血壓、血液中血脂、ACE含量以及腸道菌群相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定，分析VGPG在HTN調(diào)節(jié)過程中與ACE活性、腸道菌群之間的關(guān)系，旨在闡明VGPG對飲食引起的HTN的作用規(guī)律和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Wistar大鼠（8 周齡、體質(zhì)量（200±20）g）由濟(jì)南金豐實(shí)驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2014-0007。配套標(biāo)準(zhǔn)飼料與墊料由濟(jì)南金豐實(shí)驗動物有限公司提供。

VGPG 杭州肽佳生物科技有限公司；非洛地平緩釋片 合肥立方制藥股份有限公司；馬尿酰組胺酰亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE美國Sigma公司；食用鹽 湖北長舟鹽化有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、脂蛋白a（lipoprotein（a），Lp（a））、ACE免疫分析試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；乙酸乙酯、D-果糖 上海愛純生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZH-HX-Z型無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng) 安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；精密分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MULtiskan型酶標(biāo)儀 北京澎昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子對接

1.3.1.1 受體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

ACE蛋白結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）中獲取，PDB代碼為1O8A[11]。對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫處理，并將處理后的結(jié)構(gòu)作為分子對接的初始模型，采用AutoDockTools 1.5.6軟件進(jìn)行處理，保存蛋白原有電荷，并生成pdbqt文件用于對接。

1.3.1.2 配體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

構(gòu)建多肽分子VGPG的三維結(jié)構(gòu)，多肽N端為纈氨酸，C端為谷氨酰胺。由于實(shí)驗條件pH值為7.4，因此VGPG的N端被質(zhì)子化，采用MOPAC程序[12]優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)，計算PM3原子電荷[13]，采用AutoDock Tools 1.5.6軟件處理配體結(jié)構(gòu)，生成相應(yīng)的pdbqt文件用于后續(xù)對接。

1.3.1.3 分子對接

分子對接采用AutoDock 4.2.6軟件包[14]實(shí)現(xiàn)，設(shè)定1O8A晶體結(jié)構(gòu)中Zn2＋所在的位置為活性位點(diǎn)，將多肽VGPG對接到活性位點(diǎn)，對接盒子的中心坐標(biāo)設(shè)為（36.99，41.25，43.45），XYZ各方向的格點(diǎn)數(shù)設(shè)為80×60×60 個，格點(diǎn)間距為0.375 ?，對接次數(shù)為100 次，其余參數(shù)采用默認(rèn)值。

1.3.1.4 分子對接結(jié)果優(yōu)化

分子對接的結(jié)果在空間結(jié)構(gòu)上可能存在不合理的原子接觸，可以采用能量優(yōu)化的方法對這些作用力進(jìn)行釋放，使其更趨于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。能量優(yōu)化采用Amber14力場[15]，優(yōu)化過程分兩步進(jìn)行：先進(jìn)行5 000 步的最陡下降法優(yōu)化，再用5 000 步的共軛梯度法對結(jié)構(gòu)進(jìn)一步優(yōu)化，將最終的結(jié)果作為后續(xù)分析的模型。

1.3.2 體外ACE抑制率及酶促動力學(xué)分析

體外ACE抑制率實(shí)驗參考吳建平等[16]的方法并稍作修改，樣品采用不同純度（70%、85%、98%）、不同質(zhì)量濃度（0.85、1.7、3.4、6.8、12.8 mg/mL）的VGPG。實(shí)驗在1.5 mL的離心管中進(jìn)行，每次測定體系的總體積為0.2 mL：含50 mmol/L pH 8.3磷酸鹽緩沖液、300 mmol/L NaCl、5 mmol/L HHL、20 μL 0.2 mg/mL的樣品。在37 ℃恒溫水浴保溫5 min，然后加入酶液（0.1 U溶于1 mL相同緩沖液中）啟動反應(yīng)，恒溫保持30 min后，加入0.2 mL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，再加入1.0 mL冷凍后的乙酸乙酯，均勻混合15 s，3 500 r/min離心5 min，取出0.8 mL乙酸乙酯層轉(zhuǎn)入另一試管中，在90 ℃的烘箱中烘干1 h，再將其重新溶于0.8 mL去離子水中，在228 nm波長處測定光密度值。單位酶活力定義為在37 ℃、1 min內(nèi)催化HHL形成1 μmol馬尿酸所用酶量。抑制率按公式（1）進(jìn)行計算。

式中：OD1為不存在抑制劑時的光密度值；OD2為抑制劑與酶共同存在時的光密度值；OD0為抑制劑與酶都不存在時的光密度值。

酶促動力學(xué)實(shí)驗參考Chen Jiali等[17]的實(shí)驗方法并稍作修改，固定ACE質(zhì)量濃度（0.5 mg/mL）不變，分別以不同濃度（0.81、1.62、2.44、3.24、6.48 mmol/L）HHL為底物，并分別添加質(zhì)量濃度為0.85、3.4、12.8 mg/mL的VGPG（純度均為98%），同時設(shè)空白對照組（不添加VGPG），37 ℃保溫準(zhǔn)確反應(yīng)10 min。測定ACE的酶促反應(yīng)速率（V），平行測定3 次，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，以1/V-1/[S]作圖，并按米氏雙倒數(shù)方程（公式（2））計算最大酶促反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km），根據(jù)其結(jié)果判斷VGPG對ACE的抑制作用類型。

式中：υ為產(chǎn)物生成速率/（μg/min）；Km為米氏常數(shù)/（mmol/L）；[S]為底物濃度/（mmol/L）；Vmax為最大反應(yīng)速率/（μg/min）。

1.3.3 高鹽、高糖誘導(dǎo)Wistar大鼠HTN模型的建立與分組

本研究模擬自然人群HTN形成過程[18-19]，對大鼠給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaCl的高鹽飲食和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%果糖的高糖飲水。采用大鼠血壓心率測定儀每天測壓，并進(jìn)行持續(xù)1 周的尾部預(yù)溫和環(huán)境適應(yīng)訓(xùn)練（將大鼠固定好后等待20 min，使大鼠心率穩(wěn)定后進(jìn)行測定），至連續(xù)3 d血壓收縮壓大于140 mmHg并穩(wěn)定，則視為建模成功。

對建模成功HTN大鼠進(jìn)行分組，分別為模型組（標(biāo)記M，生理鹽水質(zhì)量濃度9 g/L）、對照組（標(biāo)記C，非洛地平緩釋片質(zhì)量濃度0.5 mg/mL）、VGPG高劑量組（質(zhì)量濃度50 mg/mL）、VGPG中劑量組（質(zhì)量濃度25 mg/mL）、VGPG低劑量組（質(zhì)量濃度12.5 mg/mL），同時設(shè)立正常組（標(biāo)記Z，生理鹽水質(zhì)量濃度9 g/L），每組6 只，灌胃劑量5 mL/kgmb，每隔3 d測血壓、稱質(zhì)量，灌胃實(shí)驗持續(xù)3 周。

1.3.4 大鼠血清中ACE活性、血脂指標(biāo)濃度以及臟器指數(shù)的測定

血清中ACE活力、血脂指標(biāo)濃度測定：各組經(jīng)3 周灌胃實(shí)驗后，采用眼眶取血法采血，室溫靜置1 h自然凝固，平衡后3 000 r/min離心10 min，取上清液參照試劑盒說明書測定ACE活力及其他血脂指標(biāo)（TC、TG、LDL-C、HDL-C、LP（a）、FFA）濃度。

臟器指數(shù)測定：灌胃實(shí)驗結(jié)束后解剖大鼠，取出脾臟、腎臟，用濾紙吸干殘血后，分別稱其質(zhì)量作為相應(yīng)臟器指數(shù)。

1.3.5 大鼠腸道菌群相關(guān)指標(biāo)測定

3 周灌胃實(shí)驗結(jié)束后處死大鼠并將其解剖，之后在無菌環(huán)境下取大鼠腸道糞便貯于滅菌EP管中并密封保存，置于液氮中備用。后將樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行腸道菌群α-多樣性分析、菌群群落分析、Heatmap分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018軟件作圖，實(shí)驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性分析采用單因素方差分析法，差異性顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 VGPG與ACE的結(jié)合模式分析

通過將VGPG對接到ACE的活性位點(diǎn)，可以深入研究二者的結(jié)合模式。分子對接得到的結(jié)合能為－26.03 kJ/mol，對接結(jié)果如圖1所示，可以看出多肽分子VGPG能夠結(jié)合在ACE的活性位點(diǎn)，并且由于VGPG結(jié)構(gòu)中具有較多的氫鍵供體和受體，與ACE活性位點(diǎn)的氨基酸殘基形成了較強(qiáng)的親水相互作用。因此，分子對接結(jié)果初步表明，VGPG能夠與ACE結(jié)合并具有較強(qiáng)的親和力，其中氫鍵相互作用可能對于二者的結(jié)合具有重要的貢獻(xiàn)。

圖1 VGPG分子結(jié)構(gòu)（A）及VGPG與ACE活性位點(diǎn)的結(jié)合（B）Fig. 1 Molecular structure of VGPG (A) and binding of VGPG to the active site of ACE (B)

VGPG與ACE結(jié)合模式如圖2所示。參與二者結(jié)合的氨基酸殘基主要有Ala356、Pro407、Val518、Arg522、Tyr523以及Zn2＋，其中VGPG與Ala356和Arg522能夠形成氫鍵，而VGPG的C末端羧基與Zn2＋形成了金屬配位鍵，從而起到抑制ACE作用，這與Cheung等[20]的研究結(jié)果一致。表明VGPG主要通過氫鍵作用以及與Zn2＋的配位作用與ACE的活性位點(diǎn)結(jié)合，對ACE起競爭性抑制作用，從而抑制ACE的活性。

圖2 VGPG與ACE的結(jié)合模式Fig. 2 Binding pattern of VGPG to ACE

2.2 VGPG對ACE抑制率及酶促動力學(xué)分析結(jié)果

由圖3A及表1可知，VGPG在不同質(zhì)量濃度下的Lineweaver-Burk倒數(shù)圖為近似相交于Y軸的一組直線，其中截距1/Vmax約為1.58 min/μg，Km隨著VGPG質(zhì)量濃度的增大而增大，表明其對ACE的抑制模式為競爭性抑制。

表1 VGPG對ACE抑制作用的Lineweaver-Burk曲線方程Table 1 Lineweaver-Burk curve equations of VGPG at different concentrations for ACE inhibition

由圖3B VGPG對ACE體外抑制實(shí)驗結(jié)果可知，不同純度VGPG對ACE的抑制率具有明顯差異。VGPG純度70%、85%、98%的半抑制質(zhì)量濃度分別為2.30、1.15、0.75 mg/mL，表明VGPG的純度越高對ACE的抑制效果越好，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。此外，在相同純度下，隨著VGPG質(zhì)量濃度的增加，其對ACE的抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且當(dāng)VGPG純度為98%、質(zhì)量濃度為3.4 mg/mL時抑制率最大，達(dá)到77.4%，與Nawaz等[21]所制備的酶解豌豆肽研究結(jié)果相似。這是由于當(dāng)VGPG質(zhì)量濃度較低時，隨著濃度升高，VGPG競爭結(jié)合ACE活性位點(diǎn)能力提高，從而對ACE抑制效果顯著提升；而當(dāng)VGPG質(zhì)量濃度較高時，由于ACE活性位點(diǎn)處結(jié)合的VGPG達(dá)到飽和，VGPG的競爭結(jié)合ACE活性位點(diǎn)能力降低，并且由于VGPG的結(jié)構(gòu)中含有較多的氫鍵供體和受體，其在高質(zhì)量濃度下會通過靜電作用相互影響，從而表現(xiàn)出對ACE抑制效果增長緩慢甚至是下降現(xiàn)象。這與前文VGPG對ACE分子結(jié)合模式為競爭性抑制作用的結(jié)論一致。

圖3 VGPG的酶促動力學(xué)（A）和不同純度VGPG對ACE抑制率（B）Fig. 3 Enzymatic kinetics of VGPG (A) and inhibitory rates of ACE by VGPG of different purities (B)

2.3 VGPG對HTN大鼠血壓和體質(zhì)量的影響

如圖4所示，在HTN模型建立期間，Z組大鼠血壓維持在100～120 mm Hg之間，其余實(shí)驗組大鼠的血壓明顯上升并維持在140 mm Hg以上，證明HTN模型建造成功。同時，Z組大鼠在持續(xù)灌胃期間血壓穩(wěn)定，表明實(shí)驗室飼養(yǎng)環(huán)境對大鼠血壓無明顯影響。藥物干預(yù)后，灌胃實(shí)驗結(jié)束時C組大鼠血壓明顯降低，與治療前相比血壓降低了19.0%；VGPG各劑量組血壓也有不同程度的下降，其中VGPG中劑量組下降程度最大，達(dá)到15.8%，低劑量組與高劑量組分別下降11.6%和9.3%。說明中劑量的VGPG降壓效果最好，與圖3B體外模擬抑制實(shí)驗結(jié)果相印證，表明降壓效果不是單純地隨著VGPG質(zhì)量濃度的提高而提升，間接證明VGPG是通過競爭性抑制ACE活性的方式來降低血壓。

圖4 VGPG對HTN大鼠血壓的影響Fig. 4 Effect of VGPG on blood pressure of HTN rats

由圖5可知，在整個持續(xù)灌胃期間M組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，并且顯著高于Z組，C組與VGPG各劑量組同樣顯著上升，符合高鹽高糖飲食所致HTN患者的生理特征[22]，間接證明了實(shí)驗建模成功。在給予非洛地平緩釋片與VGPG后，與灌胃實(shí)驗開始時相比，C組與VGPG各劑量組大鼠體質(zhì)量在灌胃期間均呈現(xiàn)不同程度的下降，灌胃結(jié)束時下降幅度為VGPG中劑量組最高，達(dá)到10.3%；C組次之，達(dá)到5.4%。這與對應(yīng)各組大鼠血壓變化趨勢相似，表明HTN對體質(zhì)量具有一定的影響，且VGPG有助于緩解由于高鹽高糖飲食所導(dǎo)致的肥胖，對降低血壓具有積極作用。

圖5 VGPG對HTN大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 5 Effect of VGPG on body mass of HTN rats

2.4 VGPG對HTN大鼠血清ACE活力的影響

如圖6所示，M組HTN大鼠血清中ACE活力最高，達(dá)到897 mU/mg，而Z組大鼠血清中ACE活力為511 mU/mg，兩者之間具有顯著差異（P＜0.05），表明血清中ACE活力顯著增加是誘發(fā)HTN的一個重要因素[23]。與Z組相比，C組大鼠血清中ACE活力無顯著差異（P＞0.05），同時VGPG各劑量組大鼠血清中ACE活力與Z、M組相比具有顯著差異（P＜0.05），其中VGPG中劑量組與正常大鼠ACE活力最為接近，證明通過抑制大鼠血清中ACE活力是VGPG降壓的一條途徑，且中劑量的VGPG抑制效果最好。

圖6 VGPG對HTN大鼠血清ACE活力的影響Fig. 6 Effect of VGPG on ACE activity in serum of HTN rats

2.5 VGPG對HTN大鼠血清中血脂的影響

由表2可知，M組較Z組血脂中各項指標(biāo)均發(fā)生不同程度的變化，6 項血脂濃度均低于Z組；C組大鼠血脂中HDL-C、LP（a）、LDL-C濃度與Z組之間無顯著差異（P＞0.05），TG濃度顯著低于Z組而高于M組，TC、FFA濃度高于Z組（P＜0.05），表明藥物對血脂變化有積極作用，這與文獻(xiàn)[24]報道一致；與Z組相比，VGPG中、低劑量組大鼠血脂中TG、FFA濃度具有顯著差異（P＜0.05），VGPG中劑量組大鼠血脂中其余成分與Z組相比無顯著差異（P＞0.05），其變化趨勢與C組相似，表明VGPG與HTN藥物對血脂成分的影響作用效果相似。值得注意的是，VGPG各劑量組中VGPG中劑量組的血脂各項指標(biāo)濃度相較于其他兩組與Z組更為接近，因此，中劑量的VGPG對大鼠HTN調(diào)節(jié)具有更好的效果，而且VGPG對于大鼠HTN的作用效果并不是單純隨著濃度的升高而增加，這與前文的研究結(jié)果相同。

表2 HTN大鼠血脂組成成分濃度Table 2 Blood lipid levels in HTN rats

2.6 VGPG對HTN大鼠臟器指數(shù)的影響

由表3可知，M組HTN大鼠的脾臟指數(shù)顯著高于Z組（P＜0.05），VGPG低、高劑量組脾臟指數(shù)與M組無顯著差異，C組、VGPG中劑量組脾臟指數(shù)與Z組無顯著差異（P＞0.05）；對腎臟指數(shù)而言，各組相對Z組均顯著降低（P＜0.05），但其中VGPG中劑量組腎臟指數(shù)與Z組最為接近。結(jié)果表明，HTN會對腎臟、脾臟器官產(chǎn)生一定的影響，而VGPG對此具有一定的治療和調(diào)節(jié)作用，且中劑量的VGPG效果最好，與文獻(xiàn)[25]報道一致。

表3 VGPG對HTN大鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of VGPG on spleen and kidney indices in HTN rats

2.7 VGPG對大鼠腸道菌群的影響

2.7.1α-多樣性分析結(jié)果

對大鼠腸道菌群進(jìn)行物種α-多樣性分析，結(jié)果如圖7所示。M組Sobs指數(shù)較Z組顯著降低，表明由高鹽高糖引發(fā)的HTN會降低腸道菌群的多樣性，這與文獻(xiàn)[26]研究結(jié)果一致；對大鼠給予非洛地平緩釋片與VGPG治療后，C組菌群豐富度有顯著提升，說明藥物對腸道菌群的多樣性具有顯著影響；VGPG低、中劑量組菌群豐富度顯著高于M組，分別高出122.7%、51.1%，且菌群豐富度隨著VGPG質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)明顯下降趨勢，說明較低質(zhì)量濃度的VGPG有利于菌群生長，但質(zhì)量濃度太高則會選擇性地導(dǎo)致某些腸道菌群減少或消失，且這種作用隨VGPG質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。需要注意的是，盡管VGPG低劑量組糞便菌群豐富度最高，但VGPG中劑量組豐富度與Z組最為接近，表明中劑量的VGPG具有改善因HTN而造成的菌群豐富度與多樣性下降的能力，從而使腸道菌群微環(huán)境維持在正常范圍之內(nèi)，進(jìn)而起到降壓的效果。

圖7 大鼠腸道菌群Sobs指數(shù)Fig. 7 Sobs index of intestinal flora in rats

如圖8A所示，Sobs稀釋曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和，能夠覆蓋大鼠腸道微生物組群落的絕大部分物種。且Sobs指數(shù)中C組最高，之后依次為VGPG低劑量組、VGPG中劑量組、Z組，M組與VGPG高劑量組Sob指數(shù)均低于正常大鼠，VGPG中劑量組與Z組最接近，表明其與正常大鼠的菌群豐富度最相似。

圖8 大鼠腸道菌群稀釋曲線（A）和Shannon曲線（B）Fig. 8 Rarefaction curve (A) and Shannon (B) curves of intestinal flora in rats

Shannon指數(shù)能夠反映菌群的多樣性[27]，由圖8B可知，M組相較于Z組，多樣指數(shù)明顯降低，說明HTN會降低腸道菌群的多樣性；C組與Z組相近，說明藥物基本不會影響腸道菌群的多樣性；VGPG低劑量組與中劑量組HTN大鼠腸道菌群的多樣性與Z組接近，而高劑量組明顯低于Z組。表明由高鹽高糖所引發(fā)的HTN會明顯改變生物腸道中菌群的豐富度與多樣性，低、中劑量的VGPG對HTN患者腸道菌群有一定的改善作用。

2.7.2 門水平上大鼠腸道菌群群落分析結(jié)果

目前已有研究表明厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）之比（F/B）可以反映腸道菌群紊亂程度[8]。由圖9可知，Z組、M組、C組、VGPG高劑量組、VGPG中劑量組、VGPG低劑量組F/B分別為3.27、0.65、5.89、4.54、4.88、6.24。M組腸道菌群的紊亂程度最低，而VGPG低劑量組最高。其原因可能是由于通過高糖高鹽飲食所引發(fā)的HTN會使腸道中菌群的豐富度降低，從而使HTN大鼠腸道菌群的紊亂程度相對降低，同時也表明藥物會增加腸道菌群的紊亂程度，對其造成不良影響。結(jié)合Heatmap圖（圖10）進(jìn)行樣本聚類分析，在門水平上大鼠腸道各菌群分布M組與Z組差別最大，VGPG劑量組中1組與Z組最為接近，證明VGPG對HTN大鼠腸道菌群具有改善效果。

圖9 門水平大鼠腸道菌群群落分析Fig. 9 Intestinal flora community analysis of rats at the phylum level

圖10 門水平大鼠腸道菌群Heatmap圖Fig. 10 Heatmap of the intestinal flora of rats at the phylum level

2.7.3 科水平上大鼠腸道菌群群落分析結(jié)果

如圖11、12所示，在科水平上，與Z組相比，M組中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌科（Prevotellaceae）所占比例明顯上升，產(chǎn)乙酸、丁酸等菌科（Lachnospiraceae）所占比例明顯下降，存在腸道菌群失衡現(xiàn)象。表明HTN大鼠腸道菌群中產(chǎn)短鏈脂肪酸細(xì)菌數(shù)量增加，而產(chǎn)乙酸、丁酸細(xì)菌數(shù)量減少，這與文獻(xiàn)[8]的研究結(jié)果相同。腸道菌群與血脂成分分析結(jié)果表明，腸道微生物影響血壓的機(jī)制之一可能是通過其分泌物（如短鏈脂肪酸等）影響大鼠血脂成分，進(jìn)而對血壓產(chǎn)生一定的影響，這與Felizardo等[28]的研究結(jié)果一致。使用非洛地平緩釋片和VGPG干預(yù)后，C組與VGPG各劑量組Prevotellaceae與Lachnospiraceae占比接近正常大鼠，但C組中螺旋體科（Spirochaetaceae）比例上升，其所屬菌屬（如密螺旋體屬、疏螺旋體屬以及鉤端螺旋體屬等）均具有較強(qiáng)的致病性，并且已有多項研究表明，Spirochaetaceae會導(dǎo)致疾病的發(fā)生和傳播[29-30]。本實(shí)驗中C組的Spirochaetaceae比例上升，盡管未表現(xiàn)出明顯的疾病癥狀，但仍增加了大鼠患病的潛在風(fēng)險；VGPG各劑量組中Lactobacillaceae比例明顯上升，此菌類與糖類物質(zhì)代謝分解有關(guān)，其所屬絕大多數(shù)菌屬（如乳酸菌、植物乳桿菌等）均具有較強(qiáng)的分解糖類物質(zhì)的能力，可以將葡萄糖、果糖等物質(zhì)分解為乳酸，屬益生菌[31]。因此，VGPG各劑量組中Lactobacillaceae比例明顯上升，使得大鼠腸道對誘發(fā)HTN病因之一——果糖的分解能力大大提高，從而對緩解、治療HTN疾病產(chǎn)生良好的作用。大鼠腸道菌群分析結(jié)果表明，對照組藥物可能在治療HTN的過程中對腸道菌群產(chǎn)生一定的副作用，而VGPG對菌群無明顯副作用，并且對改善腸道菌群具有積極作用。

圖11 科水平大鼠腸道菌群群落分析Fig. 11 Intestinal flora community analysis of rats at the family level

圖12 科水平大鼠腸道菌群Heatmap圖Fig. 12 Heatmap of the intestinal flora of rats at the family level

3 結(jié) 論

本研究表明VGPG對HTN疾病具有顯著的治療效果，在21 d的HTN大鼠灌胃干預(yù)實(shí)驗中，純度為98%、質(zhì)量濃度為25 mg/mL的VGPG具有最好的降壓效果，并且VGPG還可緩解由HTN所引起的肥胖；與常規(guī)降壓藥物相比，VGPG對腎臟、脾臟器官以及腸胃微生態(tài)環(huán)境無明顯副作用。VGPG在體內(nèi)存在兩種降壓機(jī)制：1）通過與ACE活性位點(diǎn)相結(jié)合，對其活性產(chǎn)生競爭性抑制從而達(dá)到降壓的作用；2）通過調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，使菌群豐富度和多樣性維持在正常范圍以內(nèi)，同時提高菌群對糖類物質(zhì)的分解能力，減少因腸道微生物紊亂而對大鼠血壓造成的不良影響。這兩種調(diào)節(jié)方式之間是否存在關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究從分子對接、體外、體內(nèi)3 個層面，探索性地研究了VGPG對大鼠HTN的抑制效果和機(jī)制，揭示腸道菌群、ACE活性與HTN的關(guān)系，結(jié)果表明VGPG可被用作治療HTN的功能性因子，可用于相關(guān)功能性食品的制備。