雞蛋貯藏過程中蛋黃內(nèi)源抗氧化組分與氧化進程的關(guān)系

袁湖川，劉 鈺，冉麗丹，楊 川，羅珂煜，任旭東，王慶玲

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

中國是雞蛋消費大國，以占全球21%的人口消費全球產(chǎn)量40%的雞蛋。國家統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：我國雞蛋年產(chǎn)量以2%增速逐年提高，2017年國內(nèi)雞蛋產(chǎn)量高達2 609.5萬 t[1]。研究發(fā)現(xiàn)雞蛋貯藏過程中哈夫單位、蛋黃指數(shù)等表征雞蛋新鮮度的指標(biāo)顯著降低；過氧化值等脂質(zhì)氧化指標(biāo)升高；金屬離子及呼吸代謝產(chǎn)生的氧自由基會使雞蛋營養(yǎng)組分發(fā)生氧化[2]；脂質(zhì)組分發(fā)生變化，如多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），尤其是ω-3 PUFA含量下降，飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）含量升高[3]。以上變化會降低雞蛋的營養(yǎng)價值及加工性能。

針對貯藏過程中雞蛋發(fā)生的品質(zhì)劣變，大部分學(xué)者通過雞蛋涂膜或在雞的飼糧中添加藥草、維生素等以延長雞蛋貯藏期、減緩組分氧化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相比于冷藏（4 ℃），常溫（22 ℃）貯藏下的雞蛋脂質(zhì)組分氧化程度并未顯著加深，受精蛋在高溫（37.8 ℃）長時間孵化過程中也未表現(xiàn)出顯著的脂質(zhì)氧化現(xiàn)象[4-5]。此外，有研究表明雞蛋黃中親脂性組分如磷脂、類胡蘿卜素、芳香性氨基酸等具有抗氧化功能，卵黃高磷蛋白具有螯合金屬離子的能力，其水解產(chǎn)物能夠減緩蛋黃的氧化損傷[2,6]。最新的蛋白組學(xué)研究結(jié)果表明新鮮雞蛋黃中存在22 種蛋白酶/蛋白酶抑制劑及628 種活性肽[7-8]，雞蛋內(nèi)部可能存在以內(nèi)源抗氧化組分為基礎(chǔ)的抗氧化調(diào)控體系，調(diào)節(jié)雞蛋貯藏過程中的氧化進程。

為了證實蛋黃內(nèi)源抗氧化組分在雞蛋貯藏過程中的氧化調(diào)控作用，本研究以不同貯藏時間的雞蛋為研究對象，在表征蛋黃氧化現(xiàn)象的基礎(chǔ)上比較親脂、親水抗氧化組分的抗氧化能力，通過對內(nèi)源抗氧化組分抗氧化能力變化及蛋黃氧化程度的表征，分析內(nèi)源抗氧化組分與蛋黃氧化進程的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮未受精海蘭褐殼雞蛋購于石河子市宏鑫養(yǎng)殖場。

2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,4-二硝基苯肼、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、乙二胺四乙酸、甲基-β-環(huán)糊精、叔丁基甲基醚、Trolox（標(biāo)準品） 上海麥克林生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

X7酶標(biāo)儀 美國Biotek儀器有限公司；DCodeTMSystem蛋白電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；SH21-1恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品貯藏及蛋黃液采集

將60 枚新鮮雞蛋（產(chǎn)蛋24 h內(nèi)）在（22±2）℃、相對濕度65%條件下貯藏50 d，每10 d取一次樣，每次取10 枚雞蛋。

蛋黃液采集：將雞蛋破殼后去除蛋清，置蛋黃于濾紙上，蒸餾水緩慢沖洗殘余蛋清后將蛋黃換至另一濾紙并緩慢滾動使蒸餾水吸收完全，滴管刺破蛋黃膜后吸取蛋黃液，收集蛋黃液于無菌干燥燒杯中混勻備用。

1.3.2 蛋黃蛋白分析

1.3.2.1 蛋黃蛋白質(zhì)提取

參考Ma Lizhen等[9]的方法并略作修改。利用0.7 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液將蛋黃液配制成1 g/mL的勻漿，4 000 r/min離心15 min，收集蛋白質(zhì)上清液，雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 羰基含量測定

將蛋白質(zhì)溶液稀釋成1 mg/mL，取5 mL蛋白質(zhì)稀釋液與10 mmol/mL二硝基苯肼溶液等體積混合，室溫下靜置 1 h。待反應(yīng)完成后添加1 mL 20 g/100 mL三氯乙酸溶液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。離心后的沉淀用乙醇-乙酸乙酯混合溶液（1∶1，V/V）洗滌3 次后加入3 mL鹽酸胍溶液（6 mol/L），37 ℃孵育5 min，然后離心10 min，取上清液在370 nm波長處測定吸光度。使用摩爾吸光系數(shù)22 000 L/（mol·cm）計算蛋白質(zhì)的羰基含量[10]。

1.3.2.3 總巰基含量測定

參考Zhang Mengqi等[11]的方法并略作修改，將蛋白質(zhì)溶液稀釋成1 mg/mL，取1 mL蛋白質(zhì)稀釋液與8 mL Tris-甘氨酸溶液（pH 8.0，每升溶液含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g乙二胺四乙酸、8 mol尿素）混合后4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min，取4.5 mL上清液與0.5 mL Ellman試劑反應(yīng)30 min，于412 nm波長處測定吸光度，使用摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算總巰基含量。

1.3.2.4 蛋白組分分析

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）對蛋白組分進行分析，具體參考汪吳晶等[12]的方法。將1 mg/mL的蛋白質(zhì)試樣與上樣緩沖液（1∶1，V/V）混合，95 ℃水浴3 min熱變性，冷卻至室溫上樣，初始電壓80 V，待試樣進入分離膠后提高電壓至120 V，凝膠用考馬斯亮藍染色30 min，脫色液脫色過夜后凝膠成像。

1.3.3 蛋黃脂質(zhì)氧化指標(biāo)測定

1.3.3.1 丙二醛含量測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參考GB 5009.181—2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中丙二醛的測定》[13]進行測定。

1.3.3.2 雙烯值測定

精確稱取2 g蛋黃與40 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）混合，漩渦振蕩后過濾，在濾液中加入0.7 g/100 mL NaCl溶液促進分層，移去上層溶液，下層溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得蛋黃脂質(zhì)，準確稱取2 mg蛋黃脂質(zhì)溶于10 mL環(huán)己烷溶液，于232 nm和215 nm波長處分別測定混合液的吸光度，以A232nm/A215nm比值表示雙烯（conjugated diene，CD）值[14]。

1.3.4 蛋黃不同組分的抗氧化能力比較

1.3.4.1 蛋黃親脂、親水抗氧化組分制備

參考Remanan等[15]的方法并略作修改。稱取10 g蛋黃與50 mL正己烷-二氯甲烷（1∶1，V/V）混合，漩渦振蕩2 min，低溫離心5 min后收集上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮物復(fù)溶于2.5 mL丙酮，并加入7.5 mL 14 g/100 mL的甲基-β-環(huán)糊精溶液即為親脂抗氧化組分（lipophilic antioxidative component，LAC）；殘留物利用氮氣吹干并溶于50 mL體積分數(shù)80%乙醇溶液，漩渦振蕩提取5 min，3 000 r/min離心5 min，所得上清液即為親水抗氧化組分（hydrophilic antioxidative component，HAC）。

1.3.4.2 磷脂提取

參考Ali等[16]的方法提取磷脂。40 g蛋黃與120 mL無水乙醇漩渦混勻后低溫離心，上清液移至燒杯。重復(fù)提取一次，合并上清液并回收溶劑。60 mL正己烷溶解濃縮物后加入120 mL低溫丙酮（－20 ℃），磁力攪拌至磷脂沉淀，低溫丙酮（10 mL/次）洗滌沉淀2 次，氮氣吹干獲得蛋黃磷脂，將磷脂用乙醇溶解成質(zhì)量濃度為1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 類胡蘿卜素提取

3 g蛋黃與9 mL混合溶液（V（無水甲醇）∶V（乙酸乙酯）∶V（石油醚）＝1∶1∶1）漩渦混勻1 min，取上清液后重復(fù)提取3 次，合并上清液并用氮氣吹干。濃縮物用6 mL溶液（V（叔丁基甲基醚）∶V（無水乙醇）＝3∶1）復(fù)溶后過0.45 μm微孔濾膜，制得蛋黃類胡蘿卜素，4 ℃保存?zhèn)溆肹17]。

1.3.4.4 DPPH自由基清除率測定

取0.5 mL試樣，加入0.5 mL無水乙醇、0.125 mL 0.02 g/100 mL DPPH溶液混合均勻，黑暗中室溫振蕩反應(yīng)1 h，于517 nm波長處測定吸光度[18]?？瞻捉M以蒸餾水代替試樣進行測定，按公式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：AC為空白組吸光度；AS為樣品組吸光度。

1.3.4.5 ABTS陽離子自由基清除能力測定

7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）等體積混合，反應(yīng)16 h后稀釋12 倍制得ABTS稀釋液。試樣與等量ABTS稀釋液混合37 ℃孵育8 min，以Trolox（VE）作為標(biāo)準物繪制標(biāo)準曲線，ABTS陽離子自由基清除能力以每毫克組分的VE當(dāng)量表示，單位為μmol/mg[19]。

1.3.4.6 羥自由基清除率測定

將0.2 mL試樣與0.1 mL 10 mmol/L FeSO4·7H2O溶液、0.1 mL 10 mmol/L乙二胺四乙酸溶液、0.5 mL 10 mmol/Lα-脫氧核糖、0.9 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液混勻后加入0.2 mL 10 mmol/L過氧化氫溶液，37 ℃水浴孵育1 h，于510 nm波長處測定吸光度，空白組以蒸餾水代替試樣進行測定[18]。按公式（2）計算羥自由基清除率。

式中：AC為空白組吸光度；AS為樣品組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

每個指標(biāo)平行測定3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準差表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，采用Origin 8.5軟件繪圖，相關(guān)性熱圖及主成分分析圖使用R 3.5.1軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間蛋黃蛋白質(zhì)總巰基和羰基含量變化

蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團易被氧化形成羰基衍生物，羰基含量變化能夠表征蛋白質(zhì)氧化程度。由圖1可知，貯藏過程中蛋黃蛋白質(zhì)羰基含量總體呈上升趨勢，其含量平均值增加了1.2 倍，這可能與活性氧（reactive oxygen species，ROS）及蛋黃新陳代謝速率有關(guān)，ROS能攻擊蛋白質(zhì)氨基酸基團及殘基的自由氨基或亞氨基致使羰基衍生物含量升高[20]。貯藏第10天時羰基含量小幅上升可能是因為此時雞蛋到達第一個呼吸高峰附近，雞蛋新陳代謝的高強度加劇了氨基酸基團氧化生成羰基衍生物的速率。王巧華等[21]研究發(fā)現(xiàn)在貯藏第9天時雞蛋呼吸強度第一次達到峰值，為最低呼吸強度的3.66 倍。貯藏30 d時雞蛋蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高（P＜0.05），并達到最高值，這可能是貯藏后期雞蛋呼吸代謝與好氧菌協(xié)同作用的結(jié)果。劉美玉等[22]研究發(fā)現(xiàn)在貯藏第27天時雞蛋呼吸速率達到最高峰，好氧菌入侵大幅增加了雞蛋對氧氣的需求量，使蛋黃蛋白質(zhì)氧化速率加快，羰基含量顯著升高。貯藏后期羰基含量小幅下降，這可能是在貯藏后期雞蛋卵黃高磷蛋白、高密度脂蛋白等組分在內(nèi)源酶及外界環(huán)境因素下降解成少量具有抗氧化功能的多肽，從而抑制了蛋黃中ROS對蛋白質(zhì)的氧化攻擊。

圖1 雞蛋貯藏過程中蛋黃蛋白質(zhì)總巰基含量和羰基含量變化Fig. 1 Changes in total sulfhydryl content and carbonyl content of yolk proteins during hen egg storage

由圖1可知，蛋黃蛋白質(zhì)總巰基含量隨貯藏時間延長總體呈波動下降趨勢，其含量平均值降低了29.69%。在貯藏10～20 d過程中總巰基含量顯著下降（P＜0.05），這是由于貯藏過程中雞蛋的正常生理代謝通路逐漸遭受破壞，累積的氧自由基導(dǎo)致蛋白質(zhì)巰基基團被大量氧化。在20～40 d貯藏過程中，總巰基含量小幅上升，這可能是由于隨貯藏時間延長，蛋黃蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解旋，致使其內(nèi)部巰基基團暴露，因而表現(xiàn)出總巰基含量小幅上升。有研究表明蛋白質(zhì)不僅含有外部巰基，其結(jié)構(gòu)內(nèi)部也存在隱藏巰基，蛋白結(jié)構(gòu)的解旋致使蛋白內(nèi)部巰基基團暴露能夠增加總巰基含量[23]。貯藏40 d后總巰基含量出現(xiàn)下降趨勢并在50 d時達到最低值，這與蛋白質(zhì)大量暴露的巰基基團被自由基氧化有關(guān)。

2.2 貯藏期間蛋黃蛋白組分變化

由圖2可知，隨貯藏時間延長，分子質(zhì)量在25～135 kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生降解，卵黃高磷蛋白、α/β-卵黃球蛋白及高密度脂蛋白等主要蛋白質(zhì)在貯藏后期發(fā)生明顯變化。高密度脂蛋白作為脂肪傳感器調(diào)節(jié)脂肪代謝酶的轉(zhuǎn)錄，在脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮重要作用。貯藏后期高密度脂蛋白的降解可能是脂質(zhì)代謝通路在雞蛋貯藏過程中遭受破壞所致，本研究結(jié)果與Zhu Wenjun等[24]的研究結(jié)果一致，其通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)貯藏后期脂蛋白豐度下調(diào)。

圖2 雞蛋貯藏過程中蛋黃蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE pattern of yolk proteins during hen egg storage

卵黃球蛋白占蛋黃蛋白質(zhì)總量的9.3%，是構(gòu)成蛋黃漿質(zhì)的主要蛋白質(zhì)之一。圖2顯示α-卵黃球蛋白（70 kDa）、β-卵黃球蛋白（45 kDa）在雞蛋貯藏過程中均發(fā)生明顯降解的現(xiàn)象，并在50 d時達到蛋白豐度的最低值。已有研究表明卵黃球蛋白能被蛋白酶水解，且其水解產(chǎn)物表現(xiàn)出抑制炎性介質(zhì)NO產(chǎn)生的功能[25]。因此，推測卵黃球蛋白可能是在蛋黃內(nèi)源蛋白酶的酶解作用下分解成了小分子多肽片段。此外，貯藏過程中大量ROS的生成對卵黃球蛋白也具有降解作用。

卵黃高磷蛋白含有56.68%的絲氨酸殘基，其中90%的絲氨酸被磷酸化形成磷酸絲氨酸殘基簇，使其與Fe3＋具有較強的結(jié)合能力并形成不溶性卵黃高磷蛋白-Fe復(fù)合物，因此在貯藏前期卵黃高磷蛋白能減緩蛋黃內(nèi)金屬離子誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化。圖2顯示卵黃高磷蛋白隨貯藏時間延長條帶灰度逐漸變淺，說明貯藏能夠造成卵黃高磷蛋白的分子降解，卵黃高磷蛋白的酶解產(chǎn)物卵黃高磷蛋白磷酸肽表現(xiàn)出較高的鈣離子生物利用度和抗氧化應(yīng)激能力[26]。

2.3 貯藏期間蛋黃CD值和MDA含量變化

CD值為表征不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）初級氧化產(chǎn)物共軛二烯類化合物含量的指標(biāo)。如圖3所示，雞蛋貯藏過程中蛋黃CD值呈上升趨勢，一方面是因為UFA持續(xù)被氧化，自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)氫過氧化物與某些促氧因子反應(yīng)生成的共軛二烯類化合物含量逐漸增加；另一方面，雞蛋黃內(nèi)源脂肪酶能夠誘導(dǎo)PUFA及單不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)生成共軛二烯[27]。

圖3 雞蛋貯藏過程中蛋黃中CD值和MDA含量變化Fig. 3 Changes in CD value and MDA content of yolk during hen egg storage

由圖3可知，隨貯藏時間延長，蛋黃MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明貯藏過程中蛋黃脂質(zhì)氧化程度不斷加劇，究其原因在于貯藏過程中氧自由基與蛋黃脂質(zhì)持續(xù)發(fā)生過氧化作用。一方面，脂質(zhì)氧化初始階段由金屬離子及ROS等引發(fā)產(chǎn)生烷自由基（R·），隨后與UFA作用生成脂質(zhì)氫過氧化物，終止階段分解生成醛、酮、醇等物質(zhì)；另一方面，PUFA在脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）等內(nèi)源脂肪酶的作用下會進一步加速脂質(zhì)的氧化反應(yīng)，致使MDA含量隨貯藏時間延長顯著上升。有學(xué)者研究表明，LOX立體選擇性地除去PUFA中的氫后，催化氧分子插入到含一個或多個(1Z,4Z)-戊二烯的PUFA，產(chǎn)生相應(yīng)的(1S,2E,4Z)-氫過氧化物，隨后，LOX繼續(xù)催化(1S,2E,4Z)-氫過氧化物形成醛、酮、酸等物質(zhì)[27]。

2.4 蛋黃HAC及LAC的DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率用于評價試樣與單電子配對能力的大小。蛋黃中LAC和HAC的DPPH自由基清除能力比較如圖4所示，雞蛋蛋黃在貯藏0～30 d內(nèi)LAC的DPPH自由基清除率高于HAC，而在貯藏后期（40～50 d）略低于HAC。貯藏前期LAC抗氧化活力較強是因為雞蛋黃中磷脂、類胡蘿卜素、VE等大量LAC發(fā)揮了主要抗氧化作用。Nimalaratne等[28]的研究結(jié)果表明蛋黃脂溶性組分磷脂、類胡蘿卜素因具有活性官能團而表現(xiàn)出高抗氧化活性，通過與氧自由基結(jié)合減緩蛋黃氧化速度。貯藏10～20 d過程中LAC、HAC的DPPH自由基清除率升高，這可能與此時期呼吸速率減緩，單電子自由基的生成速率降低有關(guān)。Yousr等[18]的研究結(jié)果表明蛋黃蛋白質(zhì)水解物中含有TMFPSA、WIHNENQGF及WYGPD序列的多肽，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。因此，貯藏后期HAC的DPPH自由基清除率上升可能是卵黃高磷蛋白在內(nèi)源蛋白酶的作用下水解成含有抗氧化活性的多肽所致。

圖4 雞蛋貯藏過程中蛋黃LAC和HAC的DPPH自由基清除能力的變化Fig. 4 Changes in 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity of LAC and HAC during hen egg storage

2.5 雞蛋黃LAC及HAC的ABTS陽離子自由基清除能力

由圖5可知，在貯藏過程中LAC和HAC的ABTS陽離子自由基清除能力總體呈下降趨勢，且LAC的ABTS陽離子自由基清除能力高于HAC，這是因為相比HAC，LAC中的類胡蘿卜素富含帶電子的多烯碳鏈，其獨特的結(jié)構(gòu)特性賦予了類胡蘿卜素較高的自由基清除能力。貯藏過程中HAC的ABTS陽離子自由基清除能力在貯藏后期小幅上升，可能是隨貯藏時間延長，蛋清中具有抗氧化作用的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白擴散至蛋黃親水組分中，致使HAC抗氧化能力增強[29]。

圖5 雞蛋貯藏過程中蛋黃LAC和HAC的ABTS陽離子自由基清除能力的變化Fig. 5 Changes in ABTS cation radical scavenging capacity of LAC and HAC during hen egg storage

綜上，雞蛋貯藏過程中蛋黃LAC抗氧化活性高于HAC，蛋黃LAC可能在雞蛋黃組分氧化過程中起重要的角色。因此，為繼續(xù)探究LAC與雞蛋貯藏過程中蛋黃氧化的潛在相關(guān)性，選取蛋黃親脂性組分中類胡蘿卜素、磷脂為研究對象進一步深入分析。

2.6 蛋黃抗氧化組分的DPPH自由基清除率

以雞蛋黃為對照，測得貯藏過程中蛋黃磷脂、類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率的變化規(guī)律如圖6所示。類胡蘿卜素、磷脂對DPPH自由基清除效果隨貯藏時間延長總體呈下降趨勢，可能是貯藏過程中磷脂脂肪酸因其高不飽和性被氧化，而類胡蘿卜素在金屬離子等作用下被破壞。貯藏30 d后蛋黃DPPH自由基清除率大于磷脂及類胡蘿卜素，其原因可能是在貯藏后期蛋白質(zhì)降解形成的多肽在蛋黃中發(fā)揮了主要抗氧化作用。有研究表明蛋黃中載脂蛋白水解物能提高蛋黃抗氧化活性，且測序發(fā)現(xiàn)這些抗氧化多肽具有部分相同的氨基酸序列[8]。

圖6 雞蛋貯藏過程中蛋黃抗氧化組分DPPH自由基清除率的變化Fig. 6 Changes in DPPH radical scavenging capacity of antioxidant components of yolk during egg storage

2.7 蛋黃抗氧化組分的ABTS陽離子自由基清除能力

由圖7可知，貯藏過程中磷脂及類胡蘿卜素ABTS陽離子自由基清除能力總體高于蛋黃。這可能與磷脂及類胡蘿卜素含有的活性基團相關(guān)，磷脂酰乙醇胺是磷脂發(fā)揮抗氧化的主要功能成分，其極性頭部側(cè)鏈具有吸收氧自由基能力的活性羥胺基團；類胡蘿卜素因含有不飽和碳鏈及芳香環(huán)，其能猝滅氧自由基而表現(xiàn)出高抗氧化活性。此外，雞蛋黃中脂質(zhì)氧化各級產(chǎn)物對蛋黃整體抗氧化能力具有抑制作用，如MDA能破壞細胞正常代謝通路造成蛋白結(jié)構(gòu)功能失活及酶活力降低，致使蛋黃ABTS陽離子自由基清除率低于磷脂及類胡蘿卜素。雞蛋貯藏40～50 d過程中，類胡蘿卜素ABTS陽離子自由基清除能力下降，這可能是類胡蘿卜素在長時間貯藏過程中抗氧化成分（如玉米黃素）含量不斷下降所致[17]。

圖7 雞蛋貯藏過程中蛋黃抗氧化組分ABTS陽離子自由基清除能力的變化Fig. 7 Changes in ABTS cation radical scavenging capacity of antioxidant components of yolk during egg storage

2.8 蛋黃抗氧化組分的羥自由基清除率

羥自由基是最活潑的氧自由基，由二價鐵離子與氫過氧化物反應(yīng)生成，能對核酸及蛋白質(zhì)等造成氧化破壞。由圖8可知，類胡蘿卜素羥自由基清除率在貯藏10～30 d期間快速下降，隨后在50 d時達到最低值，這可能與貯藏過程中雞蛋呼吸強度增強致使氧自由基濃度逐漸增加有關(guān)，氧自由基濃度增加會攻擊雞蛋抗氧化物，使雞蛋抗氧化組分的抗氧化能力下降。此外，雞蛋黃中二價鐵離子與氫過氧化物反應(yīng)生成大量羥自由基也是致使類胡蘿卜素羥自由基清除能力下降的重要原因。磷脂羥自由基清除能力貯藏過程中也呈下降趨勢，這是因為蛋黃磷脂組分中UFA不斷氧化成大量SFA，而SFA含量越高磷脂抗氧化能力越低[30]。

圖8 雞蛋貯藏過程中蛋黃抗氧化組分羥自由基清除率的變化Fig. 8 Changes in hydroxyl radical scavenging capacity of antioxidant components of yolk during egg storage

2.9 雞蛋貯藏中抗氧化組分抗氧化活性的主成分分析結(jié)果

圖9為蛋黃類胡蘿卜素、磷脂與蛋黃抗氧化活性的主成分分析圖，其顯示出主成分1和主成分2分別占78.1%、7.6%，能解釋總變異的85.7%。蛋黃中磷脂抗氧化活性與類胡蘿卜素抗氧化活性呈正相關(guān)，而與MDA含量、CD值呈負相關(guān)，表明磷脂及類胡蘿卜素的抗氧化能力與雞蛋貯藏過程中蛋黃脂質(zhì)的氧化進程具有相關(guān)性。此外，雞蛋在貯藏過程中6 個不同時期的取樣點分布在不同的區(qū)域，表明磷脂、類胡蘿卜素抗氧化活性及脂質(zhì)氧化程度在雞蛋貯藏的不同時期具有差異性。

圖9 雞蛋貯藏中抗氧化組分自由基清除能力主成分分析Fig. 9 Principal component analysis plot for free radical scavenging capacity of antioxidant components during egg storage

2.10 相關(guān)性分析結(jié)果

相關(guān)性熱圖可進一步闡述抗氧化組分與蛋黃氧化的相關(guān)性，顏色越深表明相關(guān)性越強。由圖10可知，雞蛋脂質(zhì)氧化程度（MDA含量和CD值）與蛋黃磷脂及類胡蘿卜素抗氧化活性呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），最高相關(guān)系數(shù)為－0.98。磷脂是蛋黃中含量最高的脂溶性抗氧化組分，研究表明磷脂側(cè)鏈堿性基團的電離程度與其抗氧化活力存在線性關(guān)系，側(cè)鏈基團電離程度越大，磷脂抗氧化能力越高[31]。在雞蛋貯藏過程中蛋黃內(nèi)環(huán)境酸堿度的變化能影響磷脂側(cè)鏈堿性基團的電離程度，繼而對磷脂的抗氧化能力產(chǎn)生影響。

圖10 蛋黃氧化與抗氧化組分相關(guān)性分析Fig. 10 Correlation analysis of egg yolk oxidation and antioxidant components during storage

與CD值相比，蛋黃抗氧化組分與脂質(zhì)次級氧化產(chǎn)物MDA含量表現(xiàn)出更高的相關(guān)性。已有研究發(fā)現(xiàn)抗氧化組分能有效去除由金屬催化劑與脂類氧化物直接反應(yīng)生成的自由基[32]。磷脂及類胡蘿卜能有效去除由蛋黃金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基，影響脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的生成；當(dāng)貯藏后期磷脂及類胡蘿卜素抗氧化活性下降時，脂質(zhì)加速氧化產(chǎn)生大量不穩(wěn)定初級氧化產(chǎn)物，并進一步轉(zhuǎn)變?yōu)镸DA。因此蛋黃抗氧化組分與MDA含量之間表現(xiàn)出較高的相關(guān)性。

此外，類胡蘿卜素抗氧化能力與磷脂抗氧化能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。有研究報道類胡蘿卜素在其他抗氧化物的協(xié)同作用下能發(fā)揮出更強的抗氧化活力，其對脂質(zhì)過氧化的協(xié)同抑制作用大于兩者抑制效果之和[33]。因此，推測雞蛋貯藏過程中蛋黃磷脂及類胡蘿卜素組分在蛋黃內(nèi)部可能形成相互協(xié)同的抗氧化體系共同抑制蛋黃脂質(zhì)氧化。

3 結(jié) 論

本研究證實了雞蛋隨貯藏時間延長蛋黃蛋白質(zhì)、脂質(zhì)組分的持續(xù)氧化現(xiàn)象。與蛋黃HAC相比，貯藏過程中LAC表現(xiàn)出更強的抗氧化活性，其在抑制蛋黃氧化過程中發(fā)揮了更為重要的作用，蛋黃類胡蘿卜素比磷脂具有更高的自由基清除能力，可能是調(diào)控蛋黃脂質(zhì)氧化進程的關(guān)鍵組分。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，磷脂自由基清除能力與類胡蘿卜素自由基清除能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而與脂質(zhì)氧化程度呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），表明蛋黃內(nèi)部可能存在脂質(zhì)抗氧化組分協(xié)同作用體系共同調(diào)控蛋黃的氧化進程。