李博宇 郭 勇 倪和民 盛熙暉 陳 余 王 梁 王相國 肖龍菲 邢 凱* 齊曉龍

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206； 2.北京市畜牧總站，北京 100107)

冷凍精子通常用于人工授精(AI)、體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、瀕危物種保護(hù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。在近幾十年中，冷凍精液已經(jīng)進(jìn)行了廣泛應(yīng)用，抗凍保護(hù)劑是影響精液冷凍保存效果的重要條件之一，主要包括提供精子存活所需要能源物質(zhì)，維持適宜滲透壓和pH的精液稀釋液以及防止或減少冷凍過程中精子冰晶形成的抗凍劑。DMA和DMSO是目前公認(rèn)的效果最好的2種抗凍劑?，F(xiàn)在大多數(shù)抗凍保護(hù)劑研究主要集中于稀釋液配方的優(yōu)化或者抗凍劑的選擇上，李潔等[2]通過在抗凍保護(hù)劑中添加不同抗氧化劑，發(fā)現(xiàn)一定濃度的褪黑素對雞精液保存具有顯著作用，同樣添加不同濃度的紅景天多糖、枸杞多糖等能顯著提高雞精子的凍后活率[3]。然而不同抗凍保護(hù)劑對雞精液抗凍效果及抗凍機(jī)制的相關(guān)研究較少。而且由于家禽精子獨(dú)特的生理學(xué)特征及個體差異性，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)一種特別有效的雞精液抗凍保護(hù)劑[4]。

基因表達(dá)譜芯片已被應(yīng)用到動物精子基因表達(dá)水平檢測。Singh等[5]采用表達(dá)譜芯片鑒定出了幾千個雞精液中高表達(dá)的基因。而針對冷凍前后的精液，Chen等[6]比較了荷斯坦牛鮮精和凍融精的基因表達(dá)水平，并鑒定出15個差異表達(dá)的基因(Differentially expressed genes，DEG)。這些研究表明表達(dá)譜芯片是鑒定精子基因表達(dá)的一種研究方法。

因此本研究以海蘭褐種公雞為研究對象，通過分析不同抗凍保護(hù)劑處理組的精子活性，旨在篩選冷凍效果更好的抗凍保護(hù)劑。并通過采用Affymetrix公司全基因表達(dá)譜芯片對兩組雞精液進(jìn)行全基因組基因表達(dá)檢測，并篩選出兩組間的差異表達(dá)基因，為闡明不同抗凍保護(hù)劑的抗凍機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集

試驗(yàn)用的海蘭褐種公雞飼養(yǎng)在北京農(nóng)學(xué)院動物房至6月齡。飼養(yǎng)條件為自然光周期，自然溫度，自由飲食和飲水。采用腹部按摩法對18只健康的種公雞進(jìn)行精液采集。采集得到的每只種公雞的精液平均分成兩組，分別添加兩種稀釋保護(hù)液，然后用于制作凍精，2種稀釋液分別用DMA和DMSO做抗凍保護(hù)劑。

1.1.2主要試劑

Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；其余試劑未作特殊說明均購自Sigma公司。

1.1.3抗凍保護(hù)劑配方

抗凍保護(hù)劑Ⅰ：谷氨酸鈉0.867 g，D-果糖0.5 g，磷酸二氫鉀0.065 g，磷酸氫鉀1.27 g，乙酸鈉0.26 g，六水氯化鎂0.03 4 g，檸檬酸鉀0.064 g，用水補(bǔ)至100 mL，pH=7.4，終質(zhì)量濃度含6%DMA。

抗凍保護(hù)劑Ⅱ：谷氨酸鈉1.4 g，葡萄糖0.7 g，D-果糖0.2 g，一水合檸檬酸鈉0.14 g，聚乙烯吡咯烷酮0.1 g，硫酸魚精蛋白0.02 g，無水磷酸氫鈉0.98 g，無水磷酸二氫鈉0.21 g，用水補(bǔ)至100 mL，pH=7.4，終質(zhì)量濃度含10%DMSO。

1.2 方法

1.2.1精液的程序化冷凍及解凍

將采集得到的鮮精分別與抗凍保護(hù)劑Ⅰ和抗凍保護(hù)劑Ⅱ按1∶1稀釋處理，5 ℃平衡30 min，用2種保護(hù)劑再次稀釋，使終稀釋比例為1∶3，5 ℃平衡30 min后，通過程序化冷凍儀(CL-8800i型，上海京燦精密機(jī)械有限公司上海)，制備雞細(xì)管凍精。冷凍程序?yàn)閺? ℃至-35 ℃，速率為7 ℃/min，-35 ℃至-120 ℃，速率為9 ℃/min，最后投入液氮保存，冷凍7 d后進(jìn)行后續(xù)研究。精液解凍時(shí)將冷凍保存的精液在37 ℃水浴解凍40 s。

1.2.2精液活力和活率的檢測

精液的活力通過偉力精子分析儀進(jìn)行精液活力的檢測(WLJY-9000型，偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)，北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司，北京)。每個樣品重復(fù)測量3次，取均值代表樣品精子活力?；盥实臋z測利用伊紅-苯胺黑染色方法。精子冷凍-解凍后置于1.5 mL離心管中，滴加1～2滴伊紅染色液，混勻，放置30 min。滴加苯胺黑染色液3滴，混勻，放置30～60 s制成精液-伊紅-苯胺黑染色液。滴加精子-伊紅-苯胺黑染色液1滴于載玻片，制成涂片，晾干后在40倍油鏡下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對載玻片的兩端及中間部位分別計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)200個精子，共600個精子，求出平均數(shù)。未著色的精子為活精子。

1.2.3總RNA的提取、質(zhì)量檢測和純化

將2組凍精解凍后的各18支精液隨機(jī)分為3組，等量混勻，然后采用密度梯度離心法進(jìn)行純化。純化后的精液去除緩沖液，并至于冰上30 min使用體細(xì)胞裂解液處理。

按照Trizol試劑盒的說明書，采用Trizol法提取精液中的總RNA。RNA的純度使用OD260/OD280值、OD260/OD230值和1%的凝膠電泳評估。使用分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度。使用脫氧核糖核酸酶Ⅰ去除總RNA中的DNA。測得RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0，OD260/OD230值在2.0～2.2。滿足Affymetrix公司全基因表達(dá)譜芯片使用標(biāo)準(zhǔn)的RNA進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

1.2.4芯片雜交

采用Affymetrix公司雞全基因表達(dá)譜芯片(購自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)，共包含38 535個探針。純化后的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成first strand cDNA和second strand DNA后，形成雙鏈DNA。以second strand cDNA為模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，摻入生物素Biotin。使用磁珠純化cRNA，除去鹽、酶等雜質(zhì)，并對cRNA進(jìn)行定量。將cRNA片段化成適宜雜交的大小以備雜交使用。根據(jù)Affymetrix公司相應(yīng)試劑盒，將cRNA與芯片進(jìn)行雜交。并進(jìn)一步對芯片進(jìn)行清洗、染色和掃描。使用AGCC軟件將芯片的熒光掃描圖像保存分析。

1.2.5qPCR結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選擇了5個 DEG進(jìn)行qPCR檢測。采用AriaMx G8830A qPCR系統(tǒng)(美國安捷倫科技公司)并按照制造商的說明，使用TransStart?Top Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech，北京)進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

使用Expression Console軟件(Affymetrix)將文件的圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，即每個探針的熒光信號強(qiáng)度。使用RMA算法將數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和歸一化。使用SAM R程序包分析DEG，DEG的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：q-value≤0.05且Fold change≥2或≤0.5。使用Molecule Annotation System對DEG進(jìn)行基因功能(Gene ontology, GO)和KEGG通路富集分析，顯著的閾值為P≤0.05。驗(yàn)證結(jié)果使用SPSS版本10.0(IBM Corporation，NY) t-test進(jìn)行對不同組之間的精子活力進(jìn)行差異顯著性分析。P<0.05表示在兩組之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗凍保護(hù)劑凍后精子活力檢測

由表2 得知，保護(hù)劑Ⅰ組的精子活力27.05±1.22高于保護(hù)劑Ⅱ組20.65±1.50，且差異顯著(P<0.05),而且，保護(hù)劑Ⅰ組的精子凍后活率47.65±5.89明顯高于保護(hù)劑Ⅱ組35.15±5.15。表明保護(hù)劑Ⅰ的冷凍效果明顯高于保護(hù)劑Ⅱ，更適合海蘭褐種公雞精液冷凍保存。

2.2 不同抗凍保護(hù)劑冷凍解凍后精液差異表達(dá)基因分析

為了研究不同抗凍保護(hù)劑對雞精液冷凍-解凍后基因表達(dá)的情況，本研究采用雞全基因組表達(dá)譜芯片鑒定保護(hù)劑Ⅰ和保護(hù)劑Ⅱ中精子的基因表達(dá)情況(每組3個重復(fù))。經(jīng)掃描分析信號后，38 535個探針被檢測到在雞精液中表達(dá)，其中的73.73%注釋到雞的基因上。對雞精液基因表達(dá)進(jìn)行主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑Ⅰ和保護(hù)劑Ⅱ的樣本被明顯的區(qū)分開(圖1)。通過解凍后兩組間的比較，發(fā)現(xiàn)了1 604個基因在兩組中顯著差異表達(dá)(|log2(FC)|>1;q-value<0.05)，與保護(hù)劑Ⅱ相比，在保護(hù)劑Ⅰ組中高表達(dá)1 380個基因，低表達(dá)224個基因(圖2)。

表1 本研究中的引物信息Table 1 Information of primers in the study

表2 不同抗凍保護(hù)劑組間精液凍后活力活率Table 2 Sperm viability after freezing in different cryoprotectants groups

圖1 不同樣本間基因表達(dá)水平的PCA分析Fig.1 PCA analysis of gene expression levels among different samples

圖中橫坐標(biāo)表示樣品間的差異倍數(shù)對數(shù)值，縱坐標(biāo)表示2個樣品的-lg(FDR)值。紅色表示保護(hù)劑Ⅰ相對于保護(hù)劑Ⅱ表達(dá)量上調(diào)的基因，綠色表示表達(dá)量下調(diào)的基因，藍(lán)色表示沒有差異的基因。The abscissa represents the logarithm of the difference between the samples, and the ordinate represents the -lg (FDR) value of the two samples. Red indicates up-regulated genes in cryoprotectant Ⅰ compared with cryoprotectant Ⅱ, green indicates down-regulated genes, and blue indicates no difference.圖2 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.2 Volcano map of differentially expressed genes

2.3 差異表達(dá)基因功能分析

為了解DEG涉及的生物學(xué)功能，使用超幾何檢驗(yàn)的方法對DEG進(jìn)行GO(Gene ontology)和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路的功能富集分析。富集GO條目的結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3個方面共發(fā)現(xiàn)622個顯著富集的GO條目(q<0.05)。主要參與核糖體合成、線粒體組成及功能調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合、微管蛋白活性、蛋白質(zhì)靶向翻譯和mRNA分解代謝等過程(表2)。對DEG進(jìn)行KEGG通路功能富集分析，共鑒定出18個顯著的通路，其中包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路、氧化磷酸化、蛋白質(zhì)泛素化、核糖體調(diào)控以及線粒體呼吸調(diào)控等通路(圖3)。

富集因子：參與通路的DEG數(shù)與該通路總基因數(shù)的比值。Enrichment factor: the ratio of the number of DEG involved in the pathway to the total number of genes in the pathway.圖3 DEG富集的顯著通路Fig.3 The pathways involved by differentially expressed genes

2.4 qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

通過對芯片結(jié)果的相關(guān)分析，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的研究進(jìn)展，從差異表達(dá)基因中挑選了CIRBP、CCND1、RHOA、HSP90和HSP70這5個基因，并對其進(jìn)行qPCR的驗(yàn)證。由圖4可知，目的基因的qPCR檢測結(jié)果雖然與表達(dá)譜芯片的檢測結(jié)果數(shù)值上有些差異，但是整體趨勢是完全一致的。經(jīng)過qPCR的驗(yàn)證對比可知，表達(dá)譜芯片的檢測結(jié)果基本可靠，所篩選出來的差異表達(dá)基因基本符合其真實(shí)表達(dá)情況。

3 討 論

隨著養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展,雞人工授精技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。作為人工授精技術(shù)發(fā)展的重要環(huán)節(jié),雞精液抗凍保護(hù)劑直接影響該技術(shù)的應(yīng)用。該技術(shù)水平的高低直接影響優(yōu)良種公雞的利用效率和養(yǎng)雞生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。用于精液冷凍保存的抗凍保護(hù)劑本質(zhì)上有助于在冷凍過程中和冷凍后維持精子的結(jié)構(gòu)和功能[7]。很少有研究比較抗凍保護(hù)劑間在雞精液冷凍過程中的效果。抗凍保護(hù)劑Ⅰ已廣泛應(yīng)用到雞冷凍精液中，而抗凍保護(hù)劑Ⅱ在松雞外的其他家禽中很少報(bào)道。因此本研究比較了這2種抗凍保護(hù)劑凍后精液的差異基因的表達(dá)情況，篩選出更為合適的海蘭褐種公雞精液抗凍保護(hù)劑，并闡明其抗凍機(jī)制。

能量代謝直接影響精子的冷凍保存[8]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)精子線粒體是冷凍保存過程中受損最嚴(yán)重的細(xì)胞器之一，很可能是由于凍融后運(yùn)動力和生育力喪失，而通過上調(diào)線粒體呼吸鏈調(diào)節(jié)酶的活性，可以增強(qiáng)精子活力[9]。本研究通過對2種抗凍保護(hù)劑DEG進(jìn)行KEGG通路功能富集分析，發(fā)現(xiàn)了一些與能量代謝相關(guān)的途徑，如線粒體呼吸調(diào)控，氧化磷酸化，內(nèi)源性大麻素信號通路，與之相關(guān)的基因包括NADH脫氫酶(NADH dehydrogenase)，泛醇-細(xì)胞色素c還原酶(Ubiquinol cytochrome C reductase)，ATP合酶(ATP synthase)，細(xì)胞色素b(Cytochrome b)和琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase)等。這些基因的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致了2種保護(hù)劑間精子活性差異的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，凍融處理影響了雞精子線粒體呼吸鏈酶的表達(dá)，進(jìn)而減少了ATP的生成，從而阻斷了精子運(yùn)動的能量來源，其背后的具體調(diào)節(jié)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

表3 差異表達(dá)基因最顯著富集的GO條目Table 3 GO entries with the most significant enrichment of differentially expressed gene

圖4 表達(dá)譜芯片與qPCR中各基因差異表達(dá)情況Fig.4 Different expression of each gene in expression profile chip and qPCR

精子發(fā)生是一個高度復(fù)雜而獨(dú)特的分化過程。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因在精子發(fā)生中起重要作用。細(xì)胞周期蛋白及其依賴細(xì)胞周期蛋白激酶CDK是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10]。細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)在細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮特定作用。對小鼠精原細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT和MAPK信號通路在CCND1的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11]。在本研究中，在細(xì)胞周期途徑中顯著富集了17個DEG，包括CCND1、CDK4、CDK6和CDKN1B等。結(jié)果表明，這些基因不僅參與細(xì)胞周期調(diào)控，而且選擇性的保留在成熟精子中，并且可能與精子的抗凍結(jié)能力有關(guān)。細(xì)胞周期調(diào)控基因水平的降低是否會導(dǎo)致凍融后雞精子活力的下降，尚需進(jìn)一步研究。

HSP90和HSP70同屬于HSPs(熱應(yīng)激蛋白)家族。70 ku熱休克蛋白(HSP70)在生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能調(diào)節(jié)中具有重要作用[12]。70 ku熱休克蛋白2(HSPA2)已被證明對小鼠精子發(fā)生過程中生殖細(xì)胞分化的進(jìn)展至關(guān)重要[13]。最近研究發(fā)現(xiàn)，同樣在雄性生殖系統(tǒng)中高度表達(dá)的HspA1L作為絲氨酸/蘇氨酸激酶MAPKAP激酶2(MK2)的底物，通過P38 MAPK信號通路在精子的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[14]。90 kDa熱休克蛋白(HSP90)已發(fā)現(xiàn)其位于所有檢查物種的精子尾巴中，并在精子繁殖力中起關(guān)鍵作用[15]。Casas等[16]研究表明,在豬精液冷凍保存前進(jìn)行低溫平衡、添加保護(hù)劑過程時(shí)，抗凍組的公豬HSP90基因的表達(dá)量顯著高于不抗凍組，這可能是精子在適應(yīng)冷應(yīng)激所做出的反應(yīng)。同樣，王紅等[17]研究表明，HSP90蛋白的含量與凍后牛精子的活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性之間存在一定的正相關(guān)，可能與冷凍過程中相關(guān)抗凍蛋白的降解有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP90和HSP70的mRNA水平在2種抗凍保護(hù)劑凍后表現(xiàn)出顯著差異，而且凍后精子活力高的保護(hù)劑Ⅰ中HSP90和HSP70較保護(hù)劑Ⅱ顯著上調(diào)，提示保護(hù)劑Ⅰ具有更好的抗凍保護(hù)效果，可以更好的應(yīng)用到海蘭褐種公雞精液的冷凍保存中。然而HSP90蛋白改善解凍后精子活力和活率的潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRBP)，是冷休克蛋白的一種，參與細(xì)胞功能所需的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。CIRBP高表達(dá)時(shí)維持正常的生精功能，而在精子冷凍后顯著下調(diào)，導(dǎo)致有絲分裂或減數(shù)分裂紊亂，生精細(xì)胞過度凋亡，引起各種機(jī)能紊亂[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與保護(hù)劑Ⅰ相比，凍融處理后保護(hù)劑Ⅱ中CIRBP的mRNA水平顯著下降，這表明抗凍保護(hù)劑Ⅰ更適合海蘭褐種公雞精液的冷凍保存。不過由于相關(guān)研究報(bào)道較少，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抗凍保護(hù)劑Ⅰ更適合海蘭褐種公雞的精液保存，并通過采用表達(dá)譜芯片技術(shù)，篩選出不同抗凍保護(hù)劑凍后精子的差異表達(dá)基因1 604個，主要參與線粒體調(diào)節(jié)、氧化磷酸化、核糖體調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期循環(huán)等生物學(xué)過程和物質(zhì)能量的新陳代謝、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與凋亡等通路。這些差異表達(dá)基因(如CCND1、HSP70、HSP90、RHOA和CIRBP)的變化可能影響不同抗凍保護(hù)劑的抗凍效果，為雞精液抗凍保護(hù)劑的選擇及其抗凍機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。