安夢如，黃 嬋，王 錦，王銀妃，盛曉靜，張愛青，甘衛(wèi)華，殷 勤

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 南京 210003)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是目前社會共同關(guān)注的疾病[1]，系膜細胞增殖引起的腎臟纖維化及腎小球硬化是CKD的常見病理改變[2]。大量研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)在腎臟系膜細胞增殖、纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-4]。1，25二羥基維生素D3[1,25-(OH)2D3]是維生素D的生物活性形式，可通過多種方式保護腎臟，延緩CKD的發(fā)生和發(fā)展[5]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類以轉(zhuǎn)錄長度超過200nt、不編碼蛋白為特征的新型RNA分子，lncRNA能夠以多種方式在生命有機體的分子信號通路中發(fā)揮調(diào)控作用[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-uc.412可受TGF-β1調(diào)控，在增殖的系膜細胞中表達升高[7]。本研究通過構(gòu)建TGF-β1處理的大鼠系膜細胞作為增殖模型，探討1,25-(OH)2D3與lncRNA-uc.412在系膜細胞增殖中的作用及可能的機制，以期為CKD的診治提供更加精準的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.2 主要實驗試劑 MTT試劑、1,25-(OH)2D3購于Sigma公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，lncRNA-uc.412慢病毒購自吉凱公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購于Takara公司，PCR引物由上海銳真生物合成,TGF-β1購于novoprotein公司,SIS3購于MCE公司，DMSO購于Biofroxx公司，細胞周期試劑盒購于US EVERBRIGHT公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 系膜細胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜細胞株復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素100 μL/mL，鏈霉素100 μL/mL)，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長至70%～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)，細胞傳代培養(yǎng)至第3～8代用于實驗。收集對數(shù)期大鼠系膜細胞，以1×104個/mL接種于96孔板內(nèi)，每孔200 μL，待細胞貼壁后，無血清DMEM同步化24h后，再進行細胞干預(yù)處理48 h并按實驗要求分組，用TGF-β1(10 ng/mL)、1,25-(OH)2D3(10-8mol/L)干預(yù)分組：正常對照組、TGF-β1組、VD組、TGF-β1+VD組。用smad 3磷酸化特異性抑制劑SIS3(1 μmol/L)與TGF-β1(10 ng/mL)干預(yù)分組：正常對照組、TGF-β1組、TGF-β1+SIS3組、SIS3組。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測各組系膜細胞增殖情況 于各組結(jié)束干預(yù)前4 h，向每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去除上清，加入DMSO，室溫避光振蕩10 min后，使紫色結(jié)晶溶解，用酶標儀測定各孔在490 nm波長處的吸光度值(A490)，每組設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)置空白調(diào)零孔(只加DMEM溶液+MTT+DMSO)，以上實驗重復(fù)3次，并按下列公式計算各組細胞增殖：細胞增殖率(細胞活力)=(A實驗組-A空白對照)/(A陰性對照-A空白對照)×100%。

1.3.3 Real-time PCR法檢測目的基因的表達 收集各組細胞，根據(jù)RNA提取說明書，Trizol試劑分別提取總RNA，測RNA濃度；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，配置10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，制備cDNA；以β-actin作為內(nèi)參，參照PCR試劑盒說明書進行Real-time PCR。反應(yīng)體系為20 μL(SYBR 5 μL，上下游引物各0.4 μL，Rox 0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL)；反應(yīng)條件為預(yù)變性：95℃ 30 s；變性：95℃ 5 s；退火：60℃ 34 s；延伸：60℃ 1 min，40個循環(huán)，根據(jù)溶解曲線分析擴增產(chǎn)物的特異性，2-△△CT法計算其相對表達量。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 收集各組細胞，加入75%冰乙醇，吹打均勻，-20℃固定過夜，上機前再次離心，加1 mL冰浴預(yù)冷的PBS重懸細胞，配制碘化丙啶染色液，每管加入500 μL碘化丙啶染色液,緩慢并充分重懸細胞沉淀,37℃避光孵育30 min后流式細胞儀檢測細胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.3.5 Western blot法檢測目的蛋白表達 收集各組細胞，按100∶1加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，離心后吸取上層液體用BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度。每組蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、5%脫脂牛奶封閉，加一抗(濃度1∶1 000)于4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加二抗(濃度1∶5 000)室溫孵育1h，TBST漂洗3次后ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)進行圖像掃描記錄。以GAPDH作為內(nèi)參，用Image J進行灰度值分析，計算目的蛋白的相對表達量。

1.3.6 lncRNA-uc.412過表達慢病毒轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的系膜細胞按1×105/孔接種于6孔板，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換用無血清DMEM同步化24 h后，待細胞融合率達60%～70%左右，加入lncRNA-uc.412(2×107TU/mL)過表達病毒液、1,25-(OH)2D3(10-8mol/L)干預(yù)分組，繼續(xù)37℃培養(yǎng)48 h，構(gòu)建lncRNA-uc.412過表達模型，分為對照組、過表達(uc.412)組與uc.412+VD組。

2 結(jié)果

2.1 1,25-(OH)2D3對TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細胞增殖率的影響 MTT結(jié)果可見，TGF-β1組系膜細胞數(shù)量多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+VD組細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

與對照組相比，**P<0.01；與TGF-β1組相比，## P<0.01。F=56.020，P<0.001。

2.2 1,25-(OH)2D3對TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細胞增殖相關(guān)基因及l(fā)ncRNA-uc.412的表達影響 如圖2A～C所示，與對照組比較，TGF-β1組ki67、PCNA mRNA表達量增加，抑制性周期蛋白p27 mRNA表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+VD組ki67、PCNA mRNA的表達量下降，p27 mRNA表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。如圖2D所示，TGF-β1組的lncRNA-uc.412的表達量較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；TGF-β1+VD組的lncRNA-uc.412的表達量較TGF-β1組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

與對照組相比，**P<0.01；與TGF-β1組相比，## P<0.01。FA=9.908，PA=0.001；FB=89.647，PB<0.001；FC=64.911，PC<0.001；FD=88.690，PD<0.001。

2.3 1,25-(OH)2D3對腎小球系膜細胞周期的影響 與對照組比較，TGF-β1組G1期細胞百分率減少，G2、S期細胞百分率增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+VD組G1期細胞百分率增多，G2、S期細胞百分率減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 1,25-(OH)2D3對細胞周期的影響

2.4 SIS3對TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細胞lncRNA-uc.412表達的影響 與對照組相比，TGF-β1組的p-smad3蛋白表達升高；與TGF-β1組比較，TGF-β1+SIS3組p-smad3蛋白的表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3A、B)。各組smad3蛋白的表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3C)。與對照組比較，TGF-β1組lncRNA-uc.412的表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+SIS3組lncRNA-uc.412的表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3D)。

與對照組相比，**P<0.01；與TGF-β1組相比，## P<0.01。FB=24.030，PB<0.001；FC=3.414，PC=0.053；FD=56.790，PD<0.001。

2.5 1,25-(OH)2D3對系膜細胞lncRNA-uc.412過表達后增殖相關(guān)基因的表達影響 與對照組比較，uc.412組ki67、PCNA mRNA的表達量增加，p27 mRNA表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與uc.412組比較，uc.412+VD組ki67、PCNA mRNA表達量下降，p27 mRNA表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4A～C。

與對照組比較，**P<0.01；與TGF-β1組比較，## P<0.01。FA=12.130，PA<0.001；FB=88.190，PB<0.001；FC=15.770，PC<0.001。

3 討論

腎小球系膜細胞的異常增殖，可引起腎臟纖維化，導(dǎo)致終末期腎病[2,8]。這是許多腎小球疾病的共同特征，其機制尚未完全闡明，臨床目前尚無有效治療方法。因此，亟待從分子和細胞的角度尋找抑制系膜細胞異常增殖的靶點。1,25-(OH)2D3是鈣、磷代謝的重要物質(zhì)，近來發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3還可對多種細胞的異常增殖起抑制作用。Mizgalski等[9]發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2D3可抑制頭頸部鱗狀細胞癌的增殖。Jamali等[10]發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3是視網(wǎng)膜新生血管形成的有效抑制劑。Zhang等[11]研究表明，1,25-(OH)2D3可抑制EGF誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞的增殖。本研究以大鼠腎小球系膜細胞為研究對象，通過TGF-β1干預(yù)系膜細胞，成功構(gòu)建系膜細胞增殖模型，添加1,25-(OH)2D3后發(fā)現(xiàn)ki67、PCNA表達下調(diào)，p27表達上調(diào)，細胞增殖率下降，并將其細胞周期阻滯于G1期。提示1,25-(OH)2D3可抑制TGF-β1所致的大鼠系膜細胞增殖，其機制可能與阻滯細胞周期有關(guān)。

lncRNA既往被認為沒有生物學(xué)作用[12]，但近來發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、信使RNA降解等多種方式參與調(diào)控各種生命活動[13-14]。在腎臟病學(xué)領(lǐng)域，已有多項研究報道相關(guān)lncRNA的顯著高表達，Ren等[14]報道lncRNA PVT1、lncRNA-PRINS、TapSaki等lncRNAs在急性腎損傷中高表達。Li等[15]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-NOP14-AS1和lncRNA-HCP5在CKD中特異性高表達。TGF-β1是腎小球系膜細胞異常增生的關(guān)鍵因子[16]，TGF-β1/smad3信號通路參與了系膜細胞的異常增殖及腎小球硬化。本課題組前期在體外TGF-β1誘導(dǎo)系膜細胞增生模型中，發(fā)現(xiàn)多個lncRNAs的表達存在差異，其中l(wèi)ncRNA-uc.412的表達水平與系膜細胞增殖程度顯著相關(guān)[7，17]。本研究用TGF-β1處理大鼠系膜細胞，可觀察到細胞增殖率升高，且lncRNA-uc.412的表達量增加，這與我們前期研究結(jié)果相符。并且，我們發(fā)現(xiàn)過表達lncRNA-uc.412后，ki67、PCNA的表達上調(diào)，p27的表達下調(diào)，這說明TGF-β1可通過介導(dǎo)lncRNA-uc.412的表達，促進系膜細胞增殖。而1,25-(OH)2D3與TGF-β1共同干預(yù)后，lncRNA-uc.412的表達下調(diào)；過表達lncRNA-uc.412后，用1,25-(OH)2D3干預(yù)發(fā)現(xiàn)ki67、PCNA的表達下調(diào)，p27的表達上調(diào)。這表明，1,25-(OH)2D3可能通過下調(diào)lncRNA-uc.412的表達水平抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞增殖。

綜上所述，1,25-(OH)2D3可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞增殖，其機制可能與1,25-(OH)2D3阻滯細胞周期及下調(diào)lncRNA-uc.412的表達有關(guān)。但1,25-(OH)2D3是否通過其他途徑抑制系膜細胞增殖，lncRNA-uc.412調(diào)控系膜細胞增殖的深層機制，還有待于進一步研究。