耿薇薇 孫 軍 潘 靚 沙圓圓 王思齊 邱建國

鐵是人體中最重要的微量元素之一，參與體內(nèi)多種代謝途徑。鐵在人體內(nèi)分布廣泛，包括肝臟、心臟、腎臟等多種器官［1］。然而過量的鐵通過一系列催化反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥，進(jìn)而引起腎臟結(jié)構(gòu)及功能的損傷［2］。MRI是目前無創(chuàng)評估機(jī)體鐵含量的重要工具，利用、等對順磁性物質(zhì)鐵的敏感性高的特性，來評價機(jī)體內(nèi)的鐵沉積［3］，臨床上主要應(yīng)用于肝臟、心肌等部位，而對腎臟鐵沉積的可行性評價較少。當(dāng)組織內(nèi)脫氧血紅蛋白、含鐵血黃素等順磁性物質(zhì)增多時會引起值的縮短、值（=1/）的增大。因此，血氧水平依賴成像（blood oxygen level-dependent，BOLD） 可通過值反映腎臟氧含量水平及組織鐵沉積情況［4］。本研究擬建立兔腎臟鐵過載模型，通過MR血氧水平依賴成像初步評價兔腎臟鐵過載病理變化的可行性。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動物和模型建立

本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。選用純種健康新西蘭大白兔24只（蘇州湖橋生物科技有限公司提供），體質(zhì)量為2.0～2.5 kg，采用隨機(jī)區(qū)組法分為對照組（n=12）和鐵過載組（n=12）。鐵過載組兔經(jīng)后腿肌內(nèi)一次注射60 mg/kg右旋糖酐鐵（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）。對照組后腿肌內(nèi)注射同等劑量0.9%生理鹽水。實(shí)驗(yàn)兔肌內(nèi)注射后單籠飼養(yǎng)12周，自由進(jìn)食飲水。

2.MRI檢查

所用儀器為Siemens Magnetom Verio 3.0 T磁共振掃描儀，采用8通道腹部線圈。由于右腎位置較高，右腎BOLD圖像受呼吸運(yùn)動及腸道氣體等影響顯著，所以本實(shí)驗(yàn)僅掃描左腎。2組實(shí)驗(yàn)兔分別于肌內(nèi)注射后即刻（0周）及第12周行MRI掃描。檢查前實(shí)驗(yàn)兔禁食禁水8 h。所有實(shí)驗(yàn)兔麻醉后取左側(cè)臥位置于MR檢查床上固定，置沙袋于腹部兩側(cè)。掃描范圍從左腎上極至下極，軸位掃描定位線垂直左腎長軸，中心位于左腎門水平。

MRI掃描序列：①冠狀位T2WI采用單次激發(fā)半傅里葉采集快速自旋回波（half acquisition single-shot turbo spin echo，HASTE）序列，重復(fù)時間（TR）/回波時間（TE）1400.0 ms/93.0 ms，視野（FOV）154 mm×219 mm，矩陣126×256，層厚3 mm，層間距0.9 mm，翻轉(zhuǎn)角160°，帶寬781 Hz/像素，掃描時間14 s。②軸位T2WI采用HASTE序列，TR/TE1 000.0 ms/108.0 ms，F(xiàn)OV130 mm×130 mm，矩陣179×256，層厚4 mm，層間距0 mm，翻轉(zhuǎn)角138°，帶寬199 Hz/像素，掃描時間98 s。③軸位BOLD，TR/TE 561 ms/11.2 ms；FOV130 mm×130 mm；矩陣218×256；層厚4 mm；層間距0.8 mm；翻轉(zhuǎn)角20°；帶寬331 Hz/像素；掃描時間737 s。BOLD掃描完成后工作站自動生成map。

3.圖像分析

所有圖像分析在Siemens Sygno工作站進(jìn)行。由2名具有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的泌尿系統(tǒng)影像診斷醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立完成圖像分析，如有不同意見則協(xié)商一致。對照軸位T2WI圖像，選擇左腎門水平map圖像進(jìn)行分析。由于內(nèi)髓與腎盂及腎門結(jié)構(gòu)無法區(qū)分，數(shù)據(jù)測量不穩(wěn)定，因此未納入本研究圖像分析。參考T2WI，2名診斷醫(yī)師沿皮質(zhì)（cortex，CO）及外髓（outer medulla，OM）邊緣勾畫感興趣區(qū)（region of interest，ROI）測量皮質(zhì)及外髓的值，根據(jù)公式=1計算值，并計算外髓值（medullary，）與皮質(zhì)值（cortical，）的比值（MCR=/）。

4.病理組織學(xué)檢查

2組實(shí)驗(yàn)兔于肌內(nèi)注射后第12周MR掃描后分別處死，取出左腎，用10%甲醛固定24 h取材，石蠟包埋，在垂直于左腎長軸的腎門水平切片，行HE染色、普魯士藍(lán)染色和Masson染色。在HE染色圖上觀察腎臟損傷情況，在普魯士藍(lán)染色圖上觀察鐵分布情況（陽性呈藍(lán)染），在Masson染色圖上觀察腎間質(zhì)纖維化情況。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)評價計量資料是否符合正態(tài)分布，若符合正態(tài)分布，則使用xˉ±s表示，若不符合正態(tài)分布，則用中位數(shù)（四分位間距）表示。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較肌內(nèi)注射后0周及第12周對照組與鐵過載組間值的差異；采用Wilcoxon檢驗(yàn)分別比較對照組及鐵過載組實(shí)驗(yàn)兔肌內(nèi)注射后0周與第12周值的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MRI-BOLD圖像表現(xiàn)

圖1 鐵過載組和對照組左腎血氧水平依賴（BOLD）圖像

2.對照組及鐵過載組值的差異

表1 對照組和鐵過載組腎臟皮髓質(zhì)值比較

表1 對照組和鐵過載組腎臟皮髓質(zhì)值比較

正態(tài)分布資料用xˉ±s表示，偏態(tài)分布資料用M（P25，P75）表示。

組別images/BZ_98_1547_1473_1591_1517.png值（0周）images/BZ_98_1547_1473_1591_1517.png值（12周）皮質(zhì) 外髓MCR皮質(zhì) 外髓MCR正常組22.54（20.12，25.32）29.82±2.361.32±0.0821.08±1.3128.89±1.421.37±0.08鐵過載組23.49（21.41，25.19）30.35±1.721.30±0.0830.36±5.1433.57±4.881.12±0.13 P值0.2250.5310.440＜0.0010.003＜0.001

圖2 鐵過載組在0周及12周時值的比較

3.病理組織學(xué)結(jié)果

鐵過載組HE染色顯示腎小球毛細(xì)血管及腎小管間質(zhì)內(nèi)可見少許炎性細(xì)胞浸潤，部分腎小管上皮細(xì)胞水腫變性，胞質(zhì)疏松淡染（圖3A）；普魯士藍(lán)染色呈陽性，腎小球及腎小管可見較多藍(lán)染顆粒（圖3B）；Masson染色顯示腎間質(zhì)可見少許藍(lán)染的膠原纖維沉積（圖3C）。對照組HE染色顯示腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常（圖3D）；普魯士藍(lán)染色呈陰性，未見明顯藍(lán)染顆粒（圖3E）；Masson染色顯示腎間質(zhì)內(nèi)未見明顯藍(lán)染膠原纖維沉積（圖3F）。

圖3 鐵過載組和對照組左腎病理表現(xiàn)

討 論

鐵是人體細(xì)胞所必需的微量元素，在正常生理狀態(tài)下，鐵的攝入與排泄是保持平衡的［5］。過量的鐵會在肝、腎、胰腺、心肌和內(nèi)分泌腺等實(shí)質(zhì)器官內(nèi)沉積，導(dǎo)致組織損傷和纖維化。腎臟作為人體重要器官，對于機(jī)體體液調(diào)節(jié)、維持電解質(zhì)平衡具有重要作用［6］。當(dāng)腎臟鐵負(fù)荷過多時，可引起氧化應(yīng)激及全身炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常［7］。雖然腎臟內(nèi)鐵沉積量相對較少，但在以往的研究發(fā)現(xiàn)少量的鐵沉積也會損害器官功能［8］，目前針對腎臟鐵過載的檢測方法研究較少，但其臨床意義不可忽視。因此，探索、尋找腎臟鐵過載的無創(chuàng)性檢測方法具有較高的臨床意義。

血氧水平依賴磁共振成像是一種無創(chuàng)性氧合評估方法，該技術(shù)對含鐵血黃素、脫氧血紅蛋白等順磁性物質(zhì)敏感，這類順磁性物質(zhì)增多會導(dǎo)致橫向馳豫率增加而引起值增大。脫氧血紅蛋白增多、值升高，又反映了組織氧合水平的減低。因此BOLD-MRI不僅可以反映組織鐵沉積情況，還可以間接反映組織氧合水平。部分研究［9］指出，值在評估心臟、肝臟鐵過載方面具有可行性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。陳釔地等［10］針對重型β地中海貧血患者的一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)肝臟值與肝鐵濃度呈高度負(fù)相關(guān)，提示值可以很好地反映肝臟鐵含量。Grassedonio等［11］的研究指出，在腎臟鐵過載的測量上是可行的，且具有可重復(fù)性。本研究采用值作為評價指標(biāo)，并且計算了外髓值與皮質(zhì)值的比值（MCR值），MCR值可以在一定程度上減少外在因素對值的影響。

Naito等［12］通過建立慢性腎臟病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)鐵螯合劑可減輕慢性腎臟病大鼠腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，提出腎鐵沉積似乎與腎間質(zhì)纖維化有關(guān)。Ikeda等［13］的研究結(jié)果顯示去鐵胺可減輕單側(cè)輸尿管梗阻小鼠的腎間質(zhì)纖維化，其在輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的保護(hù)作用包括抑制氧化應(yīng)激、炎癥以及促纖維化信號。查婷婷等［14］通過構(gòu)建兔輸尿管梗阻模型，發(fā)現(xiàn)兔腎臟皮髓質(zhì)值隨著兔腎纖維化程度的進(jìn)展而升高，提出BOLD可以通過反映腎臟氧合水平而間接反映腎臟纖維化的進(jìn)展過程。從以往文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)，腎臟鐵過載可以引起腎間質(zhì)纖維化，值不僅可以反映腎臟鐵過載程度，同時也可以反映腎臟纖維化程度。

此外，本研究結(jié)果顯示肌內(nèi)注射鐵劑后第12周，鐵過載組兔腎的MCR值較對照組減低，表明第12周時鐵過載組兔腎皮質(zhì)值的增加較髓質(zhì)值的增加更加明顯。該結(jié)果表明過量的鐵主要沉積在皮質(zhì)區(qū)域，可能是由于鐵代謝經(jīng)過腎小球?yàn)V過及腎小管重吸收的過程主要在腎皮質(zhì)內(nèi)完成，當(dāng)鐵過載引起腎臟損傷時，多余的鐵沉積在腎皮質(zhì)內(nèi)。

本研究存在的不足之處：①樣本量較少，實(shí)驗(yàn)兔可能存在個體差異性，需加大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性及穩(wěn)定性；②本實(shí)驗(yàn)僅針對BOLD評估腎鐵沉積的可行性進(jìn)行研究，未對鐵沉積程度進(jìn)行研究，后續(xù)將在更長時間及更大鐵劑量的條件下觀察過量鐵沉積對腎臟可能造成的病理及影像學(xué)改變。

綜上所述，MR血氧水平依賴成像所得觀察指標(biāo)腎皮髓質(zhì)偽彩圖改變、腎皮質(zhì)及外髓增高、MCR值減低等表現(xiàn)，可以成為評價鐵過載介導(dǎo)腎臟損傷的無創(chuàng)性檢測方法。