重組大腸桿菌全細(xì)胞催化合成L-苯乳酸

邵宇，張顯，胡孟凱，魏玉霞，楊套偉，徐美娟，邵明龍，高敏杰,饒志明

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸[1]，是一種小分子天然有機(jī)酸，廣泛存在于干酪、天然蜂蜜中。溶解性良好，具有耐酸、耐堿、耐高溫等特性[2]，并能有效的抑制食腐性微生物[3]的生長(zhǎng)，在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。L-苯乳酸(L-PLA)作為PLA兩種對(duì)映異構(gòu)體中的一種，是合成許多藥物制劑的前體[4]。

合成L-PLA方法主要為化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵和生物催化合成?；瘜W(xué)合成法[5]技術(shù)路線復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻，易產(chǎn)生環(huán)境污染，后續(xù)分離困難，不易純化。微生物發(fā)酵法[6]通過(guò)微生物分解與合成代謝生產(chǎn)PLA。由于其發(fā)酵周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基利用率不高，生產(chǎn)效率低，不具工業(yè)利用價(jià)值?；蚬こ毯偷鞍踪|(zhì)工程[7]的發(fā)展使得生物催化技術(shù)得到廣泛的運(yùn)用。XU等[8]通過(guò)在大腸桿菌中共表達(dá)源于干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的酮酸還原酶(LcKAR)和葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH)，以苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，PPA)為底物不對(duì)稱合成PLA，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到10.12 g/(L·h)。LUO等[9]研究中以PPA為底物目前產(chǎn)量達(dá)到20.5 g/L。近幾年以PPA為底物合成PLA的研究較多，關(guān)于苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)一步合成PLA的報(bào)道相對(duì)較少，且PPA價(jià)格偏高，挖掘能夠成本低廉并高效轉(zhuǎn)化的生物催化合成PLA方法是未來(lái)研究亟待解決的問(wèn)題。

L-氨基酸脫氨酶(L-amino acid deaminase，L-AAD)可以用來(lái)催化Phe生成PPA，L-AAD有廣泛的底物特異性[10]，對(duì)疏水性氨基酸有顯著催化特性，L-AAD是膜蛋白[11]，更有利于制備全細(xì)胞催化劑。苯丙酮酸還原酶(phenylpyruvate reductase,LaPPR)是一種還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide health，NADH)依賴型的氧化還原酶，具有對(duì)芳香族和脂肪族酮酸的底物偏好[12]。本研究首次將L-AAD和LaPPR用于催化L-苯丙氨酸(L-Phe)合成L-PLA?？紤]到還原性輔酶NADH穩(wěn)定性差，價(jià)格昂貴，提高成本，不適合外源添加[13]，其中，GDH和甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase , FDH)是構(gòu)建輔酶再生體系最常用的酶[14]，通過(guò)對(duì)輔酶再生酶的篩選，制備全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化合成PLA。旨在為L(zhǎng)-PLA生產(chǎn)建立一種簡(jiǎn)潔、高效、經(jīng)濟(jì)的生物催化合成方法，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)及質(zhì)粒pET-28a均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 酶和試劑

Hind Ⅲ、NotⅠ、XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶與DNA聚合酶，TaKaRa公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、同源重組試劑盒和膠回收試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司；L-Phe、L-苯丙酮酸、L-PLA，國(guó)藥集團(tuán)；酵母提取物和胰蛋白胨，英國(guó)Oxoid 公司。所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB種子培養(yǎng)基(g/L)[15]：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[15]：蛋白胨 12，酵母粉 24，甘油5，KH2PO42.31， K2HPO412.54。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得編碼普通變形桿菌Proteusvulgaris來(lái)源的L-AAD基因、乳酸桿菌Lactobacillussp. CGMCC 9967苯丙酮酸還原酶的基因序列，選擇酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成多對(duì)引物，序列如表1所示。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中公布的普通變形桿菌P.vulgaris來(lái)源的L-AAD基因laad(GenBank登錄號(hào)：AB030003.1)、乳酸桿菌Lactobacillussp.CGMCC 9967來(lái)源的LaPPR基因[16]lappr(GenBank登錄號(hào)：KP735960.1)、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis來(lái)源的GDH基因[16]gdh(GenBank登錄號(hào)：938261)以及博伊丁假絲酵母Candidaboidinii的FDH基因[16]fdh(GenBank登錄號(hào)：7657866)序列設(shè)計(jì)引物，分別以各自基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物laad、lappr、gdh和fdh經(jīng)過(guò)試劑盒純化后，連接載體pET-28a，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)中。

將gdh基因克隆到重組表達(dá)載體pET-28a-lappr的MCS位點(diǎn)上，引入限制性酶切位點(diǎn)NcoⅠ，用各自的T7啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建pET-28a-t7-gdh-t7-ppr共表達(dá)質(zhì)粒。選擇限制性酶切位點(diǎn)XhoⅠ，將laad基因克隆到重組質(zhì)粒上，構(gòu)建pET-28a-t7-gdh-t7-lappr-t7-laad共表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)中，涂布平板，并過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送至測(cè)序，若正確，即重組菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh構(gòu)建成功。

1.2.3 重組菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

重組菌E.coliBL21/pET28a-laad、E.coliBL21/pET28a-lappr、E.coliBL21/pET28a-gdh、E.coliBL21/pET28a-fdh、E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh，1%的接種量轉(zhuǎn)接入含Kan 50 μg/mL的種子培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)12 h。再按2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，菌體OD600值為0.4～0.5時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度為0.5 mmol/L，24 ℃、180 r/min誘導(dǎo)12 h[15]。

1.2.4 酶活測(cè)定

誘導(dǎo)后的大腸桿菌發(fā)酵液于4 ℃離心(8 000 r/min，5 min)收集菌體，用PB緩沖液(0.1 mol/L，pH為8.0)重懸菌體沉淀，低溫超聲破碎，并在4 ℃條件下高速離心后，獲得破碎上清液，即為粗酶液，進(jìn)行SDS-PAGE分析及酶活力測(cè)定[17]。酶活力測(cè)定分別參考HOU等[12]、XU等[8]的報(bào)道。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)

酶最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH測(cè)定：在25、30、35、40、45、50 ℃下測(cè)定酶活力，分析確定酶反應(yīng)的最適溫度，設(shè)置酶活力最高組為100%對(duì)照[15]。在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下測(cè)定酶活力，分析確定酶反應(yīng)的最適溫度，設(shè)置酶活力最高組為100%對(duì)照[18]。

酶溫度和pH穩(wěn)定性測(cè)定：取適量純化的酶置于不同溫度(25～45 ℃)下，在最適pH條件下定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活力，以最高殘余酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。取適量純化的酶置于不同pH(4.0～10.0)條件下，在最適溫度條件下定時(shí)取樣測(cè)定殘余酶活力，以最高殘余酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.6L-PLA的合成及條件優(yōu)化

利用重組菌E.coli/pET28a-laad-lappr-gdh進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化環(huán)合成L-PLA，以L-Phe作為底物，同時(shí)加入輔底物葡萄糖及5%(體積分?jǐn)?shù))的甘油，轉(zhuǎn)化體系為20 mL，轉(zhuǎn)速220 r/min進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)添加適量的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH。

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化：在不同的溫度(25～45 ℃)、初始pH(6.0～9.0)、菌體量OD600(10～50)、底物質(zhì)量濃度(20～50 g/L)、輔底物與底物摩爾質(zhì)量比(0.5∶1～4∶1)的條件下進(jìn)行L-PLA的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物L(fēng)-PLA的產(chǎn)量的具體方法參考黃國(guó)昌等[19]的檢測(cè)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1laad,lappr,gdh及fdh基因的克隆與表達(dá)

從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到L-AAD、LaPPR、GDH、FDH的序列，長(zhǎng)度分別為1 416、1 047、789、1 197 bp，分別作為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)特異性條帶位置與目標(biāo)基本一致。

M-DL 10 000 marker;1、2-基因 gdh;3、4基因 lappr;5～7-基因laad圖1 基因的克隆Fig.1 The result of gene cloning

2.2 溫度和pH對(duì)L-AAD及LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

2.2.1 溫度對(duì)L-AAD和LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定L-AAD酶活力，如圖2-a，L-AAD的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，存在較高酶活力，溫度高于40 ℃，酶活力下降。圖2-b中顯示，L-AAD在30～40 ℃較穩(wěn)定，酶活力保持在75%以上，而在45、50 ℃條件下，則迅速降到40%以下，可見(jiàn)在30～40 ℃有較好的穩(wěn)定性。

在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定LaPPR酶活力，如圖2-c，LaPPR的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，并具有較高酶活力，溫度高于35 ℃，酶活力下降。圖2-d中顯示，LaPPR在25～35 ℃比較穩(wěn)定，酶活力保持在80%以上，而在40～45 ℃條件下，相對(duì)酶活力迅速降到20%以下，這表明在25～35 ℃有較好的催化性能和熱穩(wěn)定性。

2.2.2 pH對(duì)L-AAD和LaPPR酶活力和穩(wěn)定性的影響

在不同pH條件下測(cè)定L-AAD酶活力，結(jié)果如圖3-a所示，隨著反應(yīng)體系pH的逐漸提高，L-AAD 的相對(duì)酶活力也逐漸提高，L-AAD的最適反應(yīng)pH值為8.0，在pH 7.0～9.0具有較高酶活力。圖3-b中顯示，當(dāng)處于偏酸性環(huán)境中時(shí)，L-AAD穩(wěn)定性較差，相對(duì)酶活力降到50%以下；在pH 7.0～9.0偏中性范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，酶活力保持在80%以上，有利于其在生物催化工業(yè)上的應(yīng)用。

a-L-AAD的最適溫度；b-L-AAD溫度穩(wěn)定性；c-LaPPR的最適溫度；d-LaPPR溫度穩(wěn)定性圖2 溫度對(duì)L-AAD和LaPPR的影響Fig.2 The influence of temperature on L-AAD and LaPPR

在不同反應(yīng)pH下測(cè)定LaPPR酶活力，結(jié)果如圖3-c所示，LaPPR的最適反應(yīng)pH為7.0，在pH 7.0～8.0具有較高酶活力，當(dāng)pH值低于7.0，酶活力迅速下降。圖3-d中顯示，在pH 7.0～8.0比較穩(wěn)定，酶活力保持在80%以上，而偏酸性條件下，相對(duì)酶活力迅速降到40%以下，這表明在pH 7.0～8.0有較好的穩(wěn)定性。本研究中使用的L-AAD和LaPPR具有良好的兼容性，為后續(xù)多酶級(jí)聯(lián)奠定基礎(chǔ)。

2.3 輔酶自循環(huán)體系的篩選及優(yōu)化

2.3.1 輔酶自循環(huán)體系的優(yōu)化

LaPPR催化PPA過(guò)程中需要消耗NADH，而NADH穩(wěn)定性差，成本高[18]，在工業(yè)生產(chǎn)中添加昂貴的輔因子會(huì)大大增加生產(chǎn)成本，不符合綠色經(jīng)濟(jì)。輔酶再生是解決其價(jià)格昂貴的有效方法，現(xiàn)主要有葡萄糖脫氫酶和甲酸脫氫酶再生系統(tǒng)，通過(guò)分別催化葡萄糖和甲酸來(lái)再生NADH。

首先對(duì)來(lái)源于Lactobacillussp.CGMCC 9967的LaPPR轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)GDH和FDH進(jìn)行篩選比較。20 mL的轉(zhuǎn)化體系中包含PPA 10 g/L、1.5倍摩爾量的輔底物，分別加入LaPPR和GDH，以及LaPPR和FDH的粗酶液，并以LaPPR和原始菌株粗酶液組作為對(duì)照，各粗酶液在轉(zhuǎn)化體系中的終濃度均為1 U/mL，轉(zhuǎn)化反應(yīng)于pH值為7.5， 220 r/min、30 ℃ 條件下進(jìn)行[16]。結(jié)果如表2所示，通過(guò)比較兩者酶活力以及計(jì)算其初始反應(yīng)速率，GDH初始反應(yīng)速率為16.16 mg/(L·min)，F(xiàn)DH初始反應(yīng)速率為8.78 mg/(L·min)，因此選擇GDH為下一步構(gòu)建重組菌作鋪墊。

2.3.2 LaPPR和GDH的酶量配比優(yōu)化

在多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)中，酶的添加比例能夠影響催化反應(yīng)速率的平衡[20]。LaPPR和GDH作為參與還原反應(yīng)中的重要酶，為了保證催化速率達(dá)到平衡，減少中間產(chǎn)物PPA積累，須對(duì)LaPPR和GDH的添加比例進(jìn)行優(yōu)化。

20 mL的反應(yīng)體系中包含10 g/L的底物PPA，保持LaPPR終濃度為1 U/mL，GDH的添加量高于LaPPR，設(shè)定GDH與LaPPR不同添加比例，酶活力優(yōu)化范圍設(shè)定為1∶1～5∶1，按照不同添加比例催化底物，計(jì)算產(chǎn)物L(fēng)-PLA的生成速率[16]。如圖4所示，隨著GDH的逐步增加，初始反應(yīng)速率不斷增加，當(dāng)m(GDH)∶m(LaPPR)=4∶1時(shí)，初始反應(yīng)速率達(dá)到最大值，為27.63 mg/(L·min)。

圖4 LaPPR和GDH添加比例優(yōu)化Fig.4 Optimization of dosage of LaPPR and GDH

2.4 共表達(dá)重組菌的構(gòu)建及優(yōu)化

按照方法1.2.2構(gòu)建重組菌株E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh，超聲破碎并離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，在約52.05、37、29.8 kDa位置處有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶，大小一致，各基因成功在大腸桿菌中表達(dá)。

M-蛋白質(zhì)marker;1- E.coil BL21/pET-28a crude enzyme;2～4-E.coil BL21/pET-28a-laad-lappr-gdh圖5 基因的表達(dá)及分析Fig.5 The result of gene expression and purification

利用上述共表達(dá)重組菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)提供足夠的Phe和葡萄糖時(shí)，底物Phe可大量被消耗，此時(shí)中間產(chǎn)物PPA大量積累，質(zhì)量濃度達(dá)到27.89 g/L，而最終產(chǎn)物L(fēng)-PLA產(chǎn)生速率較為緩慢。中間產(chǎn)物積累濃度較高，影響整個(gè)反應(yīng)順利進(jìn)行?？赡苁怯捎贚aPPR和GDH兩個(gè)關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化過(guò)程不平衡，從而影響PPA轉(zhuǎn)化至L-PLA的催化速率。經(jīng)酶活力測(cè)定，結(jié)果如表2所示，在重組菌中，LaPPR酶活力為12.89 U/mL，GDH為7.64 U/mL，GDH酶活力較低，從而影響反應(yīng)使其不能相互協(xié)調(diào)，導(dǎo)致PPA不能被快速催化，造成中間產(chǎn)物的積累，影響L-PLA的生產(chǎn)。這一限速步驟對(duì)L-PLA產(chǎn)量的影響是亟需解決的問(wèn)題。

圖6 重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.6 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

2.5 限速步驟的解除

為了協(xié)調(diào)具有一個(gè)載體的共表達(dá)菌株中LaPPR和GDH的表達(dá)水平，通過(guò)對(duì)LaPPR和GDH的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化，增加GDH的拷貝量，其酶活力情況如表2所示。通過(guò)調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)全細(xì)胞生物催化劑中酶的表達(dá)，當(dāng)GDH為2個(gè)拷貝量時(shí)，中間產(chǎn)物PPA的積累減少，減少了84.60%，L-PLA產(chǎn)量有較大的提高，產(chǎn)量增加了3倍多。

表2 LaPPR、FDH及GDH在大腸桿菌中的酶活力 單位：U/mL

2.6 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的條件優(yōu)化

2.6.1 溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

反應(yīng)體系的溫度會(huì)直接影響酶的催化活性和穩(wěn)定性[15]，從而影響最終產(chǎn)物PLA的產(chǎn)量。例如L-AAD和LaPPR最適反應(yīng)溫度分別為37、30 ℃，為了能夠達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)化效果，需要對(duì)轉(zhuǎn)化的溫度進(jìn)行優(yōu)化?？刂瞥跏挤磻?yīng)pH值為8.0，底物質(zhì)量濃度30 g/L，菌體量OD600為30，輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量，在不同溫度(25～45 ℃)下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

如圖7-a所示，溫度為30 ℃時(shí)，L-PLA產(chǎn)量達(dá)到最高，20.24 g/L，轉(zhuǎn)化率為67.49%，而當(dāng)溫度增加到45 ℃時(shí)，L-PLA產(chǎn)量顯著下降，說(shuō)明此時(shí)某種酶活力受到影響，無(wú)法維持反應(yīng)的進(jìn)行。

2.6.2 初始pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

在多酶催化反應(yīng)體系中，pH通過(guò)影響菌體狀態(tài)和酶促反應(yīng)的效率而影響L-PLA的合成，例如L-AAD和LaPPR最適反應(yīng)pH值分別為8.0和7.0，為了使反應(yīng)高效進(jìn)行，對(duì)轉(zhuǎn)化初始pH進(jìn)行了優(yōu)化。維持反應(yīng)溫度30 ℃，底物質(zhì)量濃度30 g/L，菌體量OD600為30，輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量，在初始反應(yīng)體系pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

如圖7-b所示，隨著pH的升高，L-PLA產(chǎn)量增加，且8.0時(shí)達(dá)到最高21.02 g/L，轉(zhuǎn)化率為70.09%，偏堿性環(huán)境可以實(shí)現(xiàn)3種酶的良好催化。

2.6.3 菌體量對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

實(shí)際應(yīng)用中為了滿足生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本，控制菌體濃度在適宜范圍內(nèi)也是至關(guān)重要的。控制初始反應(yīng)pH值為8.0，反應(yīng)溫度30 ℃，底物質(zhì)量濃度30 g/L，輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量，菌體OD600為10～50，進(jìn)行催化反應(yīng)。

如圖7-c所示，轉(zhuǎn)化體系菌體OD600為30時(shí)，L-PLA產(chǎn)量達(dá)到最高，為21.20 g/L，轉(zhuǎn)化率為70.66%。

2.6.4 底物濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

為了提高L-PLA的產(chǎn)量，在前期優(yōu)化的最佳轉(zhuǎn)化條件下(溫度30 ℃，初始pH值為8.0，菌體量OD600，輔底物葡萄糖添加量為1倍摩爾當(dāng)量)合成L-PLA，底物Phe質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 g/L 進(jìn)行催化反應(yīng)。

如圖7-d所示，底物質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大值，為21.36 g/L，轉(zhuǎn)化率為71.22%，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率也能維持在40.29%左右?？赡苡捎赑he溶解度低，反應(yīng)體系中還有其他物質(zhì)，體系無(wú)法承載過(guò)多底物，從而產(chǎn)量有所下降[19]。

2.6.5 輔底物與底物比例對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響

葡萄糖在GDH作用下生成輔酶NADH，隨著NADH的增加，重組菌合成L-PLA產(chǎn)量越高，對(duì)反應(yīng)體系中葡萄糖的添加量進(jìn)行了優(yōu)化。控制反應(yīng)溫度30 ℃，初始反應(yīng)pH值為8.0，菌體量OD600為30，底物Phe質(zhì)量濃度30 g/L，添加0、0.5、1、1.5、2、2.5倍摩爾當(dāng)量的葡萄糖進(jìn)行全細(xì)胞催化。

如圖7-e示，未添加葡萄糖時(shí)，由于大腸桿菌本身含有一定的輔酶NADH，但不能支撐整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)行，可生成少量L-PLA。當(dāng)葡萄糖添加量為1、1.5、2、2.5倍摩爾當(dāng)量時(shí)，L-PLA產(chǎn)量無(wú)明顯差異變化，表明輔底物添加量≥1倍摩爾量時(shí)即可滿足反應(yīng)需求，選擇葡萄糖添加量為1倍摩爾當(dāng)量最為合適。

a-溫度；b-初始pH；c-菌體濃度；d-底物濃度；e-輔底物添加量圖7 轉(zhuǎn)化條件對(duì)重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLA的影響Fig.7 Effect of transformation conditions on the transformation and synthesis of L-PLA by recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh

2.7 1 L放大全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-PLA

為利用重組大腸桿菌E.coliBL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-PLA，按照上述優(yōu)化后全細(xì)胞催化條件研究重組菌在大體系中的轉(zhuǎn)化水平。用1 L 0.1 mol/L 的PB緩沖液懸浮菌體，控制反應(yīng)溫度30 ℃，初始pH值為8.0，底物Phe 30 g/L，甘油2.5 mol/L，輔底物葡萄糖1倍摩爾當(dāng)量，菌體OD600為30的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，液相檢測(cè)轉(zhuǎn)化液中各組分含量情況。

如圖8所示，30 g/L底物質(zhì)量濃度下，共生成21.39 g/LL-PLA，轉(zhuǎn)化率為71.33%。反應(yīng)后期延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間，轉(zhuǎn)化率變化不明顯，可能是反應(yīng)趨于平衡。

圖8 重組菌E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.8 The recombinant E.coli BL21/pET28a-laad-lappr-gdh-gdh whole cells catalyze the synthesis of L-PLA

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)構(gòu)建高效便捷的多酶級(jí)聯(lián)催化體系，利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化Phe合成L-PLA。首先分別對(duì)L-AAD和LaPPR分別進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，以此為基礎(chǔ)篩選比較構(gòu)建輔酶自循環(huán)體系，解決中間產(chǎn)物積累問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)Phe到L-PLA的直接轉(zhuǎn)化，最終產(chǎn)量達(dá)到21.39 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為71.33%。然而本研究所制備的產(chǎn)量仍有提升空間，導(dǎo)致產(chǎn)量無(wú)法進(jìn)一步提高的原因是由于Phe溶解度低，反應(yīng)體系無(wú)法承載過(guò)多底物，且有結(jié)晶存在，因此轉(zhuǎn)化率無(wú)法進(jìn)一步提高，增加了轉(zhuǎn)化體系的傳質(zhì)阻力[21]，同時(shí)影響酶的催化特性。本研究提供了一種新型的L-PLA合成途徑，因PPA價(jià)格較高，由Phe為底物，大大減少了生產(chǎn)成本，縮短了工藝流程，采用全細(xì)胞催化合成L-PLA，操作工藝便捷，轉(zhuǎn)化效率高。對(duì)提供挖掘成本低廉并能高效轉(zhuǎn)化的生物催化合成L-PLA的方法具有借鑒作用，同時(shí)對(duì)其在食品及合成藥物行業(yè)生產(chǎn)具有廣泛的指導(dǎo)意義。