蓮不同類型地下芽的初代培養(yǎng)

靖晶 李軍 劉鳳軍 徐君 王歡 姜紅衛(wèi)

摘要：以蓮不同類型的頂芽和腋芽為外植體，開展芽的無菌離體再生組織培養(yǎng)。結(jié)果顯示：蓮的不同類型頂芽/腋芽離體培養(yǎng)效果不同，隨著消毒時間的延長，A類型外植體污染率最低，B類型外植體污染率次之，C類型外植體污染率最高。A類型外植體成活率最低，B類型外植體次之，C類型外植體最高。外植體的不同滅菌試驗表明，添加生物消毒劑（plant preservative mixture，PPM）后，污染率降低到27.77%。不同的細胞分裂素對初代培養(yǎng)的試驗表明，添加3.0 mg/L KT時，誘導率達到74.43%，而且芽生長健壯，是比較適合的蓮外植體誘導的激素濃度。

關(guān)鍵詞：蓮花;外植體;細胞分裂素;污染率;誘導率

中圖分類號：S682.320.4+3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0105-05

收稿日期：2020-09-01

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（19）3119];江蘇省蘇州市智庫項目（編號：ZK202002）。

作者簡介：靖 晶（1986—），女，山西大同人，碩士，助理研究員，主要從事觀賞園藝植物育種研究。E-mail：376922925@qq.com。

通信作者：姜紅衛(wèi)，碩士，研究員，主要從事園林植物育種與栽培研究。E-mail：770666671@qq.com。

蓮（Nelumbo nucifera）又稱水芙蓉、芙蕖、蓮花等，屬睡蓮科（Nelumbonaceae）蓮屬（Nelumbo）多年生草本水生花卉。蓮是最為古老的栽培植物之一，素有“活化石”之稱，是冰期以后幸存的孑遺植物。據(jù)考證，我國已有3 000多年的栽培歷史，有著豐富的栽培品種及鄉(xiāng)土資源[1]。蓮以其優(yōu)美的姿態(tài)、豐富的花色深受我國居民喜愛，屬我國的十大名花之一，具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值[2]。近年來，隨著我國經(jīng)濟的持續(xù)快速發(fā)展，人們生活水平不斷提高，市場對蓮新品種的需求量日益旺盛和多元化[3]。傳統(tǒng)蓮的育種方式是雜交育種，這種方式具有育種周期長、工作量大、容易發(fā)生生殖障礙而引起胚胎敗育等缺點。通過分子生物學技術(shù)結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)的育種方法，可以縮短育種年限、節(jié)約時間成本，是未來蓮花育種發(fā)展的方向和趨勢[4]。另外，蓮的常規(guī)繁殖方式主要依賴種藕分生進行無性繁殖，這種繁殖方式帶來一系列問題，從淤泥里挖藕耗時耗力，同時長期的無性繁殖導致病毒的積累和品種的退化。而莖尖組織培養(yǎng)的方法是嘗試解決這一問題的有效途徑[5]。2015年Yang等對控制荷花（學名為“蓮”）的早花基因方面進行了研究，發(fā)現(xiàn)參與光周期、春化作用和赤霉素途徑的COPI、CCAI、LHY、CO-LIKE、VIN3、GAI和FT基因的差異表達可能與荷花（學名為“蓮”）開花時間有關(guān)系[6]。蓮藕的組織培養(yǎng)始于1987年[7]，1988年日本學者山本雄慈等研究報道，通過誘導蓮藕莖尖的脫毒培養(yǎng)已獲得成功[8]。我國學者李良俊等以江蘇省蓮藕主栽品種美人紅試管苗莖尖為外植體，研究不同外植體大小及蔗糖濃度對增殖系數(shù)的影響[9]。徐君等以荷花（學名為“蓮”）頂芽為外植體，研究不同外植體類型、不同消毒時間及不同激素濃度等對誘導率的影響[10]。Arunyanart等研究了不同劑量γ射線和X射線處理蓮藕組培苗，誘發(fā)其突變，可導致21個形狀發(fā)生改變。隨著射線劑量的增加，大多數(shù)植株表現(xiàn)出玻璃化、黃化及葉柄變形等異常特征[11]。蓮再生體系建立的方法還不成熟。除了直接利用莖尖這樣的分生組織，利用愈傷組織間接誘導再生芽的體系還不成熟，僅有少數(shù)報道。在其他報道中，甚至利用愈傷組織間接誘導再生芽的報道都沒有成功?？椎抡妊芯苛擞绊懮徟号呙劝l(fā)的因素，篩選出蓮藕胚培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+0.1% AC+3%蔗糖和MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+0.1% AC+3%蔗糖，并且總結(jié)了蓮藕胚培養(yǎng)存在的問題[12]。Buathong等以蓮藕為材料，在MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)下，誘導胚頂芽形成胚性愈傷組織，以蓮藕胚性芽團為材料，用粒子轟擊裝置對蓮藕的反義DFR基因轉(zhuǎn)化進行了研究，其結(jié)果表明蓮藕的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是可能的[13]。

不同基因型對蓮組織培養(yǎng)分化情況的影響較大[14]，不同品種的外植體誘導率存在顯著差異。何碧珠等研究了不同建蓮品種莖尖離體再生體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建蓮1號與太空蓮19號、建蓮21號相比差異顯著[15]。不同的取材時期對蓮莖尖分化也有影響。李良俊等研究表明，春季萌發(fā)期（2—4月）與冬季結(jié)藕期（10—12月）時取材蓮莖尖分化率較高，其中4月達到最高，生育期6—8月則相對較低;從萌動期開始，隨著從營養(yǎng)生長到生殖生長過渡，蓮莖尖組培難度逐漸加大[16]。

不同消毒滅菌方式對蓮莖尖誘導率也存在較大影響，Liu等在對微山紅蓮的種胚進行組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，單純使用3 min 75%乙醇+10 min 5% NaClO，其污染率可達100%，而用1 min 75%乙醇+10 min 2% NaClO，后再用2%生物消毒劑（plant preservative mixture，PPM）消毒1 d的方式，其污染率可降至2.22%[17]。不同的培養(yǎng)基類型對蓮莖尖誘導率也存在影響。蓮組織培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，改良的液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基的體積比2 ∶1，這樣的雙層MS培養(yǎng)基可促使外植體頂芽分化數(shù)目增多，并且可以促進初生根與次生根的形成[18]。

蓮通過組織培養(yǎng)的方式育苗困難，尤其以地下芽為外植體進行組織培養(yǎng)時，容易發(fā)生外植體褐化、污染嚴重、誘導率低等技術(shù)瓶頸，嚴重限制了蓮分子育種方法的推廣及應用。本試驗在前人研究的基礎上，主要針對蓮地下芽組培污染的抑制方面進行了比較詳細的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

本試驗時間是2019年4月，地點是蘇州市農(nóng)業(yè)科學院望亭荷花基地（120.6°E、31.3°N）實驗室。

1.2 取材和前期處理

試驗所需材料均來源于蘇州市農(nóng)業(yè)科學院望亭荷花基地，為自育品種荷塘情深。春季4月，蓮地下根狀莖開始萌動，在蓮翻盆后，挑選頂芽及腋芽完好無損的發(fā)育良好的藕根，在自來水下將淤泥沖洗干凈，帶回實驗室處理。用解剖刀片沿著頂芽基部，連根部將頂芽切下，參照圖1-A。

1.3 外植體的前處理和滅菌

將切取的外植體浸泡在洗潔精水里1 h，之后用小毛刷在洗潔精水里逐個刷干凈，每個至少刷5遍，在細縫和小凹坑的地方重點刷洗，全部刷洗干凈后，放置在流動的自來水下沖洗1 h。之后置于超凈工作臺下，用無菌水洗凈后，依次用以下3種不同體積分數(shù)消毒劑進行浸泡消毒處理：（1）75%乙醇消毒1 min，之后在0.1% NaClO浸泡5、10、15 min;（2）75%乙醇消毒1 min，之后在0.1%氯化汞浸泡5、10、15 min;（3）75%乙醇消毒30 s，之后在0.1% NaClO浸泡10 min，再在1% PPM浸泡1 h，2% PPM浸泡1 h，2% PPM浸泡2 h;最后再用無菌水沖洗5～6次，去除表面多余水分，利用解剖刀將頂芽葉鞘剝?nèi)ィ庵搀w長度約1 cm，以直插式插入誘導培養(yǎng)基上。每個處理接種10瓶，每瓶接種2個頂芽，每個處理重復3次。接種后放置在光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，設置光照度1 000～4 000 lx，光照 12 h/d，溫度28 ℃。觀察外植體的培養(yǎng)動態(tài)，詳細記錄消毒死亡數(shù)、污染數(shù)和褐化死亡數(shù)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計不同消毒方式下外植體的成活情況。外植體的污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%;死亡率=（消毒死亡率+褐化死亡率）/接種數(shù)×100%;成活率=100%-（污染率+死亡率）。

1.4 不同頂芽的分類處理

超凈工作臺下，將外植體分為頂芽和腋芽2個種類，并且解剖成3種類型：A型頂芽（將頂芽外面包裹的葉鞘及幾層未展開葉芽全部除掉，只剩下頂芽生長錐，外植體長度約1 cm，參見圖1-B）、B型頂芽（只剝?nèi)ロ斞客鈱尤~鞘，保留頂芽生長錐和未展開葉芽，長度一般1～2 cm，參見圖1-C）、C型頂芽（僅僅除去頂芽外部包裹的1層葉鞘，外植體一般 1～2 cm，參見圖1-D）。然后插入誘導培養(yǎng)基上。每個處理接種10瓶，每瓶接種2個頂芽，每個處理重復3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計不同外植體類型的萌發(fā)情況。

1.5 外植體的啟動誘導

設置外植體的初代誘導培養(yǎng)基，其主要成分是MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.4%瓊脂，研究不同細胞分裂素對頂芽誘導培養(yǎng)的影響，添加不同濃度的 6-BA 和ZT，在NAA濃度不變的情況下分別設置 6-BA 濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，ZT濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L。每個處理接種10瓶，每瓶接種3個頂芽，每個處理重復3次（圖1-E）。培養(yǎng)30、60 d后分別統(tǒng)計外植體誘導率和芽高。外植體誘導率= 外植體芽萌動數(shù)/無菌活外植體接種總數(shù)×100%，通過分析萌發(fā)率和頂芽分生情況來比較不同細胞分裂素的誘導效果。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用辦公軟件Excel 2016和統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0進行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的細胞分裂素濃度對外植體誘導率的影響

以蓮頂芽為外植體材料，按照表1所設定的9種不同滅菌方法進行消毒和滅菌，培養(yǎng)30 d后記錄外植體的消毒污染情況。從表1可以看出，不同處理方法的頂芽污染率存在顯著差異。0.1% NaClO消毒5 min的污染率最高，達到98.90%。隨著NaClO消毒時間的延長，消毒10 min時的污染率僅僅降低了2.23百分點，當消毒時間延長至15 min時，污染率下降15.57百分點;氯化汞消毒5 min時，污染率為93.70%，隨著氯化汞消毒時間從 5 min 增加到 15 min時，污染率僅僅下降了12.60百分點;當采用傳統(tǒng)表面消毒劑結(jié)合生物消毒劑（1%PPM）的方法（方法7）時，對比不用PPM浸泡的方式（方法2），其污染率下降了56.67%。當使用濃度更高（2%）的PPM浸泡1 h時，污染率是31.30%，2%PPM浸泡2 h，污染率下降到27.77%。因此，蓮外植體消毒效果最好的方式是先用75%乙醇消毒1 min后，再用0.1% NaClO處理10 min，最后再在2% PPM中浸泡2 h。

2.2 不同外植體類型的比較

根據(jù)不同的解剖方式，將外植體分為A型、B型及C型。之后按照如表2設定的試驗方法進行消毒及殺菌，定期觀察外植體污染及存活情況并進行記錄，培養(yǎng)30 d后外植體消毒試驗結(jié)果如表2所示。

0.1%NaClO消毒5 min時，不同類型外植體污染率差異不顯著，但是隨著消毒時間的延長，不同類型的外植體污染情況差異顯著，A類型外植體污染率最低，B類型外植體污染率次之，C類型外植體污染率最高。

在成活率的統(tǒng)計（表3）中，0.1% NaClO消毒 5 min 時，不同類型的外植體成活率均為0;消毒時間10 min時，不同類型的外植體成活率差異不顯著;消毒時間15 min時，各類型外植體之間差異顯著，A類型外植體成活率最低，B類型外植體次之，C類型外植體最高。

在死亡率的比較（表4）中，0.1% NaClO消毒 5 min 時， 不同類型的外植體死亡率差異不顯著;消毒時間延長至10、15、20 min時，不同類型外植體差異顯著，C類型外植體死亡率最低，B類型外植體次之，A類型外植體死亡率最高。

2.3 不同細胞分裂素對外植體誘導的比較

將大小一致的B型外植體芽接種至含有不同細胞分裂素的誘導培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)，根據(jù)外植體生長的情況，對誘導率、外植體芽生長狀況等生長指標進行統(tǒng)計，結(jié)果如表5所示，即添加不同濃度的6-BA和KT，外植體的誘導效果差異顯著。對比CK，添加一定濃度的6-BA和KT后，均能在一定程度上縮短芽的萌發(fā)期限，提高誘導率。隨著6-BA和KT濃度的增加，芽的萌發(fā)時間明顯變短，誘導率提高，芽長度變短（表5、圖1-F）。A1至A4誘導率存在顯著差異，A4的誘導率達到84.43%，萌發(fā)時間也最短，但是后期芽苗生長勢較弱，褐化嚴重。A3的誘導率同樣可以達到83.33%，但是同時伴隨有褐化問題。添加KT的培養(yǎng)基，B1至B4的誘導率明顯提高，芽的萌發(fā)速度也變得更快。B4的誘導率最高，但是芽后期生長勢弱（表5、圖1-G），B3的誘導率對比B4低8.90百分點，芽萌發(fā)也較早、芽的生長很健壯。B1、B2的芽誘導率均不高、萌發(fā)速度也較慢。在6-BA和KT的對比試驗中可以發(fā)現(xiàn)，KT相比 6-BA 不會出現(xiàn)褐化問題。因此，綜合考慮誘導率和芽的生長情況，比較適合芽初代誘導培養(yǎng)的激素配方是B3。

3 討論與結(jié)論

蓮的組培再生體系建立極為困難，目前國內(nèi)外有關(guān)蓮通過愈傷組織實現(xiàn)再生培養(yǎng)成功的報道尚鮮少見。利用蓮頂芽或腋芽離體培養(yǎng)誘導再生的快繁技術(shù)，一直是各研究機構(gòu)的研發(fā)熱點[9]?；ㄉ徸鳛橛^賞花卉，屬蓮的一大類，在這方面的研究才剛剛起步。在花蓮芽離體培養(yǎng)的前期研究中，由于蓮地下莖長期在泥土中生長，芽自身多帶細菌，因此消毒極其困難，容易褐化，生理活性差，花蓮地下莖段芽離體組培效果不理想，最佳始芽的分化率僅為58.1%[16]。確定適宜的消毒劑類型和消毒時間對于外植體滅菌尤為重要，在植物組織培養(yǎng)中，氯化汞和次氯酸鈉是目前比較常見的2種外植體消毒劑。大量的研究證明，氯化汞作為一種重金屬強消毒劑，在殺死外植體表面細菌的同時，通常也大大降低了植株細胞的活性[19]。次氯酸鈉性質(zhì)溫和，但是單純使用消毒效果不佳，污染率高;消毒液的混合使用可以有效地降低外植體的污染率[20]，因此本試驗創(chuàng)新了傳統(tǒng)的消毒方法，運用次氯酸鈉搭配新型生物細菌滅菌劑PPM，有效降低了污染率，提高了成活率。試驗結(jié)果表明，普通的消毒劑對蓮外表面頂芽所帶細菌有一定殺滅作用，但是對其內(nèi)源菌的抑制效果很有限。培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，有些外植體在培養(yǎng)后1周左右，并沒有出現(xiàn)污染情況，但是隨著培養(yǎng)時間的延長，外植體周邊逐漸開始出現(xiàn)一些細菌污染的情況。因此，本試驗設計了用0.1%次氯酸鈉消毒10 min后，再用1% PPM浸泡1 h、2% PPM浸泡1 h以及2% PPM浸泡2 h的多種改良方案。結(jié)果證明，先用75%乙醇1 min，后用0.1%次氯酸鈉消毒10 min，最后在2% PPM中浸泡2 h可獲得較好的消毒效果，誘導率為74.43%，且芽苗生長快，活力旺盛，成活率高。

Enjalric等研究認為，植物體不同部位帶菌多少是不一樣的，其帶菌數(shù)量從多到少依次為腋芽>莖尖>生長點[21]。本研究對蓮的頂芽生長錐、頂芽及腋芽的不同滅菌效果進行了對比研究。試驗結(jié)果表明，同樣的消毒處理方式下，A型外植體的污染率最低，B型次之，C型最高;隨著消毒時間的延長，A型外植體的死亡率最高，B型次之，C型最低;證明生長點攜帶的細菌更少，但是卻因為切割得更加微小（0.5 cm）和幼嫩，一是容易被消毒劑殺死，二是容易褐化死亡。而B型頂芽對比A型頂芽，解剖時，并沒有把外層葉芽全部去除，生長錐在外邊葉芽的包裹之下，因而被消毒劑傷害較小，具有較低的死亡率，同時由于帶菌較少，因此污染率較低;C型腋芽由于攜帶細菌較多，雖然死亡率偏低，但是污染率太高。因此綜合比較污染源、死亡率和成活率等因子，B型芽屬于比較理想的外植體類型。

在生理生化方面，激素是植物生長和發(fā)育的調(diào)節(jié)因子，通過優(yōu)化培養(yǎng)基的激素組成成分可以提高外植體誘導率。有研究表明，細胞分裂素在荷花芽誘導和增殖過程中起重要作用。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA和KT濃度的增加，均能有效提高芽的誘導率。但是當添加4.0 mg/L 6-BA時，誘導率達到84.43%，但是誘導芽會出現(xiàn)后期生長弱和褐化的現(xiàn)象。添加4.0 mg/L KT時，誘導率可以達到83.33%，但是芽同樣出現(xiàn)生長孱弱的情況。對比3.0 mg/L KT，誘導率為74.43%，誘導芽生長強健;而3.0 mg/L 6-BA，誘導率為83.33%，但是容易褐化。最后試驗表明，在蓮的啟動培養(yǎng)中，適宜的激素為KT，濃度為3.0 mg/L，誘導率較高，初始芽的生長最為健壯。

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