豬巴氏桿菌Lh-4株單因子發(fā)病模型的建立

華利忠 馮志新 李玉峰 袁廳 劉蓓蓓 張磊 邵國青

摘要：人工接種豬巴氏桿菌Lh-4株于SPF仔豬，以復制豬肺疫發(fā)病模型，并探討其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，為今后研究該病的防治提供依據(jù)。選取5頭30日齡SPF仔豬，隨機分為攻毒組3頭和對照組2頭。聯(lián)合采用滴鼻和皮下注射攻毒（109 CFU/頭），攻毒后每天觀察臨床癥狀和測定直腸溫度，并分別于0、4、10、16 d采集鼻拭子和抗凝血，進行細菌PCR檢測。死亡和16 d時剖檢，進行組織學觀察，同時進行巴氏桿菌在各組織中的分布測定及細菌再分離，最后對具有類似臨床癥狀的病原進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒組有2頭出現(xiàn)包括發(fā)燒、敗血癥、支氣管肺炎、胸膜炎、心包炎等典型的豬肺疫臨床癥狀和病理變化，1頭出現(xiàn)了輕微臨床癥狀。所有攻毒豬均能再分離到巴氏桿菌，其中典型發(fā)病豬各組織臟器中均有巴氏桿菌的分布，但輕微發(fā)病豬僅在心、肺、扁桃體和淋巴結(jié)中檢測出。發(fā)病豬其他有類似臨床癥狀的相關病原檢測均為陰性。成功建立了豬肺疫發(fā)病模型，為巴氏桿菌病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，致病機制及其他巴氏桿菌臨床分離株致病性的確定提供依據(jù)。

關鍵詞：豬巴氏桿菌;豬肺疫;SPF豬;發(fā)病模型;病理變化

中圖分類號： ：S858.28文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0129-06

收稿日期：2020-09-01

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YFD0501600）。

作者簡介：華利忠（1982—），男，江蘇無錫人，博士，副研究員，從事豬病臨床防控技術及實驗動物研究。E-mail：steven828@126.com。

通信作者：邵國青，博士，研究員，主要從事動物傳染病學研究。E-mail：gqshao@163.com。

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是存在于口腔、鼻咽及上呼吸道的條件致病菌 [1]。在豬中P. multocida主要引起急性死亡及波氏桿菌混合感染引起豬萎縮性鼻炎（atrophic rhinitis，AR） [2]。此外，P. multocida在豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）中也起著重要的作用 [3-4]。有報道顯示，在中國發(fā)生肺炎和AR的病例中，P. multocida的檢出率為8.0% [5]，而韓國檢出率為15.6% [6]。在Kim等的另一個報道中顯示，從2008年到2016年韓國巴氏桿菌的患病率更高達16.8%，且85%病例是與其他病原混合感染 [7]?？梢奝. multocida在豬病中的重要性。P. multocida具有很多血清型，多項流行病學調(diào)查均顯示血清型A是我國最為流行的血清型之一 [8-9]，所以針對P. multocida血清型A的研究和防控顯得尤為重要。由于P. multocida為條件致病菌，常為內(nèi)源性感染，且通常表現(xiàn)為混合感染或由某些因素誘發(fā)，故臨床上在預防給藥的用藥時間上把控難度較大。疫苗免疫是預防豬巴氏桿菌病的重要措施，但由于感染劑量的標準化難以確定，單因子動物發(fā)病模型往往出現(xiàn)全部急性死亡或不發(fā)病的情況，較難建立 [10]，其單因子發(fā)病的特點、病理變化以及排菌規(guī)律等的研究報道也很少，阻礙了疫苗研發(fā)的進程。本研究以SPF二元豬為基礎試驗動物，利用普遍流行的A血清型P. multocida強毒株Lh-4建立發(fā)病模型，并對發(fā)病的過程進行監(jiān)測和各項指標的檢測，探討其單因子發(fā)病規(guī)律和特點。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗用菌株

試驗用30日齡SPF長大二元豬5頭，于2019年9月由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所根據(jù)Huang等的方法 [11]經(jīng)人工培育獲得，經(jīng)檢測符合GB/T 22914—2008 SPF豬病原的控制與監(jiān)測的國家標準。豬多殺性巴氏桿菌A血清型Lh-4株，由南京農(nóng)業(yè)大學李玉峰教授惠贈。該菌株于2016年分離于江蘇某規(guī)?；i場豬肺疫急性病例，前期小鼠和仔豬攻毒試驗證明為強毒株。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：試驗用核酸提取試劑盒購自愛思進生物技術有限公司;PCR試劑購自天根生物技術有限公司;非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，其他在實驗中所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器：組織切片機（德國Leica公司），PCR儀（美國PE公司），Kodak凝膠成像系統(tǒng)（美國Kodak公司），熒光定量PCR儀（美國ABI公司），BH-2光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 試驗設計及處理

試驗用30日齡SPF豬5頭，飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院實驗動物房，于2019年10月隨機分為2組，其中G1攻毒組3頭（編號：CC-1、CC-2和CC-3），接種1.67×108 CFU/mL巴氏桿菌Lh-4株懸液6 mL（共109 CFU/頭），其中皮下注射4 mL，左右鼻孔滴鼻各1 mL。G2對照組豬2頭（編號：NC-1和NC-2），采用同樣的方式接種等體積的滅菌PBS。試驗豬飼喂方式為自由采食，自由飲水。所有豬每天觀查臨床癥狀并于08：00—09：00間測定直腸溫度。臨床觀察按Fuller等制定的標準 [12]稍作修改進行臨床指數(shù)的計算。即食欲：0-正常采食，1-采食量減少，2-不采食;呼吸困難：0-正常，1-輕微，2-中等程度，3-嚴重呼吸困難;精神沉郁：0-正常，1-不愛動，2-抑郁，3-深度沉郁。試驗觀察期16 d，期間分別于攻毒后0、4、10、16 d稱質(zhì)量，計算稱質(zhì)量當天各試驗組的平均體質(zhì)量，并對死亡豬進行及時剖檢，16 d后對所有剩余豬進行剖檢。

1.4 血象分析

分別于攻毒后0、4、10、16 d采集肝素抗凝血，分析血象。如動物死亡，則在瀕死前采血進行檢測。

1.5 菌血癥和鼻腔排菌規(guī)律檢測

分別于攻毒后0、4、10、16 d采集肝素抗凝血和鼻拭子，采用PCR方法進行巴氏桿菌病原檢測。如動物死亡，則在瀕死前進行樣本采集。其中鼻拭子采集方法：每頭豬左右鼻孔各用1個鼻拭子棉簽采集，采集后放入準備好的EP管中（1.5 mL EP管中加入1 mL PBS）。4 ℃ 2 h后取出棉簽，10 000 r/min 離心20 min，棄鼻拭子浸液，留沉淀保存于-70 ℃，待所有時間點結(jié)束后統(tǒng)一提取細菌DNA后進行豬巴氏桿菌的PCR檢測。巴氏桿菌的PCR引物序列見表1。

1.6 剖檢及病理變化

動物瀕死狀態(tài)或死后及試驗16 d后，對死亡豬和剩余豬進行剖檢，查看各組織臟器的剖檢變化，進行拍照和記錄。采集心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)及扁桃體等組織臟器，中性福爾馬林固定，制作常規(guī)石蠟切片，HE染色后進行組織病理學觀察。

1.7 巴氏桿菌在各組織臟器內(nèi)的分布及再分離

剖檢時采集心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)以及扁桃體，-20 ℃保存，待所有時間點結(jié)束后統(tǒng)一提取DNA后進行P. multocida的PCR檢測。同時，無菌采集肺臟和肝臟，接種TSB培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)，進行細菌再分離。隨后進行純化培養(yǎng)和P. multocida的PCR鑒定。

1.8 其他病原的檢測

為進一步排除在整個試驗過程中試驗豬是否有其他類似臨床癥狀和病理變化的病原感染，剖檢時采集每頭豬的肺臟、淋巴結(jié)和脾臟，采用RT-PCR/PCR進行豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pneumoniae pleuropneumoniae，APP）及豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis，Mhr）的病原檢測，其中，ASFV檢測采用北京世紀元亨非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床表現(xiàn)及剖檢變化

試驗組在攻毒后體溫升高，部分高熱稽留，采食量下降、消瘦、精神不振、呼吸困難、腹式呼吸。2頭豬皮膚發(fā)紅，其中，耳朵、鼻鏡、四肢末梢和臀部發(fā)紅嚴重（圖1）。瀕死前食欲廢絕，衰弱無力，臥地不起。將試驗期間臨床癥狀記分最嚴重時的分值統(tǒng)計，由表1可知，攻毒后死亡豬的臨床表現(xiàn)最為嚴重，未死豬輕微。攻毒組分別于攻毒后6 d（CC-2）和8 d（CC-1）各死亡1頭。

由圖2可知，剖檢攻毒組發(fā)病死亡豬，發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)大量白色泡沫、胸腔積液、肺臟出血水腫，肺葉一側(cè)出現(xiàn)纖維素性滲出物，并與胸壁黏連;心包積液，呈淡黃色，心包膜增厚，絨毛心;全身淋巴結(jié)出血，脾臟邊緣梗死，肝臟水腫，一側(cè)腎臟有化膿灶;胃底出血，小腸壁變薄，結(jié)腸出血。

2.2 體溫和體質(zhì)量變化

攻毒組與對照組體溫和體質(zhì)量變化見圖3。由圖3可知，攻毒組攻毒后出現(xiàn)高熱稽留現(xiàn)象。其中，CC-1和CC-2號平均體溫為40.5 ℃和40.8 ℃，直至死亡;CC-3號豬平均體溫40.1 ℃。在整個試驗過程中，對照組體溫變化不大（圖3-A）。由圖 3-B 可知，對照組平均體質(zhì)量在整個試驗階段一直高于攻毒組。但由于10 d和16 d攻毒組僅剩下1頭存活，故在本試驗中攻毒組和對照組的體質(zhì)量變化未做統(tǒng)計學分析，僅作為參考。

2.3 血象分析結(jié)果

在攻毒后4 d內(nèi)，所有試驗豬血象分析各指標均在正常范圍內(nèi)，在6 d CC-2號瀕死豬血象分析發(fā)現(xiàn)單核細胞數(shù)量和比例升高，8 d CC-1號瀕死豬嗜中性粒細胞和單核細胞的數(shù)量和比例均有所升高。攻毒組CC-3未死亡豬10 d和16 d時，嗜中性粒細胞和單核細胞的數(shù)量和比例均升高。對照組在整個試驗過程中各指標均在正常范圍內(nèi)。

2.4 組織病理學變化

由圖4可知，組織病理學變化顯示肺臟間質(zhì)增寬、出血、肺泡上皮細胞腫脹壞死脫落，肺泡中有嗜中性粒細胞和巨噬細胞浸潤， 并可見少量纖維素性滲出，部分肺泡內(nèi)可見藍染的菌絲;脾臟脾小體壞死，中央動脈周圍淋巴鞘淋巴細胞減少。腎臟充血;肝臟肝血竇瘀血，肝細胞變性壞死，枯否石細胞增多;心內(nèi)膜增厚，有嗜中性粒細胞和巨噬細胞浸潤;胃黏膜出現(xiàn)壞死灶，黏膜下層充血;腹股溝淋巴結(jié)出血和瘀血，淋巴細胞減少，但漿細胞增多;扁桃體淋巴細胞減少，但漿細胞增多。

2.5 鼻拭子和抗凝血中P. multocida檢測

不同攻毒時間內(nèi)鼻拭子和血液中巴氏桿菌檢測結(jié)果見表2。由表2可知，攻毒后CC-2豬4 d時即能在鼻拭子和血液中檢測到巴氏桿菌，該豬也是第1頭死亡的豬。CC-1豬在4 d時鼻拭子和血液中未檢測到巴氏桿菌，但8 d瀕死前已經(jīng)轉(zhuǎn)陽。CC-3 豬在10 d鼻拭子和血液中也首次檢測到巴氏桿菌，直到試驗結(jié)束。在整個試驗過程中，對照組未檢測到巴氏桿菌。

2.6 P. multocida在各組織的分布及再分離

剖檢后采集各組織臟器，利用PCR方法進行P. multocida的病原檢測，以了解巴氏桿菌在機體內(nèi)的分布。由表3可知，攻毒后死亡豬在心、肝、脾、肺、腎、扁桃體和淋巴結(jié)中均能檢出P. multocida的存在，說明P. multocida在發(fā)病豬中各實質(zhì)組織臟器普遍存在。而攻毒后未死亡豬僅在心、肺、扁桃體和淋巴結(jié)中檢測到。由圖5可知，細菌再分離結(jié)果，所有攻毒組均分離到了灰白色、圓形、微隆起、濕潤、表面光滑、邊緣 整齊的露珠樣小菌落。挑取單克隆后接種TSA培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，收集細菌懸液，提取DNA，進行P. multocida的PCR鑒定。結(jié)果均為陽性。

2.7 試驗豬其他病原的檢測結(jié)果

為排除在試驗過程中其他病原的感染，本試驗對可能會出現(xiàn)類似臨床癥狀的病原進行了檢測，結(jié)果所有實驗豬PRRSV、CSFV、RPV、ASFV、APP、HPS、SS、Mhr均為陰性。

3 討論

豬巴氏桿菌的攻毒模型在其他動物上比較成熟，如Pors等利用3株豬源性巴氏桿菌，通過滴鼻的方式建立了小鼠發(fā)病模型，發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌主要分布于肺臟和脾臟 [13]。肺臟的主要病理變化主要表現(xiàn)為以嗜中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，肺泡和細支氣管內(nèi)的纖維素性滲出，血管周圍水腫，并出現(xiàn)化膿性壞死灶。脾臟也以嗜中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤。但在豬上建立人工發(fā)病模型有一定的難度。Peng等通過氣管內(nèi)注射8周齡巴氏桿菌陰性商品豬3 mL巴氏桿菌HN07株建立巴氏桿菌發(fā)病模型，所用的菌液量達到7.86×1010 CFU [14]。但其發(fā)病模型在接菌后18～24 h即出現(xiàn)死亡，為最急性病例，其主要病理變化為全身廣泛性出血和肺組織的變性壞死，未出現(xiàn)明顯的纖維素性變化，在體質(zhì)量變化上也凸顯不出差異。趙海旭在做豬多殺性巴氏桿菌四組分亞單位疫苗免疫效果評估的時候采用了耳緣靜脈注射4.5×109 CFU（2 mL）的方法進行攻毒試驗，結(jié)果也在2 d之內(nèi)出現(xiàn)了豬巴氏桿菌病的臨床癥狀和病理變化，且出現(xiàn)死亡 [15]。但該研究的試驗動物為商品豬，不能排除其他病原的協(xié)同作用。在本試驗之前，筆者進行了預實驗，發(fā)現(xiàn)靜脈注射1010 CFU的巴氏桿菌 Lh-4 株同樣能造成感染豬的最急性死亡。為復制具有典型全身敗血癥、纖維素性肺炎、肺組織變性壞死的發(fā)病模型，本試驗采用SPF仔豬，聯(lián)合滴鼻和皮下注射感染途徑復制豬巴氏桿菌病，操作簡便，又保證了巴氏桿菌的單因子作用，且每頭豬所用的菌僅為109 CFU。由于本研究首例死亡出現(xiàn)在6 d，時間較長，所以不僅復制出除最急性病例會出現(xiàn)的典型的豬巴氏桿菌病臨床癥狀和病理變化，同時還出現(xiàn)了纖維素性肺炎的病理變化。出現(xiàn)這些不同可能與菌株、攻毒劑量和攻毒途徑不同有關。

巴氏桿菌不同菌株的致病性有一定的差異，Oliveira-Filho等通過滴鼻途徑接種巴氏桿菌陰性豬，確定了8株P. multocida分離株的致病性，結(jié)果其中5株為高致病性菌株，能引起壞死性支氣管肺炎、胸膜炎和心包炎 [16];1株為低致病性菌株，僅引起局灶性支氣管肺炎;2株為無致病性菌株。本研究接種了巴氏桿菌Lh-4株的豬，出現(xiàn)了支氣管肺炎﹑胸膜炎和心包炎等典型的巴氏桿菌病的病變，與高致病性菌株所產(chǎn)生的病變一致。但從病程角度衡量，本試驗復制的豬巴氏桿菌病不是最急性的形式，而是急性和慢性形式。在急性發(fā)病死亡豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)和扁桃體均能檢測到巴氏桿菌的存在，呈現(xiàn)全身性分布。而另外一頭攻毒未死亡的豬，僅在心、肺、淋巴結(jié)和扁桃體中檢測到巴氏桿菌，病原菌并未擴散到全身各個組織臟器，這也可能是該豬沒有死亡，轉(zhuǎn)成慢性病例的原因之一。

巴氏桿菌病主要在生長育肥豬和母豬中發(fā)生，因二元母豬和三元育肥豬為國內(nèi)主要規(guī)模場的標配。本研究專門培育了SPF長大二元豬，作為試驗動物，以減少品種之間的差異。另一方面，有很多病原能引起與豬巴氏桿菌病類似的臨床癥狀和病理變化，其中CSFV、ASFV、PRRSV、PRV、SS、APP等會引起全身廣泛性出血;HPS、SS、Mhr和APP能引起支氣管性肺炎，胸膜炎，腹膜炎，心包炎和關節(jié)炎;ASFV和APP感染也能引起氣管內(nèi)的白色泡沫 [17]。為進一步確認本試驗所建立的發(fā)病模型為巴氏桿菌單因子發(fā)病模型，在動物試驗后采集了所有試驗豬的組織臟器，采用PCR檢測了上述豬主要病原，結(jié)果全為陰性，說明本試驗所建立的發(fā)病模型，確實由巴氏桿菌單因子感染造成。

以1月齡SPF二元豬為基礎試驗動物，聯(lián)合滴鼻和皮下注射途徑人工感染豬巴氏桿菌血清A型Lh-4株，出現(xiàn)了高熱稽留、出血、呼吸困難、采食下降甚至廢絕、消瘦等典型臨床癥狀以及大葉性肺炎、心包炎以及全身性敗血癥等病理變化，成功建立了豬巴氏桿菌病發(fā)病模型，為巴氏桿菌病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律研究、臨床分離株致病性鑒定及發(fā)病標準的建立提供依據(jù)。下一步將開展不同日齡、不同品種SPF豬對豬巴氏桿菌易感性與致病性的比較研究。

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