羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿的包合工藝優(yōu)化

梁浩 錢璽丞 杜曉靜 郁建生

摘要：為研究羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿的包合作用，對(duì)影響白屈菜紅堿包合率的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比、包合溫度、包合時(shí)間等3個(gè)因子進(jìn)行研究。在單因素基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面法的3因素3水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以白屈菜紅堿包合率為響應(yīng)值，優(yōu)化包合工藝。結(jié)果表明，影響包合率的因素表現(xiàn)為包合比>包合溫度>包合時(shí)間，最終確定最佳試驗(yàn)條件：包合反應(yīng)溫度為61 ℃，包合反應(yīng)比例為10 ∶1，包合反應(yīng)時(shí)間為190 min，在此條件下包合率為72.75%，與軟件預(yù)測(cè)值（72.88%）接近（相對(duì)誤差0.178%）。

關(guān)鍵詞：羥丙基-β-環(huán)糊精;白屈菜紅堿;響應(yīng)面分析法;包合作用;工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)： R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）12-0135-05

收稿日期：2020-09-01

基金項(xiàng)目：西部地區(qū)創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：發(fā)改辦高技[2016]2195號(hào)）;貴州省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：黔科合支撐[2019]2363號(hào)）;銅仁市科技計(jì)劃（編號(hào)：銅市科研[2019]113號(hào)、銅市科研[2019]109號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：梁 浩（1987—），男，河北保定人，博士，副教授，主要從事藥用植物有效成分開發(fā)及應(yīng)用研究。E-mail：249672111@qq.com。

白屈菜紅堿（chelerythrine）是從博落回、白屈菜、血水草以及飛龍掌血等藥用植物中提取得到的苯并菲啶型生物堿[1-3]。研究表明，白屈菜紅堿具有抗菌、抗炎、抗腫瘤和抗肝纖維化等多種藥理作用[4-5]，對(duì)農(nóng)作物病蟲害的防治也有較好的效果[6]。因此，白屈菜紅堿被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、獸藥和飼料添加劑以及生物農(nóng)藥中。尤其是在動(dòng)物生產(chǎn)過程中，白屈菜紅堿具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、改善動(dòng)物健康、預(yù)防動(dòng)物疾病等多種功能[7]，由于白屈菜紅堿的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，生物利用度較低，所以有必要通過制劑技術(shù)改進(jìn)或提高白屈菜紅堿的溶解度和生物利用度[8]。

在提高難溶性藥物的水溶性和增加穩(wěn)定性方面，環(huán)糊精包合技術(shù)顯示出較大的優(yōu)勢(shì)[9]，而且藥物經(jīng)β-環(huán)糊精包合后可減輕口服后對(duì)胃腸道的刺激，提高療效，降低藥物毒性，并能保持藥物原有的性質(zhì)和作用[10]。在眾多的β-環(huán)糊精衍生物中，羥丙基-β-環(huán)糊精（ HP-β-CD）顯示出較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值，主要體現(xiàn)在水溶性更好，常溫下它在水中的溶解程度超過50%;人體中耐受性好，在體內(nèi)基本上不累積，也不被分解代謝;低毒、安全、無腎毒性、較好的藥物增溶性等。目前由于其優(yōu)良的性質(zhì)，在醫(yī)藥和食品等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[11]。

目前，關(guān)于環(huán)糊精及其衍生物對(duì)白屈菜紅堿的包合研究較少，本研究采用飽和水溶液法，以羥丙基-β-環(huán)糊精為包合材料，對(duì)白屈菜紅堿進(jìn)行包合，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化白屈菜紅堿包合物的制備工藝，采用紫外光譜法對(duì)白屈菜紅堿和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物和兩者的混合物以及羥丙基-β-環(huán)糊精的紫外光譜進(jìn)行測(cè)定，并驗(yàn)證白屈菜紅堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物是否形成。本研究旨在將白屈菜紅堿制備成 HP-β-CD包合物，以期改善其在水溶性和穩(wěn)定性方面的缺陷，從而為拓寬其適用范圍提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

白屈菜紅堿原料（高效液相色譜檢測(cè)純度為94.3%），參照文獻(xiàn)[12]自制;羥丙基-β-環(huán)糊精（純度99%）、白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），均購自上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸等試劑（分析純），均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)（KQ-218），購自昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)（T10CS），購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;超高效液相色譜儀（Agilent1290），購自安捷倫科技有限公司;十萬分之一分析天平（CPA225D），購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;千分之一分析天平（AE223），購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;真空干燥箱（DZF6030A），購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫集熱式磁力攪拌器（DF-101S），購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9013A），購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白屈菜紅堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備 稱取一定量HP-β-CD，加入5 mL蒸餾水，水浴加熱攪拌至溶解，緩慢加入0.1 g白屈菜紅堿，避光攪拌，攪拌結(jié)束后將反應(yīng)液在40 ℃進(jìn)行真空干燥，粉碎后即得包合物粉末。

1.3.2 白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品11.74 mg，用1.0%鹽酸-甲醇溶液（體積比為50 ∶50）溶解于容量瓶（100 mL）中，并定容，配制得到白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)品母液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL于容量瓶（25 mL）中，并定容。液相色譜條件：選擇檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm，C18色譜柱，采用乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相，控制流速為0.5 mL/min;保持柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

1.3.3 樣品溶液的配制及含量測(cè)定 按單因素試驗(yàn)方案和響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案制備白屈菜紅堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，準(zhǔn)確稱取10 mg白屈菜紅堿包合物，采用1.0%鹽酸-甲醇溶液（體積比為50 ∶50）溶解，超聲1 min，置于容量瓶（25 mL）中，稀釋定容，搖勻，采用有機(jī)溶劑微孔濾膜（0.45 μm）過濾，得待測(cè)包合物樣品溶液。采用高效液相色譜法（檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm）測(cè)定包合物中白屈菜紅堿含量。

1.3.4 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物制備單因素試驗(yàn)

對(duì)影響白屈菜紅堿包合率的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比、包合溫度、包合時(shí)間等3個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)而確定各因素響應(yīng)面試驗(yàn)取值范圍。包合率=1-（濾液中白屈菜紅堿質(zhì)量+包合物中未反應(yīng)的白屈菜紅堿質(zhì)量）/稱量白屈菜紅堿質(zhì)量×100%。

1.3.4.1 包合比對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響 在包合溫度為60 ℃，包合時(shí)間為1 h的條件下，研究不同包合比（1 ∶1、2 ∶1、4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1）對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響，篩選最佳包合比。

1.3.4.2 包合溫度對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響 在包合時(shí)間為1 h，包合比為6 ∶1的條件下，選取30、40、50、60、70、80 ℃ 6個(gè)包合溫度，篩選不同溫度下HP-β-CD 對(duì)白屈菜紅堿的包合效果，得到最佳包合溫度。

1.3.4.3 包合時(shí)間對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響 在包合比為6 ∶1，包合溫度為60 ℃的條件下，篩選1、2、3、4、5、6 h反應(yīng)時(shí)間下 HP-β-CD對(duì)白屈菜紅堿的包合效果，篩選最佳包合時(shí)間。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響較大的3個(gè)因素，包合比（X1）、包合溫度（X2）和包合時(shí)間（X3）進(jìn)行試驗(yàn)，采用3因素3水平的響應(yīng)面法（RSM） 設(shè)計(jì)，采用多元回歸設(shè)計(jì)方法，以白屈菜紅堿包合率（Y）為響應(yīng)值，通過優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面分析確定最佳的白屈菜紅堿包合參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

單因素試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1軟件統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

以白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品含量（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為豎坐標(biāo)，所繪制的白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=0.741 59+17.113 87x，r2=0.999 95，在 0～46.96 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 HP-β-CD與白屈菜紅堿的配比對(duì)包合率的影響

由圖2可知，白屈菜紅堿包合率隨著包合比的增大而增大，當(dāng)包合比達(dá)到10 ∶1時(shí)包合率達(dá)到44.1%，當(dāng)包合比繼續(xù)增大，白屈菜紅堿包合率開始減小，因此選擇10 ∶1為較佳條件。

2.2.2 包合溫度對(duì)包合率的影響

由圖3可知，白屈菜紅堿包合率隨包合溫度的升高不斷增大，當(dāng)達(dá)到60 ℃時(shí)，白屈菜紅堿包合率達(dá)到44.1%，之后隨包合溫度的升高，包合率開始下降，可能是60 ℃時(shí)包合過程已到達(dá)平衡，溫度降低不利于白屈菜紅堿進(jìn)入羥丙基-β-環(huán)糊精當(dāng)中，溫度升高由于分子運(yùn)動(dòng)加劇，導(dǎo)致形成的包合物脫包合，因此選擇 60 ℃ 為較佳包合溫度。

2.2.3 包合時(shí)間對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響

由圖4可知，白屈菜紅堿包合率隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，攪拌3 h時(shí)包合率達(dá)到71.6%，之后隨包合時(shí)間的延長(zhǎng)包合率下降，可能由于包合時(shí)間較短時(shí)白屈菜紅堿尚未完全進(jìn)入羥丙基-β-環(huán)糊精當(dāng)中，時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致已形成的包合物脫包合。因此選擇包合時(shí)間3 h為較佳條件。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 數(shù)學(xué)模型方程

選取對(duì)包合反應(yīng)影響較大的3個(gè)因素[包合比（X1）、包合溫度（X2）和包合時(shí)間（X3）]進(jìn)行分析，包合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。將表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析，以白屈菜紅堿包合率（Y）為固定量，以包合比（X1）、包合溫度（X2）和包合時(shí)間（X3）為因變量，建立數(shù)學(xué)模型

方程為Y=71.46+8.14X1+1.95X2+0.31X3-2.66X1X2-0.17X1X3+0.39X2X3-12.76X21-4.35X22-0.45X23。對(duì)此模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，通過對(duì)模型方程顯著性檢驗(yàn)，該模型P<0.000 1，達(dá)到極顯著水平（P<0.01），說明該模型高度顯著，失擬項(xiàng)（P=0.412 0>0.05）不顯著，

說明方程與試驗(yàn)擬合度較好，可用于羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合反應(yīng)的分析與預(yù)測(cè)。模型方差分析結(jié)果表明，各影響因素對(duì)白屈菜紅堿包合率影響大小的順序?yàn)榘媳?包合溫度>包合時(shí)間。

2.3.2 包合工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖5 為羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合工藝的響應(yīng)面分析圖。圖5-a顯示包合時(shí)間為3 h時(shí)，羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比與包合溫度對(duì)包合率的影響，包合初始，包合率隨包合溫度的增大而增大，當(dāng)包合溫度達(dá)到一定值后，白屈菜紅堿包合率又略有下降。

圖5-b顯示包合溫度為60 ℃時(shí)，羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比與包合時(shí)間對(duì)包合率的影響，當(dāng)包合時(shí)間較短時(shí)，白屈菜紅堿包合率隨包合比的增大而增大，但隨包合時(shí)間的延長(zhǎng)，包合率先增大后減少。

圖5-c顯示當(dāng)羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比為10 ∶1時(shí)，包合反應(yīng)溫度和包合反應(yīng)時(shí)間對(duì)包合率的影響，在不同包合反應(yīng)溫度下，包合率隨包合時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在不同包合時(shí)間下，白屈菜紅堿包合率隨包合溫度的升高也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在等高線圖橢圓中心和響應(yīng)面3D圖的最高點(diǎn)處存在極大值。

2.3.3 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物包合最優(yōu)工藝條件確定

通過對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析得到的理論最佳工藝條件：包合比為10.30 ∶1，包合溫度為60.74 ℃，包合時(shí)間為3.17 h。在此條件下，羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合率理論最大值為72.88%。但考慮到實(shí)際操作性，將包合參數(shù)進(jìn)一步修訂，最終確定羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的配比為10 ∶1，包合溫度為61 ℃，包合時(shí)間為 190 min，將此條件重復(fù)3次取平均值，得到包合率為72.75%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.178%。證明擬合模型比較可靠，說明采用響應(yīng)面分析的 Box-Behnken 組合設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的白屈菜紅堿包合工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物形成的驗(yàn)證分析

通過對(duì)4種相同濃度的不同溶液（包括羥丙基-β-環(huán)糊精甲醇溶液、白屈菜紅堿甲醇溶液、白屈菜紅堿與羥丙基-β-環(huán)糊精混合物的甲醇溶液以及羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合物的甲醇溶液）進(jìn)行紫外掃描后，其紫外光譜如圖6所示。由于不同物質(zhì)的紫外吸收光譜與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有特定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此不同物質(zhì)的紫外吸收曲線波峰和波谷的位置均有差異。由圖6可知，白屈菜紅堿和白屈菜紅堿-羥丙基-β-環(huán)糊精混合物（混合物）的波峰分別位于318、266.5 nm，羥丙基-β-環(huán)糊精-白屈菜紅堿包合物（包合物）的紫外光譜吸收曲線波峰位于314、266 nm，因此可判定得到的物質(zhì)并不是白屈菜紅堿與羥丙基-β-環(huán)糊精兩者的物理混合物，而是包合物。

3 結(jié)論

近年來環(huán)糊精包合技術(shù)的研究和應(yīng)用越來越多，主要原因是其在提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性以及降低藥物毒性方面有很好的效果，從而拓寬藥物的適用范圍[13]，由于羥丙基-β-環(huán)糊精比母體 β-環(huán)糊精的水溶性更好、且毒性更低，所以選擇羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿進(jìn)行包合。

本試驗(yàn)研究了羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿的包合作用，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化了白屈菜紅堿的包合工藝，最后確定最佳工藝條件：包合比為10 ∶1，包合溫度為61 ℃，包合時(shí)間為190 min，在此條件下白屈菜紅堿包合率達(dá)到72.75%。通過對(duì)因素的交互作用進(jìn)行分析，對(duì)白屈菜紅堿包合率影響的大小順序?yàn)榘媳?包合溫度>包合時(shí)間。經(jīng)紫外光譜驗(yàn)證，包合物已經(jīng)形成。本試驗(yàn)得到的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合物的制備工藝穩(wěn)定、可靠，為白屈菜紅堿新制劑的研究開發(fā)以及拓寬白屈菜紅堿的應(yīng)用領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。

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