涂曉萌， 司 祥， 李 雪

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點實驗室，浙江溫州325027）

同源框轉(zhuǎn)錄因子參與大腦皮質(zhì)的神經(jīng)發(fā)育［1］。在嚙齒類動物胚胎中，同源框轉(zhuǎn)錄因子Otx1（orthodenticle homeobox 1）表達在發(fā)育早期大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞，以及出生后的皮質(zhì)神經(jīng)元中［2-6］。研究顯示，Otx1基因靶向缺失的小鼠具有自發(fā)性的癲癇發(fā)作［5，7］。Otx1 可以自主性調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的電生理特性——大腦皮質(zhì)異位表達Otx1可提高動作電位閾值，并延長爆發(fā)式動作電位之間的時間間隔［8］。動作電位間的時間間隔由復(fù)極化和超極化決定，受外向鉀電流的調(diào)控。電壓門控性鉀通道（Voltagegated potassium channels，Kv）在控制神經(jīng)元的靜息電位以及動作電位的復(fù)極化過程中發(fā)揮著重要的作用［9-10］，它的缺失可增加癲癇發(fā)作的傾向性［11］。因此大腦皮質(zhì)中Otx1的缺失可能調(diào)控Kv的表達或功能。

Otx1敲除小鼠表現(xiàn)出皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少和大腦發(fā)育不全，皮質(zhì)變?。?，12］。此外，2p15-16.1染色體微缺失綜合征的患者表現(xiàn)出智力發(fā)育障礙、自閉癥和小頭畸形［13］，OTX1是該染色體微缺失的基因之一［14-15］，OTX1的缺失可能與小頭畸形有關(guān)。在小鼠大腦中敲減Otx1可延長神經(jīng)前體細胞的分裂期和增殖狀態(tài)，從而使得退出有絲分裂的神經(jīng)元減少。反之，過表達野生型Otx1可增加皮質(zhì)神經(jīng)元的產(chǎn)生，但星形膠質(zhì)細胞瘤相關(guān)的Otx1突變體Y320C不能上調(diào)皮質(zhì)神經(jīng)元的數(shù)目［16］。Otx1 調(diào)控皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量的機制目前尚不清楚。由于發(fā)育期的大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細胞在由增殖轉(zhuǎn)變?yōu)榉至淹顺鰰r會發(fā)生超極化［17-19］，我們設(shè)想 Otx1 也許通過調(diào)節(jié) K+通道和超極化過程，進而影響神經(jīng)細胞的增殖和分化。

本研究利用小鼠神經(jīng)母細胞瘤N2a 細胞作為神經(jīng)細胞的體外模型，采用全細胞膜片鉗記錄分析Otx1對K+外向電流的調(diào)節(jié)，并研究了K+外向電流和細胞增殖之間的關(guān)系。

材料和方法

1 細胞與主要試劑

N2a 細胞購于上海細胞資源中心。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25% trypsin-EDTA 和 HBSS（Hanks'Balanced Salt Solution）購自Gibco。青、鏈霉素和4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）購自Sigma；Opti-MEM 和 Lipofectamine 3000 購自 Invitrogen；點突變試劑盒購自天根生化科技有限公司；Cell-LightTMEdU Imaging Kit購自廣州銳博生物科技有限公司。

2 實驗儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱和CountessTMAutomated Cell Counter（Invitrogen）；PCR擴增儀（Bio-Rad）；激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM 710）。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 N2a 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%-青鏈霉素的DMEM 中。細胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。利用小鼠大腦cDNA文庫通過PCR 擴增，分別得到Otx1和Kv4.2全長。Otx1的上游引物序列為5'-GCTGTTAGCATGATGTCTTACCTCAAACA-3'，下游引物序列為5'-CCTGGGCTCACAAGACCTGGA-3'；Kv4.2的上游引物序列為5'-ATGGCAGCCGGTGTTG-3'，下游引物序列為5'-TTACAAGGCAGACACCCTGA-3'。通過EcoR I 和NotI 酶切位點將基因克隆到pLVX-EF1α-IRES-mCherry 的載體上，得到Otx1-mCherry 和Kv4.2-mCherry，該質(zhì)粒共表達mCherry 作為報告基因。在人星形膠質(zhì)細胞瘤中檢測到OTX1點突變K321T 和Y320C 位于其保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域［16］。于是我們在Otx1-mCherry 上采用點突變試劑盒，分別引入K321T 和Y320C 的點突變。使用Lipofectamine 3000將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到N2a細胞中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。

3.2 EdU 染色 采用Cell-LightTMEdU Imaging Kit（RiboBio）試劑盒，測量N2a 細胞的增殖。將Otx1和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，以每孔3×105的密度接種于24孔板，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入50 nmol/L EdU 繼續(xù)孵育細胞3 h。4%多聚甲醛室溫固定30 min，甘氨酸（2 g/L）清洗5 min，加0.5% Triton X-100處理10 min。加Apollo?熒光染料（100 μL/well）孵育30 min 顯色后，在Zeiss LSM 710 共聚焦顯微鏡下觀察拍照?；谵D(zhuǎn)染細胞的總數(shù)目計算出EdU 陽性（處于DNA合成期）細胞的比例。

3.3 電生理學(xué)記錄 為了研究Otx1 對鉀電流的調(diào)節(jié)作用，參照《Bioelectromagnetism》中關(guān)于Active Behavior of the Cell Membrane 的方法進行電生理學(xué)實驗，記錄分別轉(zhuǎn)染Otx1-mCherry 和對照mCherry、Otx1突變體 K321T 或 Y320C 和對照 mCherry 的 N2a細胞的電生理參數(shù)。所有實驗均在室溫［（22±1）℃］下進行。利用微電極拉制儀P-97拉制記錄所需的玻璃微電極。在記錄電極內(nèi)加入電極內(nèi)液，電極內(nèi)液成分（mmol/L）：KCl 150，MgCl22，HEPES 5，EGTA 5，Glucose 5，Na2ATP 5，用KOH 調(diào)節(jié) pH 為 7.3。玻璃微電極的入液電阻為3～6 MΩ。細胞外液成分（mmol/L）：Na-gluconate 75，NaCl 70，KCl 5，HEPES 5，Glucose 5，pH 7.4。在顯微鏡下操縱微電極接觸細胞，封接電阻達1 GΩ 時，負(fù)壓下吸破細胞膜，使記錄電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液相通，形成全細胞記錄模式。信號經(jīng)Multiclamp 700B 放大，通過數(shù)模轉(zhuǎn)化器Digidata 1332 轉(zhuǎn)換后，在軟件pCLAMP 10.1 下進行數(shù)據(jù)采樣。采樣頻率為2～5 kHz。為消除細胞間的誤差，根據(jù)細胞膜電容和刺激電壓斜率獲得電流密度（pA/pF），并構(gòu)建電壓-電流密度圖。

為了構(gòu)建動作電位的穩(wěn)態(tài)激活和失活曲線，按照結(jié)果部分中描述的步驟給予相應(yīng)電壓刺激后記錄電流。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值（I/Imax），以標(biāo)準(zhǔn)化電流對各階躍電位作圖。構(gòu)建I-V曲線，通過ClampFit 分析，進行Boltzmann 方程擬合。計算半最大激活或失活電壓（voltage for half maximal activation/inactivation，V1/2），該值反映了半數(shù)K+通道激活或失活的難易程度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗至少重復(fù)3 次以上。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。使用Student'st檢驗或單因素方差分析后進行Tukey多重比較檢驗，分析組間差異。以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Otx1促進外向K+電流

為了探索Otx1對神經(jīng)細胞電生理特性的調(diào)節(jié)作用，我們首先克隆了過表達Otx1的Otx1-mCherry。我們將對照載體和Otx1-mCherry 分別轉(zhuǎn)染至N2a 細胞中，24 h 后用全細胞膜片鉗記錄去極化激活的外向電流。為了阻斷電壓門控的Na+和Ca2+電流，在細胞外液中加入 1 μmol/L TTX 和 0.1 mmol/L CdCl2。將鉗制電壓設(shè)置為-90 mV，再施予500 ms、階躍為10 mV、-70～+80 mV 的系列去極化刺激，記錄 N2a 細胞中的電流。如圖1 所示，隨著細胞膜去極化，電流和電流密度增加。因此Otx1過表達對外向電流的產(chǎn)生具有促進作用（圖1A、B）。對照組在+80 mV 時的峰值電流為（329.17±11.30）pA，而Otx1過表達時相同電位下的峰值電流為（616.87±22.50）pA（P＜0.01），見圖1C。當(dāng)CsCl 取代記錄電極內(nèi)外溶液中的KCl 時，該電流消失，證實Otx1 誘導(dǎo)的是電壓依賴的外向K+電流。

Figure 1.Otx1 promoted a voltage-dependent outward current.A：whole-cell patch-clamp currents recorded from Otx1-mCherry- or mCherry-transfected cells（the cells were clamped at a voltage of -90 mV，followed by a series of depolarization stimulations at -70 to +80 mV，10 mV step，and 500 ms duration）；B：the voltage-current density curves of Otx1-mCherry and mCherry groups；C：the peak currents at +80 mV of Otx1-mCherry and mCherry groups.Mean±SEM. n=3.**P＜0.05 vs mCherry group.圖1 Otx1促進電壓依賴型外向電流

2 Otx1對K+電流激活和失活的影響

為了研究Otx1對K+通道的作用，我們檢測了電壓依賴的激活曲線（反映K+通道打開時的難易程度），鉗制電壓為-90 mV，測試電壓為-30 mV，測試前以10 mV 的階躍給予-70～+60 mV 的系列去極化（圖2A）。計算尾電流與其最大值的比值I/Imax，繪制標(biāo)準(zhǔn)化激活曲線（圖2B）。通過Boltzman 方程I/Imax=1/｛1+exp［（Vm-V1/2）/k］｝擬合數(shù)據(jù)后，得出半激活電壓V1/2。對照組V1/2為（-9.68±2.30）mV，Otx1過表達組V1/2為（-12.42±0.70）mV（P＞0.05），見圖2C。這表明Otx1并不影響Kv的激活。

Figure 2.Otx1 did not affect the activation of potassium current.A：outward current and the indicated tail current（arrow）of Otx1-mCherry- or mCherry-transfected cells under the depolarization（the peak tail current was measured at a voltage of -30 mV after the clamping voltage of -90 mV and a series of -70 to +60 mV depolarization）；B：the activation curves measured in mCherry- or Otx1-mCherry-transfected cells，fitted to Boltzmann equation；C：statistical analysis of the voltage for half maximal activation（V1/2）in Otx1-mCherry and mCherry groups.Mean±SEM. n=3.圖2 Otx1對鉀電流的激活無明顯影響

K+通道隨著去極化時間延長而逐漸衰減。K+通道失活的也取決于去極化電壓。為構(gòu)建失活曲線，預(yù)先給予5s、-90～+20 mV 的系列去極化之后，再加上+40 mV 的 250 ms 測試脈沖［14］，以獲得疊加的尾電流（圖3A）。隨著去極化電壓的升高，電流的幅度減小。將去極化電壓和標(biāo)準(zhǔn)化尾電流的曲線通過Boltzmann 方程I/Imax=1/｛1+exp［-（Vm-V1/2）/k］｝擬合計算半失活電壓V1/2。在Otx1 的作用下，I-V曲線左移（圖3B），表明失活過程加快。對照組V1/2為（-19.52±5.70）mV，而Otx1過表達組V1/2為（-37.23±3.30）mV（P＜0.01），見圖3C。

Figure 3.Otx1 accelerated the inactivation of potassium current.A：the current waveforms of mCherry- or Otx1-mCherry-transfected cells under the clamping voltage of -90 mV and a series of -90 to +20 mV stimulations for5s（the tail current was measured at a voltage of +40 mV）；B：the inactivation curves measured in mCherry- or Otx1-mCherry-transfected cells，fitted to Boltzmann equation；C：statistical analysis of the voltage for half maximal inactivation（V1/2）in Otx1-mCherry and mCherry groups.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs mCherry group.圖3 Otx1加速鉀電流的失活

3 Otx1引起外向電流失活后的恢復(fù)時間延長

失活后，Kv逐漸恢復(fù)并為下一次激活做好準(zhǔn)備。為了研究Kv 的重新激活，保持電位在-90 mV，給予3 s、+40 mV 的預(yù)脈沖后，將 N2a 細胞的膜電位鉗回到-80 mV，維持10 ms～4 s 的不等時間。最后在測試脈沖+40 mV 下測量電流，以評估外向電流隨著復(fù)極化時間的恢復(fù)程度（圖4A）。每個測試脈沖下的電流峰值歸一化后，針對復(fù)極化的時間做圖（圖4B）。按單項指數(shù)式求出恢復(fù)時間常數(shù)τ。對照組τ=（143.61±13.90）ms，Otx1過 表 達 組 τ=（293.33±25.70）ms（P＜0.01），見圖 4C。這表明 Otx1 延緩了Kv電流的恢復(fù)。

Figure 4.Otx1 prolonged the recovery time of Kv after inactivation.A：a step jump from -90 mV to +40 mV（3 seconds）was followed by repolarization at-80 mV（the currents were measured at+40 mV after holding at the repolarization for various durations）；B：the normalized peak current（I/Imax）induced by the test pulse was plotted against the time of repolarization at-80 mV；C：statistical analysis of the recovery time constant of outward current in Otx1-mCherry and mCherry groups.Mean±SEM. n=3.**P＜0.05 vs mCherry group.圖4 Otx1延長Kv失活后的恢復(fù)時間

4 OTX1誘導(dǎo)的外向K+電流抑制N2a細胞增殖

為了探討N2a細胞中的K+電流是否受到Otx1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們研究了Otx1 的2 個C 端突變。Otx1突變體K321T和Y320C轉(zhuǎn)染的N2a細胞的外向Kv電流要弱于表達野生型Otx1的細胞（圖5A）。同時與野生型Otx1相比，突變體增加了細胞中EdU 的摻入比例（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5B。Otx1 誘導(dǎo)的K+電流可以被4-AP 阻斷（圖6A、B）。Kv4.2 是受4-AP抑制的K+通道之一。我們克隆了過表達Kv4.2的Kv4.2-mCherry，在 N2a 細胞中轉(zhuǎn)染Kv4.2-mCherry 可增加外向K+電流密度（圖6C）。用EdU 染色結(jié)果顯示，與對照質(zhì)粒的細胞相比，轉(zhuǎn)染Kv4.2的細胞處于增殖期的比例顯著降低（P＜0.01），見圖6D。

Figure 5.The effect of Otx1 mutants on potassium current and cell proliferation.A：the voltage-current density curves were determined in the cells transfected with Otx1 or the mutants（the cells were treated with a series of -70 to+80 mV depolarization in 10 mV step for 500 ms，following holding at-90 mV）；B：the proportion of EdU-positive cells was calculated as the proliferating cells.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Otx1-mCherry group.圖5 Otx1突變體對鉀電流和細胞增殖的影響

Figure 6.The effect of 4-AP on potassium current and cell proliferation.A：the current waveform of mCherry-or Otx1-mCherry-transfected cells；B：the current waveform after adding 3 mmol/L 4-AP to the extracellular fluid；C：the voltage-current density curves from the N2a cells expressing control or Kv4.2 plasmid（the cells were recorded under a series of -70 to+80 mV depolarization in 10 mV steps for 500 ms，following clamping voltage at -90 mV）；D：the proportion of EdU-positive cells were calculated as the proliferating population.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs pCAGEN+RFP-pCAAS group.圖6 4-AP對鉀電流和細胞增殖的影響

討 論

Otx1突變小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性癲癇發(fā)作［5，7］。我們在前期的研究中觀察到，Otx1 調(diào)控皮質(zhì)神經(jīng)元的放電模式［8］。Otx1在大腦皮質(zhì)上皮層中的過表達增加了低興奮性的爆發(fā)式放電神經(jīng)元比例，并改變其放電模式。過表達引起的電生理改變與Otx1突變帶來的變化相反［8］，表明對功能增強的研究可以揭示功能喪失所引起的表型變化。在本課題中，我們研究了過表達Otx1對N2a細胞電生理特性的影響；N2a細胞本身并不表達Otx1。我們觀察到Otx1的異位表達誘導(dǎo)對4-AP 敏感、電壓依賴性的K+外向電流。4-AP 是廣譜的Kv 阻滯劑，因此尚無法確定Otx1 抑制的特定K+通道，但可以排除Kv7.4（該通道受4-AP的激活而增強）［20］。

K+電流是神經(jīng)元膜電位的基礎(chǔ)，也是動作電位復(fù)極化/超極化的決定因素。我們觀察到Otx1 不改變Kv 的激活，但加速其失活，并延長失活后的恢復(fù)過程（圖2～4）。這表明Otx1 對K+電流的調(diào)控可能是其在皮質(zhì)神經(jīng)元中延長爆發(fā)式放電時間間隔的一個重要原因。由此本研究證實了Otx1對皮質(zhì)復(fù)雜神經(jīng)回路的電生理特征具有細胞自主性的調(diào)控作用。

人類OTX1基因位于2 號染色體p15-16.1。染色體2p15-16.1 的微刪除引起智力發(fā)育障礙、自閉癥、癲癇和小頭畸形［14-15，21］。Otx1不僅表達在成熟的神經(jīng)元中，也表達在神經(jīng)前體細胞中。在發(fā)育期皮質(zhì)，敲減Otx1可增加增殖期的神經(jīng)前體細胞，同時減少皮質(zhì)神經(jīng)元的生成［16］。因此OTX1的丟失可能是染色體2p15-16.1 微刪除引起小頭畸形的一個重要因素。但目前尚不清楚OTX1 如何影響皮質(zhì)神經(jīng)元的產(chǎn)生。而在增殖的神經(jīng)前體細胞中也已檢測到電壓門控的K+電流［22-24］。在本研究中，我們觀察到Otx1誘導(dǎo)的外向K+電流與N2a 細胞的增殖有關(guān)。K+電流調(diào)節(jié)Ca2+的流入，同時通過控制膜電位，間接影響Na+梯度依賴的營養(yǎng)物轉(zhuǎn)運，以及細胞體積和細胞內(nèi)的pH［25-26］，因此可能是生理或病理條件下細胞增殖的重要調(diào)節(jié)因素。在后續(xù)研究中，我們需要確定介導(dǎo)Otx1 行為的特定K+通道，以揭示Otx1 調(diào)控神經(jīng)增殖和2p15-16.1微缺失綜合征的分子機制。