黃昌軍，陳學(xué)軍，于海芹，袁誠，劉勇

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家煙草基因工程研究中心，昆明，650021

馬鈴薯Y病毒?。≒otato virus Y，PVY）是我國煙草上的重要病害，每年造成的損失位列十大煙草侵染性病害名單前列[1-2]。種植抗病品種是防控PVY最根本和最經(jīng)濟(jì)有效的措施，但我國烤煙主栽品種云煙87、K326、紅花大金元、云煙97和中煙100等均不抗PVY[3]。優(yōu)良抗源是選育高抗且豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的關(guān)鍵之一。目前煙草育種利用的PVY抗源主要來源于普通煙草（Nicotiana tabacum）Virgin A mutant（VAM），是由Virginia A 經(jīng)X-射線輻射誘變而來[4]。誘變導(dǎo)致包含eIF4E1-S基因的染色體片段缺失（以va表示）。普通煙草eIF4E1-S突變也能獲得PVY抗性[5]。普通煙草為異源四倍體，具有N.sylvestris和N.tomentosiformis兩套基因組，其中eIF4E1-S（感病基因）來源于N.sylvestris，可被PVY利用，完成病毒的侵染循環(huán)；同源基因eIF4E1H-T（非感病基因）來源于N.tomentosiformis，不能被PVY利用[6]。劉勇等根據(jù)eIF4E1-S基因及其家族基因的序列信息，開發(fā)出分子標(biāo)記CF2GR11，利用該標(biāo)記明確普通煙草常見抗源缺失eIF4E1-S基因[7]。普通煙草中PVY抗源稀少[8-9]，而煙草野生種中PVY抗源較多。Sievert（1972）[10]采用一個PVY分離物接種62個野生種、14份可育的種間雜交種和近1000份TI編號的美國外引種質(zhì)，篩選出11個野生種和TI 1406抗PVY，其他材料均感PVY。Burk（1982）[11]采用3個PVY株系PVY MSMR、MSNRNSNR接種，從40個野生種、99個煙草品系中，篩選出5個野生種對3個株系免疫、1個品系（VY32）具有對PVY的抗性。Dijk and Cuperus（1989）[12]采用3個PVY株系PVYO、PVYN、PVYC的3個分離物鑒定了60個煙草野生種的抗性。提出安第斯山脈中部（PVY病毒可能起源地）的圓錐煙草組（Paniculatae）的野生種對PVY的抗性較強(qiáng)。Doroszewska and Depta（2011）[13]采用3個PVY株系PVYNW、PVYNZ、PVYNTN（分別包含可克服和不能克服va抗性分離物）鑒定了包含68個野生種的96份資源的抗性。其中N. raimondii，N. knightiana，N.glauca N. benavidesii，N.wigandioides，N. noctiflora和N.africana抗所有實(shí)驗(yàn)株系。由于PVY分離物不同和種質(zhì)的“同名異物”現(xiàn)象，不同研究者對野生種的PVY抗性評價結(jié)果可能存在一些差異，但普遍認(rèn)為野生種中存在較多PVY抗源。發(fā)掘利用上述野生種中的PVY抗性，可豐富栽培煙草抗PVY基因資源。

由于野生種與普通煙草的染色體倍性和數(shù)量存在較大差異，野生種與普通煙草之間普遍存在生殖隔離，將野生種的抗性轉(zhuǎn)育至普通煙草中難度大、工作量大。因此，首先確定野生種中是否存在抗PVY新基因，再對包含抗PVY新基因的野生種進(jìn)行抗性轉(zhuǎn)育，可顯著提高育種效率。煙草野生種PVY抗性包括三種可能：感病基因eIF4E1-S缺失/突變、存在新抗病基因、二者共存。普通煙草eIF4E1-S蛋白能被PVY利用而完成病毒侵染循環(huán)（eIF4E1-S可當(dāng)成感病基因），eIF4E1H-T蛋白不能被PVY利用（eIF4E1H-T可當(dāng)成“非感病基因”），植物感馬鈴薯Y病毒屬病毒（Potyviruses）的eIF4E蛋白存在保守的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域（loop1和loop2）[5,14]?？赏ㄟ^比較煙草野生種loop1和loop2氨基酸序列來判斷是否含有感病基因。本文采用普通煙草eIF4E1-S和eIF4E1H-T基因cDNA特異引物擴(kuò)增測序，分析了34個野生種eIF4E1同源基因的多樣性、感馬鈴薯Y病毒屬病毒關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域（loop1和loop2）氨基酸差異；鑒定了PVY抗性。提出假說“在存在eIF4E1-S感病基因的情況下，抗PVY野生種攜帶抗PVY新基因的可能性高；在不存在eIF4E1-S感病基因（包括存在eIF4E1H-T）的情況下，抗PVY野生種攜帶抗PVY新基因的可能性較低”。根據(jù)假說預(yù)測了抗PVY野生種含有抗PVY新基因的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

34個煙草野生種由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存（見表1）。野生種采用漂浮盤育苗，3～4片葉時，移栽到裝填育苗基質(zhì)的直徑10 cm的塑料花盆中。4-5片葉時，采集幼葉提取核酸。

1.2 抗性鑒定

在防蟲塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。按常規(guī)方法漂浮育苗，在15孔的苗盤中，每份資源定植15株苗，苗齡60 d左右，采用高壓噴槍摩擦接種PVY壞死株系（ZT-5）。方法如下：采集經(jīng)免疫檢測試紙條檢測為PVY的新鮮病葉，在無菌研缽中，加接種緩沖液（0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液）研磨，雙層紗布過濾，調(diào)整接種液的濃度至1:100重量體積比，在病葉汁液中加入1%過孔徑0.075 mm篩孔的化學(xué)純二氧化硅。高壓噴槍噴射壓力為1 kg/cm2，噴槍口距離接種葉20 cm左右，每株苗噴射接種時間約為0.5 s。接種后立即用噴壺噴少量自來水，提高接種效率。煙苗接種后14 d開始調(diào)查發(fā)病情況，每7 d一次，連續(xù)調(diào)查3次，計算發(fā)病率。最后一次調(diào)查發(fā)病率小于或等于35%判斷為抗??；發(fā)病率大于或等于50%判斷為感病。發(fā)病率在35%～50%之間的野生種判斷為中抗，本文剔除了中抗的野生種。部分野生種的PVY抗性引自Doroszewska（2011）[13]，R表示抗PVYNW(-)分離物和/或PVYNTNPol(-)分離物，S表示感PVYNW(-)分離物且感PVYNTNPol(-)分離物。

1.3 核酸提取與cDNA合成

每份野生種挑選3個單株，分別取幼葉提取DNA和RNA。DNA提取采用CTAB法或者Qiagen DNA 提取試劑盒。RNA提取采用Trizol方法。采用Nanodrop測定DNA濃度和質(zhì)量。將質(zhì)量和濃度合格的DNA稀釋至100 ng/μL備用。采用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行cDNA合成。

1.4 eIF4E1引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

eIF4E1-ScDNA（GenBank序列號KF155696.1，MN896999） 全 長660 bp。eIF4E1H-T的cDNA（GenBank序 列 號KM202068；MN897010）全 長657 bp。通過比對eIF4E1-S和eIF4E1H-T的cDNA序列，設(shè)計可特異擴(kuò)增eIF4E1-ScDNA全長的引物CF3/CR3，上游引物CF3位于eIF4E1-ScDNA起始密碼子ATG前第15-37個堿基, 下游引物CR3位于eIF4E1-ScDNA起始密碼子后第654-674個堿基。同樣設(shè)計擴(kuò)增eIF4E1H-T同源基因cDNA部分序列的引物CF4/CR4：上游引物CF4位于eIF4E1H-TcDNA起始密碼子ATG前第22-67個堿基，下游引物CR4根據(jù)eIF4E1H-T的cDNA序列起始密碼子ATG后第608-629位堿基設(shè)計。CF3/CR3可特異擴(kuò)增出eIF4E1-S，CF4CR4可同時擴(kuò)增出大部分供試野生種eIF4E1同源基因。對野生種首先采用CF3/CR3擴(kuò)增，若CF3/CR3擴(kuò)增陰性則采用CF4/CR4擴(kuò)增。剔除CF3/CR3和CF4/CR4都無擴(kuò)增產(chǎn)物的野生種。

擴(kuò)增eIF4E1基因cDNA全長序列的引物對為CF3：5′-TAAAATCTATAACTAAGTACATA-3′，CR3：5′- CCATTGTAGCAAGAAAACTAT-3′，擴(kuò)增片段大小約為715 bp，退火溫度48℃。擴(kuò)增eIF4E1H-T基因cDNA部分序列的引物對為CF4：5′-GAAAACACACGAAAATGGCAGAG-3′，CR4：5′-CTGCCGAGCCTCATTGAGTCGT-3′，擴(kuò)增片段大小約為645 bp，退火溫度48℃。擴(kuò)增煙草內(nèi)參基因Actin的特異引物為Actin-F:5′-AAGGGATGCGAGGATGGA-3′，Actin-R 5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′，擴(kuò) 增 片 段 大小為160 bp，退火溫度58℃。PCR 反應(yīng)體系總體積均為20 μL，其中30～50 ng/μL cDNA 樣品2.5 μL、10×PCR buffer 2.0 μL， dNTPs 1.2 μL，引 物 各1.5 μL，rTaq DNA酶0.3 μL，ddH2O 12.6 μL。所用試劑購自寶生物公司。PCR反應(yīng)在Ependorff梯度擴(kuò)增儀上（Master Cycler）上進(jìn)行。擴(kuò)增的程序?yàn)椋?）94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸1 min，共28個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存；采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

1.5 測序與序列分析

采用PCR產(chǎn)物直接測序或者克隆測序。每份野生種取3個單株葉片樣品作為3個生物學(xué)重復(fù)樣品，分別提取總RNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個樣品PCR膠回收產(chǎn)物或者一個克隆雙向測序。采用MEGA6比對序列，手工校正3次重復(fù)測序中個別差異堿基，確定3次測序結(jié)果一致的一條序列，代表該野生種的eIF4E1同源基因的cDNA序列。采用MEGA6軟件UPGMA方法構(gòu)建cDNA或推導(dǎo)氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生種eIF4E1-S同源基因擴(kuò)增與PVY抗性

eIF4E1-S基因的特異引物CF3/CR3可特異擴(kuò)增普通煙和N.sylvestris的eIF4E1-S基因cDNA全長。CF4/CR4引物可同時擴(kuò)增出N.tomentosiformis eIF4E1H-T基因和N.sylvestris的eIF4E1-S基因cDNA部分序列。34個煙草野生種可擴(kuò)增出目標(biāo)條帶如表1所示。其中19個野生種至少抗一個PVY分離物，11個野生種同時感供試的6個PVY分離物，4個野生種的PVY抗性不明。感PVY的野生種能擴(kuò)增出eIF4E1-S基因，而抗PVY的野生種有的擴(kuò)增出eIF4E1-S基因、有的擴(kuò)增出其同源基因。

2.2 抗PVY野生種eIF4E1-S同源基因的多態(tài)性與含有抗PVY新基因的可能性

通過測序獲得野生種eIF4E1-S同源基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，如果同一個野生種同時擴(kuò)增出eIF4E1-S和eIF4E1H-T的同源基因，選用eIF4E1-S同源基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。文獻(xiàn)報道植物eIF4E蛋白表面帽結(jié)合袋（cap binding pocket）附近的2個結(jié)構(gòu)域決定其對PVY屬病毒的感病性[15]。普通煙草感PVY基因eIF4E1-S編碼的loop1氨基酸序列為WFDNPMAKSRQAAWGSS（第53-69位氨基酸）、loop2為 INHPSKLVVG（第89-98位氨基酸）[14]。在MEGA6軟件UPGMA方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上（圖1），絨毛煙草組（Tomentosae）的4個抗PVY野 生 種N.otophora、N.setchelli、N.tomentosa、N.tomentosiformis的同源基因與eIF4E1H-T聚成一組。上述4個野生種同源基因編碼的loop1與eIF4E1H-T的一致、loop2與eIF4E1-S和eIF4E1H-T僅存在V97A，M，N，T差異。推測這4個野生種的eIF4E1-S同源基因進(jìn)化為eIF4E1H-T，獲得對PVY部分株系的抗性。且這4個野生種都不抗可克服va抗性的PVY突變株系[13]，因此，這4個野生種包含抗PVY新基因的可能性較小。圓錐煙草組（Paniculatae）的4個抗PVY野生種N.benavidesii、N.raimondii、N.knightiana聚成一組、N.cordifolia在較遠(yuǎn)分支，同源基因的氨基酸序列與eIF4E1-S一致率高于eIF4E1H-T。上述4個野生種loop1和loop2氨基酸序列相互之間差異較大，與eIF4E1-S和eIF4E1H-T都不相同，這4個野生種的PVY抗性既可能來源于eIF4E1-S基因突變又可能來源于抗PVY新基因。因此，這4個野生種包含抗PVY新基因的可能性中等。

表1 煙草野生種的PVY抗性與eIF4E1-S同源基因的cDNA檢測Tab. 1 PVY resistance of wild species and eIF4E1-S homologs cDNA detection

其他抗PVY和感PVY野生種聚為一個大的分支。該分支中與eIF4E1-S聚成一個小分支的N.glauca、N.noctiflore、N.africana高抗供試的5個PVY分離物（包含可克服va抗性的PVY分離物）。氨基酸序列比對結(jié)果表明N.glauca和N.noctiflore的同源基因與eIF4E1-S蛋白分別只有7個和4個氨基酸酸差異，其中l(wèi)oop1氨基酸序列與eIF4E1-S相同，loop2與eIF4E1-S之間只有1-2個氨基酸差異（N.glauca為K94E+V97M，N.noctiflore為V97M），N.glauca和N.noctiflore之間只有一個相同的差異位點(diǎn)（未列出數(shù)據(jù)）。推測N.glauca和N.noctiflore的PVY抗性與eIF4E1-S的氨基酸突變無關(guān)，存在新的抗PVY基因的可能性高。N.africana同源基因編碼的loop1與eIF4E1-S和eIF4E1H-T差異較大、loop2與eIF4E1-S之間只有1個氨基酸差異（V97M）。N.africana存在抗PVY新基因的可能性稍低于N.glauca和N.noctiflore。Lewis等報道[16]N.africana存在與va不同的PVY抗性。N.longiflora的同源基因與eIF4E1-S聚成一個小分支，loop1氨基酸序列與eIF4E1-S相同，loop2只存在V97M差異，但只抗PVYNW(-)分離物。N.longiflora存在抗PVY新基因的可能性高，但育種價值較小。

圖1 煙草野生種eIF4E1-S同源基因推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(UPGMA)Fig.1 System Evolution tree (UPGMA) for eIF4E1-S homologs deduced amino acid sequences of tobacco wild species

2.3 感PVY野生種關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域高度保守

文獻(xiàn)報道普通煙草感PVY蛋白eIF4E1-S的loop1和loop2與VPg誘餌蛋白eIF4E1H-T存在較大差異（圖2）。本文11個感病野生種的loop1氨基酸序列與eIF4E1-S一致、且其中8個感病野生種的loop2只存在V97M/A差異，N.glutinosa的loop2 只存在G98N差異，N.repanda的loop2只存在H89L差異。表明感PVY野生種eIF4E-S蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域高度保守。

圖2 抗感PVY野生種的loop1和loop2氨基酸比較Fig.2 Comparison of loop1 and loop2 amino acids of wild species with PVY resistance

3 討論

3.1 煙草野生種PVY抗性與eIF4E1-S基因的關(guān)系

煙草育種長期利用eIF4E1-S缺失的抗源（va），田間已出現(xiàn)可克服va抗性的突變病毒[14,17-19]，表明va品種的抗性持久性不夠高；eIF4E1-S基因移碼突變體或無義突變體的抗性持久性低于va，不能滿足抗病育種需要。因此，有必要在野生種中發(fā)掘不同于eIF4E1-S基因缺失或者突變的新抗病基因。鑒定篩選抗PVY的野生種相對容易，采用常規(guī)的摩擦接種抗性鑒定即可。但分析抗PVY野生種是否存在新抗病基因難度很大，因?yàn)榇蟛糠忠吧N與普通煙草、野生種之間存在生殖隔離，幾乎不可能利用常規(guī)雜交方法分析抗病基因是否等位。野生種PVY抗性包括三種可能：感病基因缺失/突變、存在新抗病基因、二者共存。本文嘗試?yán)猛椿蚩寺y序方法預(yù)測野生種存在新抗病基因的可能性，并提出如下假說：在存在eIF4E1-S感病基因的情況下，抗PVY野生種攜帶抗PVY新基因的可能性高；在不存在eIF4E1-S感病基因（包括存在eIF4E1H-T）的情況下，抗PVY野生種攜帶抗PVY新基因的可能性較低。

幾篇文獻(xiàn)報道感PVY屬病毒的eIF4E蛋白表面存在loop1和loop2關(guān)鍵氨基酸結(jié)構(gòu)域[14-15,21-22]，如：抗PVY辣椒種質(zhì)資源的2個loop存在非同義突變、這些氨基酸突變與抗性有關(guān)[23]。感病辣椒的這兩個結(jié)構(gòu)域的單個或幾個關(guān)鍵氨基酸突變可獲得PVY抗性。通過比較野生種loop1和loop2氨基酸序列來判斷野生種是否含有感病基因。本文再進(jìn)一步推測：抗PVY野生種的loop1和loop2氨基酸序列與eIF4E1-S基因相同，則該野生種含有抗PVY新基因的可能性高；抗PVY野生種的loop1和loop2氨基酸序列與eIF4E1-S基因不同（包括與eIF4E1H-T相同），則該野生種含有抗PVY新基因的可能性較低。在排除個別野生種eIF4E1-S同源基因缺失/突變、且含有抗PVY新基因的情況下，某個野生種loop1和loop2氨基酸序列與eIF4E1-S的多樣性越高，則越可能喪失PVY感病性，含有新抗病基因的可能性較低。

3.2 野生種eIF4E1-S同源基因多樣性與抗PVY新基因可能性

本文分析了34個抗/感PVY野生種的eIF4E1-S同源基因的推導(dǎo)氨基酸序列，表明野生種eIF4E1-S同源基因之間存在較大的多樣性，感PVY屬病毒的eIF4E1蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域loop1和loop2的氨基酸序列高度保守。其中10個感PVY野生種loop1氨基酸序列與eIF4E1-S一致、其中8個野生種loop2僅在V97M, A存在差異。表明感PVY野生種loop1和loop2的保守性顯著高于抗PVY野生種。根據(jù)以上假說，本文預(yù)測了野生種中存在抗PVY新基因的可能性高低。絨毛煙草組（Tomentosae）的4個 野 生 種N.otophora、N.setchelli、N.tomentosa、N.tomentosiformis的PVY抗性可能與eIF4E1進(jìn)化為eIF4E1H-T有關(guān)，其育種利用價值不大。因?yàn)楦蠵VY的普通煙中存在eIF4E1H-T。圓錐煙草組（Paniculatae）的4個抗PVY野 生 種N.benavidesii、N.raimondii、N.cordifolia、N.knightiana推導(dǎo)的氨基酸序列與eIF4E1-S一致率高于eIF4E1H-T，loop1 和loop2與eIF4E1-S存在較為隨機(jī)的2-6個氨基酸差異，這些氨基酸變異可能導(dǎo)致與PVY VPg不能互作，獲得PVY抗性。因此，圓錐煙草組4個抗PVY野生種包含抗PVY新基因的可能性中等。

根據(jù)loop1 和loop2的變異較小且抗多個PVY分離物，推測N.glauca、N.noctiflore存在新的高抗PVY基因的可能性高、N.africana其次。N.africana作為父本可與普通煙雜交結(jié)實(shí)，產(chǎn)生母本來源的單倍體和混倍體，其PVY抗性已經(jīng)部分轉(zhuǎn)育至普通煙中[16]，可增強(qiáng)va抗性，對可克服va抗性的PVY突變株系也有一定的抗性。尚未見N.glauca、N.noctiflore的PVY抗性轉(zhuǎn)育至普通煙草中的報道，發(fā)掘利用煙草野生種的抗PVY新基因推薦以N.glauca、N.noctiflore、N.africana為重點(diǎn)。

PVY抗性不明確的N.quadrivalvis的loop1和loop2氨基酸序列與eIF4E1-S一致，推測其不是感PVY就是存在新抗病基因。PVY抗性不明確的N.rustica，N.wigandioides的loop1與eIF4E1H-T一致率較高，與eIF4E1H-T存在5個氨基酸差異，如果抗PVY，則其抗性可能與同源基因進(jìn)化為eIF4E1H-T有關(guān)，因此，含有抗PVY新基因的可能性中等。

3.3 感PVY同源基因克隆測序法的可行性與局限性

煙草屬野生種大部分為二倍體，少數(shù)為異源四倍體。高質(zhì)量的全基因組數(shù)據(jù)或者全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可從全局上分析野生種eIF4E1-S同源基因。但因?yàn)闊煵莼蚪M巨大和重復(fù)序列多，導(dǎo)致近期內(nèi)難以獲得30多份野生種的基因組數(shù)據(jù)或全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。本文嘗試采用同源基因克隆測序方法預(yù)測野生種存在抗PVY新基因的可能性，為目前可行的嘗試。我們根據(jù)普通煙草的eIF4E1-S、eIF4E1H-T和祖先種同源基因設(shè)計引物擴(kuò)增測序，本文獲得了34個野生種eIF4E1同源基因的cDNA序列。其他3個野生種（N.auculis和N.sanderae，N. petuniodes）供試引物擴(kuò)增不成功、7個野生種的個別氨基酸存在疑問，未采用同源基因分析方法預(yù)測抗PVY野生種是否存在新的抗PVY基因。eIF4E1-S同源基因克隆測序法的局限性在于，野生種同源基因的變異較大，難以設(shè)計可擴(kuò)增所有野生種的通用引物。四倍體野生種的同源基因可能存在兩個拷貝，導(dǎo)致克隆測序時個別氨基酸序列不一致。

4 結(jié)論

根據(jù)eIF4E1-S同源基因的多樣性，將抗PVY煙草野生種存在抗PVY新基因（即不屬于eIF4E1-S基因缺失或突變）的可能性劃分為高、中和低三檔。N.glauca、N.noctiflore、N.africana含有新的抗PVY基因可能性高于其他供試野生種，可作為重點(diǎn)抗源研究利用。