高志壕

四川省巴中市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 636600

胰島素瘤是最常見(jiàn)的功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasia,pNEN)，起源于胰島β細(xì)胞，表現(xiàn)為大量胰島素陣發(fā)性分泌導(dǎo)致低血糖反復(fù)發(fā)作，根據(jù)典型whipple三聯(lián)征(反復(fù)發(fā)作的低血糖癥狀、發(fā)作時(shí)血糖<2.8mmol/L、供糖后癥狀迅速緩解)聯(lián)合激素水平測(cè)定診斷并不難。但胰島素瘤患者常伴發(fā)精神失常、癲癇發(fā)作、意識(shí)障礙等中樞神經(jīng)精神癥狀甚至以此為首發(fā)、主要表現(xiàn)，此種患者不僅極易誤診為癲癇、癔癥、腦血管病等其他疾病[1]，長(zhǎng)期的高胰島素、低血糖狀態(tài)還會(huì)導(dǎo)致智力低下甚至不可逆癡呆[2]，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前胰島素瘤的主流治療手段是外科手術(shù)，大部分胰島素瘤都是良性腫瘤，但其幾乎都有惡變潛能，故而早期發(fā)現(xiàn)、治療是非常重要的。胰島素瘤的病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，推測(cè)可能是一個(gè)復(fù)雜多基因疾病。近年來(lái)隨著基因芯片及高通量測(cè)序等現(xiàn)代生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，利用生物信息學(xué)分析大數(shù)據(jù)可以從理論上初步揭示許多腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制。本研究選擇GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的胰島素瘤相關(guān)基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集，依托生物信息學(xué)探討胰島素瘤分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 以“insulinoma”為關(guān)鍵詞，物種限定為“homo sapiens”,研究類型選擇“expression profiling by array”，在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到由Anguraj Sadanandam等在2016年1月更新的數(shù)據(jù)集GSE73338。該數(shù)據(jù)集來(lái)源于英國(guó)倫敦癌癥研究所，采用18.5K human oligo microarrays obtained from the Ohio State University Cancer Center平臺(tái)，內(nèi)含97個(gè)數(shù)據(jù)樣本，其中17個(gè)胰島素瘤組織、4個(gè)正常胰島組織、63個(gè)非功能性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織、5個(gè)正常胰腺組織、7個(gè)已轉(zhuǎn)移的胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織、1個(gè)未明確分類的功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織，剔除非功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等組別資料，僅分析17例胰島素瘤及4例正常胰島對(duì)照組織數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集共包含15 961個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)自帶數(shù)據(jù)分析工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)比較胰島素瘤患者組與正常胰島組織基因表達(dá)，下載原始數(shù)據(jù)后按照adj.P.value<0.01 且差異倍數(shù)(Fold change,FC)≥4的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)，并繪制火山圖分析差異基因分布。

1.3 基因本體論與信號(hào)通路分析 利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(FDR<0.05,P值<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析、Hub基因篩選 利用基因、蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析DEGs的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)。借助Cytoscape 3.7.2軟件可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖，通過(guò)CytoHubba插件的MNC算法獲取得分最高的前10個(gè)基因(Hub基因)。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選結(jié)果 本研究選擇基因轉(zhuǎn)錄譜芯片GSE73338，以校正后Padj<0.01,|log2FC|≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出胰島素瘤相關(guān)DEGs共319個(gè)，其中包括140個(gè)上調(diào)基因和179個(gè)下調(diào)基因。然后以logFC為橫坐標(biāo)，以校正后P值的負(fù)對(duì)數(shù)-log10(adj.P.Val)為縱坐標(biāo)，對(duì)DEGs進(jìn)行可視化，得到火山圖(圖1)。

圖1 胰島素瘤DEGs的火山圖

2.2 GO、KEGG分析 GO分析結(jié)果顯示，DEGs在生物過(guò)程中主要涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)TNF/IL1反應(yīng)、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、中性粒細(xì)胞趨化正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控，分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合，細(xì)胞組成主要在細(xì)胞表面和細(xì)胞外隙。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，DEGs主要涉及TNF信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號(hào)通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、非洲錐蟲病和瘧疾。見(jiàn)表1。

2.3 PPI分析、Hub基因結(jié)果 DEGs編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中(已排除其中孤立的蛋白質(zhì)，“可信度”為0.4)，共包含節(jié)點(diǎn)蛋白 314個(gè)，邊 741條(圖2)。

圖2 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 胰島素瘤中DEGs的GO分析和KEGG分析

依據(jù)MNC算法得分前10位基因?yàn)榘捉樗?6(Interleukin 6,IL6)、CXC趨化因子配體8(Cysteine X chemokine ligand 8,CXCL8)、白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL1β)、β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta A4 protein, APP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1/CCL2)、CD44(Cluster of differentiation 44)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α[chemokine (C-C motif )ligand 20,CCL20]、CXC趨化因子配體2(Cysteine X chemokine ligand 2,CXCL2)、細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM1),見(jiàn)圖3。

圖3 MNC算法中排名前10名的基因

3 討論

pNEN是源于胰腺多能神經(jīng)內(nèi)分泌干細(xì)胞的一類腫瘤，依據(jù)激素分泌及相關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)與否，pNEN可分為功能性和無(wú)功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(Functional pNEN,F-pNEN；Non-functional pNEN,NF-pNEN)，其中大部分pNEN是NF-pNEN。目前關(guān)于pENE的發(fā)病機(jī)制研究多集中于NF-pNEN,而F-pNEN有著其獨(dú)特的遺傳機(jī)制。一項(xiàng)對(duì)胰島素瘤患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn)胰島素瘤常出現(xiàn)正常拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)和擴(kuò)增CNV，而CNV正常的胰島素瘤表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄因子YY1(Yin-Yang1,YY1)基因突變率[3]。目前胰島素瘤的病因目前仍不清楚，本研究通過(guò)挖掘胰島素瘤患者胰島組織基因芯片數(shù)據(jù)，有助于胰島素瘤發(fā)病機(jī)制研究。

本研究通過(guò)GEO2R對(duì)GSE73338數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，篩選出319個(gè)DEGs,包括140個(gè)上調(diào)基因和179下調(diào)基因。GO分析提示DEGs主要分布在細(xì)胞表面、外隙中，在蛋白質(zhì)結(jié)合、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)TNF/IL1反應(yīng)等生物過(guò)程中顯著富集。KEGG分析顯示DEGs主要參與TNF信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路。接著構(gòu)建了DEGs編碼蛋白間的PPI網(wǎng)絡(luò)圖并利用Cytoscape軟件cytohubba插件篩選出10個(gè)Hub基因，包括IL6、CXCL8、IL1β、APP、CCL2、CD44、CCL20、CXCL2、ICAM1、VCAM1，但這些基因在胰島素瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用尚未研究。

慢性炎癥與許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這主要是因?yàn)槟[瘤微環(huán)境的形成。腫瘤微環(huán)境由單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞、多種細(xì)胞因子(趨化因子、黏附因子、炎癥因子等)和細(xì)胞外基質(zhì)等元素組成，其在瘤細(xì)胞形成、腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、耐藥性誘導(dǎo)等諸方面發(fā)揮重要作用[4]。作為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要成員，細(xì)胞因子(Cytokine,CK)在免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、腫瘤演進(jìn)等生理或病理進(jìn)程中發(fā)揮著舉重若輕的作用。CK是由多種細(xì)胞(主要是單核、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞)經(jīng)絲裂原等刺激后分泌的小分子蛋白物質(zhì)的統(tǒng)稱，從其發(fā)揮的生物學(xué)功能角度，CK可分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、趨化因子等等。其中的趨化因子根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同又可以分為C、CC、CXC和CX3C四個(gè)亞族。白細(xì)胞介素-1β/6/8 (IL1β/6/8)在其中是比較重要的促炎細(xì)胞因子。IL1β是白介素-1家族中的一員，主要是由單核細(xì)胞產(chǎn)生，在大多數(shù)腫瘤(乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、肺癌等)中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)激活MAPK和NF-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮促炎、促腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等功能[5]。IL6可由IL1β和腫瘤壞死因子激活，它不僅是TNF信號(hào)通路的參與者，同時(shí)也在JAK/STAT和MAPK通路活化中起到關(guān)鍵作用，而IL6/STAT3通路對(duì)胰腺疾病進(jìn)展具有調(diào)控作用[6]。CXCL8是腫瘤微環(huán)境內(nèi)的顯著調(diào)節(jié)因子，常常被稱為IL8，不僅可以直接作用腫瘤細(xì)胞使其增生，同時(shí)還參與腫瘤血管生成、阻滯細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞間及細(xì)胞和基質(zhì)間黏附等促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移[7]。研究發(fā)現(xiàn)CXCL8在結(jié)直腸癌、黑色素瘤、甲狀腺癌等腫瘤中高表達(dá)，同時(shí)還能預(yù)示胰腺癌患者預(yù)后[8]。簡(jiǎn)而言之，IL1β、IL6/8在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，這與腫瘤的分期和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)。而CCL2和CCL20都是趨化因子CC亞族中的成員，其中CCL2通過(guò)結(jié)合CC類趨化因子受體2募集單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，從而參與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明CCL2在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)程度密切相關(guān)[9]。CCL20，它是通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的CCR6發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用。Rubie C等檢測(cè)慢性胰腺炎、胰腺囊腺瘤、胰腺癌組織中CCL20的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL20在胰腺癌中顯著高表達(dá)[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)在胰島素瘤組織中IL1β、IL6/8、CCL2和CCL20表達(dá)水平顯著下調(diào)，這可能是因?yàn)榧{入的標(biāo)本幾乎都是良性胰島素瘤組織。

APP是一種具有多種生物學(xué)功能的跨膜蛋白，除了因酶活性障礙導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白在大腦中過(guò)度沉積促使阿爾茲海默癥的發(fā)生，研究證明它也能介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間的粘連作用。已有研究發(fā)現(xiàn)APP在胰腺癌細(xì)胞及其細(xì)胞上清中高表達(dá)[11]。ICAM1和VCAM1都是比較重要的細(xì)胞黏附因子，隸屬于免疫球蛋白超家族的成員，可以通過(guò)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。正常情況下在血管內(nèi)皮表達(dá)量很低，而在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[12-13]。CD44有標(biāo)準(zhǔn)型CD44s和變異型CD44v兩種形式，前者主要在造血細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，后者在上皮和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。CD44通過(guò)與透明質(zhì)酸結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)黏附，研究表明CD44與腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。CD44、APP、ICAM1和VCAM1基因均參與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附過(guò)程，但其可能在胰島素瘤發(fā)生發(fā)展甚至惡變進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

查閱PubMed等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，截至2021年1月12日，對(duì)GSE73338基因芯片進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘的文獻(xiàn)有2篇，1篇來(lái)自中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院團(tuán)隊(duì)[15]，他們分別對(duì)WHO不同分級(jí)的pNEN、良惡性的pNEN、轉(zhuǎn)移與否的pNEN和伴隨MEN1基因突變與否的pNEN進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，主要是探討pNEN的分期分級(jí)、侵襲和轉(zhuǎn)移背后的分子機(jī)制。另一篇?jiǎng)t來(lái)自湖北省十堰市太和醫(yī)院[16]，他們對(duì)GSE7338中17個(gè)胰島素瘤和8個(gè)胰腺組織進(jìn)行了差異基因篩選、GO、KEGG分析、Hub基因篩選，共獲得了1 632個(gè)DEGs(1 117個(gè)上調(diào)、514個(gè)下調(diào))，分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)DEGs與胰島素分泌密切相關(guān)，下調(diào)差異基因富集于胰腺分泌，同時(shí)發(fā)現(xiàn)7個(gè)Hub基因，分別是：GCG、GCGR、PLCB1、 CaSR、 F2R 、GRM1和GRM5。該研究所得差異基因數(shù)量眾多，富集分析，Hub基因篩選和本研究結(jié)果不一致，主要是因?yàn)樗{入的8個(gè)胰腺組織包含本研究的3個(gè)正常胰島對(duì)照，對(duì)照不同，研究結(jié)果自然有差異。本研究可與之互為補(bǔ)充，從而更好地理解胰島素瘤的發(fā)生機(jī)制。

綜上，本研究通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中胰島素瘤相關(guān)基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行挖掘，篩選出319個(gè)DEGs并對(duì)它們進(jìn)行GO、KEGG和PPI分析，最終篩選出10個(gè)核心基因，但要想明確它們?cè)谝葝u素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用還需要臨床資料結(jié)合免疫組化等實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。