轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆的食用安全評價研究進(jìn)展

張鳳， 賀曉云，2， 黃昆侖，2， 汪其懷

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京100176

田間雜草會影響作物生長和產(chǎn)量，傳統(tǒng)的物理除草方法雖然安全，但是費(fèi)時費(fèi)力?；瘜W(xué)除草可以更加高效地除掉雜草，并降低成本，然而化學(xué)除草劑的過量使用或不當(dāng)選擇會造成環(huán)境污染、無法完全治理雜草等問題[1]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗除草劑基因轉(zhuǎn)移至作物，使其具有耐受除草劑的特性，在減少除草劑使用的同時，提高產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因大豆是目前世界上種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因作物，其中，大多數(shù)種植品種為轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆[2]。盡管轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆已經(jīng)被大量應(yīng)用于食品，其食用安全性仍然受到質(zhì)疑。本文對轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆進(jìn)行了概述，分析了其存在的安全性問題，并詳細(xì)闡述了食用安全性評價方法，以期為轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆建立安全評價體系提供理論基礎(chǔ)。

1 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆概況

1996 年，美國孟山都公司研發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆（GTS）40-3-2 品系被第一個批準(zhǔn)用于商業(yè)化種植[3]。至2017 年，全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積已超過9 000 萬hm2，占所有轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%，美國、巴西等作為轉(zhuǎn)基因大豆的種植大國，其種植應(yīng)用率在90%以上[4]。截至目前，轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆已有超過30 個品種用于商業(yè)化種植，種植面積居轉(zhuǎn)基因大豆的首位。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（the International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Application,ISAAA）統(tǒng)計(jì)信息顯示，用于種植的轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆主要有耐有機(jī)磷除草劑、耐激素除草劑以及耐多類除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆類型。

耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆作為最早種植的品種，也是當(dāng)前應(yīng)用最廣的耐有機(jī)磷除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆[5]。農(nóng)桿菌菌株CP46的Cp4 epsps基因是其主要插入的外源基因，該基因通過在植物體內(nèi)表達(dá)并合成5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶賦予植物高水平的草甘膦耐受性[6]。耐草銨膦轉(zhuǎn)基因大豆則是另一種廣泛應(yīng)用的耐有機(jī)磷除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆，表達(dá)吸水鏈霉菌的bar基因[7]。耐麥草畏轉(zhuǎn)基因大豆是轉(zhuǎn)入土壤嗜麥芽窄食單胞菌DI-6菌株中合成麥草畏單加氧酶（DMO）基因的一種耐激素除草劑轉(zhuǎn)基因大豆[8]。DMO 可快速催化麥草畏氧化脫甲基生成3,6-二氯水楊酸（DCSA）和甲醛，發(fā)揮抗性。為滿足更加高效的田間管理和作物生產(chǎn)，還出現(xiàn)了耐多種除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆。MON87708×MON89788品系大豆可耐受麥草畏和草甘膦，DAS-444O6-6 品系可同時耐受草甘膦、草銨膦和2,4-二氯苯氧乙酸[9-10]。除此之外，還有如MON87701×MON89788 品系大豆兼具耐草甘膦和抗鱗翅目害蟲的特點(diǎn)[11]。

表1 已批準(zhǔn)商業(yè)種植的轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆Table 1 Genetically modified herbicide tolerant soybeans approved for commercial cultivation

雖然國際上轉(zhuǎn)基因大豆種植面積日益擴(kuò)大，但是我國尚未批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因大豆[12]。盡管如此，早在20 世紀(jì)我國便開始轉(zhuǎn)基因作物的相關(guān)研究，現(xiàn)已擁有了一批具有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆。例如轉(zhuǎn)G2-EPSPS 和GAT 基因的ZH10-6 耐草甘膦大豆、轉(zhuǎn)AM79-EPSPS 基因的耐草甘膦大豆及轉(zhuǎn)G10-EPSPS基因的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01 等，都具有良好的性狀[13-15]。這些品系一些已進(jìn)入我國轉(zhuǎn)基因植物研究的中間試驗(yàn)階段或環(huán)境釋放階段，但還需要進(jìn)行一系列嚴(yán)格的安全評價才能被批準(zhǔn)應(yīng)用。

2 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆的安全性問題

轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆以及其他轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)生產(chǎn)種植了二十多年，其制作的飼料、食物在世界范圍內(nèi)應(yīng)用廣泛[16]。盡管每一種轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆上市前都經(jīng)過系列安全評估，但是公眾對轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆生產(chǎn)的食品和飼料仍然爭議不斷，爭論的焦點(diǎn)主要集中在轉(zhuǎn)入基因后是否產(chǎn)生毒性、過敏性及大豆的營養(yǎng)成分是否改變等方面。

2.1 外源基因和蛋白的毒性

轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆通常是利用現(xiàn)代生物技術(shù)將外源DNA 轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，經(jīng)培育得到。這個過程的變量是外源DNA，因此，首先被考慮的便是轉(zhuǎn)入的DNA 對人體是否有毒性。人體每天攝入來自植物性和動物性食物的DNA 在0.1～1 g左右，這個攝入量對人體不具有毒性[17]。同時，DNA 進(jìn)入人體后會被消化系統(tǒng)水解，不會產(chǎn)生直接毒性。根據(jù)美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）相關(guān)政策，核酸存在于每個生物體內(nèi)，作為食物的成分來說不存在安全風(fēng)險，被認(rèn)為是安全的[16]。對于一些質(zhì)疑，如DNA可能在消化吸收時轉(zhuǎn)入人體內(nèi)或腸道微生物中，目前尚沒有確鑿的證據(jù)證明這種現(xiàn)象存在。

轉(zhuǎn)入的外源DNA 在轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆作物內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白，使其獲得耐受除草劑的特性，外源蛋白是否具有毒性也是被關(guān)注的焦點(diǎn)。轉(zhuǎn)入的DNA 本身可能與大豆內(nèi)的其他基因發(fā)生相互作用或受環(huán)境等影響發(fā)生變異，導(dǎo)致基因斷裂、缺失等突變發(fā)生，使得其表達(dá)的蛋白數(shù)量與性狀發(fā)生改變[18]。因此，證實(shí)外源蛋白的安全性和是否有其他有毒物質(zhì)產(chǎn)生十分重要。在轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆中表達(dá)的外源蛋白還未發(fā)現(xiàn)對人體有毒性，但也需要謹(jǐn)慎對待。

2.2 過敏性

表達(dá)的新蛋白是否會引發(fā)過敏反應(yīng)也是人們關(guān)注的重點(diǎn)問題。1994 年，美國先鋒種子公司曾嘗試在大豆中轉(zhuǎn)入巴西堅(jiān)果中編碼蛋白質(zhì)2S albumin的基因，但在測試階段發(fā)現(xiàn)對巴西堅(jiān)果過敏的人群同樣也對這種轉(zhuǎn)基因大豆過敏，項(xiàng)目不得不終止[19]。但是在研究耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆過程中，尚未發(fā)現(xiàn)人群對相關(guān)蛋白的過敏現(xiàn)象[20]。1992 年，F(xiàn)DA 給出了第一種評估食物蛋白質(zhì)過敏性潛在風(fēng)險的系統(tǒng)方法，2010 年由歐洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）轉(zhuǎn)基因生物小組（genetically modified organism, GMO）起草并于2011 年更新的轉(zhuǎn)基因生物過敏性風(fēng)險評估指南中建議使用證據(jù)權(quán)重方法，用于轉(zhuǎn)基因飼料和食品中新表達(dá)蛋白質(zhì)的過敏性風(fēng)險評估[21]。

2.3 營養(yǎng)成分改變

大豆通常由35%～40%的蛋白質(zhì)、20%左右的脂類、9%的膳食纖維和8.5%左右的水組成，不含膽固醇，富含異黃酮、皂甙等多種生物活性成分，具有調(diào)節(jié)生理功能和預(yù)防慢性病的作用[22]。轉(zhuǎn)入外源DNA 后，大豆內(nèi)的營養(yǎng)組成可能發(fā)生變化，或者引入的基因與大豆中其他營養(yǎng)素基因發(fā)生相互作用，使蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變[18]。由于耐除草劑的基因?qū)Υ蠖沟臓I養(yǎng)成分改變不能完全預(yù)知，人體如果攝入營養(yǎng)價值改變的大豆可能會影響自身健康。實(shí)際上，還沒有證據(jù)表明食用轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆會對人體和動物的健康或者營養(yǎng)狀況有不良影響。

2.4 抗?fàn)I養(yǎng)因子

除了作為蛋白和油料資源外，大豆本身還含有胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素、脲酶、植酸等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，會影響動物和人的健康。與外源DNA 對營養(yǎng)成分的影響類似，轉(zhuǎn)入的基因可能改變大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子組成和含量。因此，對于轉(zhuǎn)基因大豆還需要把握抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化情況。現(xiàn)有研究表明，耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子與非轉(zhuǎn)基因大豆之間沒有顯著差異，具有等同性[23]。

3 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆的食用安全性評價方法

所有應(yīng)用于食品的轉(zhuǎn)基因作物上市前都要經(jīng)過系列食用安全性評估，轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆也不例外。目前，食用安全性評估主要采用經(jīng)濟(jì)發(fā)展合作組織（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）在 1993 年提出的實(shí)質(zhì)等同原則，即利用生物技術(shù)產(chǎn)生的食品及成分與當(dāng)前市售的食品具有實(shí)質(zhì)等同性即視為安全[24]。評價方法主要有毒理學(xué)評價、過敏性評價和營養(yǎng)學(xué)評價等。

3.1 毒理學(xué)評價

耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的毒理學(xué)評價首先是針對外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)與已知有毒性的蛋白質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子在氨基酸序列相似性上的特征比較；其次，若與已知有安全食用歷史的蛋白不相似時，應(yīng)進(jìn)行經(jīng)口毒理學(xué)試驗(yàn)[25]。而蛋白質(zhì)以外無安全食用歷史的其他成分的潛在毒性評價應(yīng)參照傳統(tǒng)毒理學(xué)方法進(jìn)行，包括亞慢性毒性、慢性毒性、遺傳毒性和生殖發(fā)育毒性等毒性評價；同時，因轉(zhuǎn)入外源基因引起的大豆特性改變需要進(jìn)行喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和其他必要的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評價[25]。

2016 年，一項(xiàng)對轉(zhuǎn)基因耐麥草畏大豆的研究中發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因大豆表達(dá)的DMO 與野生型DMO的氨基酸序列同源性為91.6%～97.1%，且所有DMO 形式都保持了Rieske 加氧酶的特性，而這些酶具有安全使用的歷史[26]。多個國家都曾采用轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆進(jìn)行動物亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)和生殖能力檢測。日本研究人員在大鼠基礎(chǔ)日糧中添加30%濃度的轉(zhuǎn)基因大豆或非轉(zhuǎn)基因大豆，分別進(jìn)行52 周和104 周兩項(xiàng)慢性喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，同時為了評估大豆本身的影響，還將喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的大鼠組與喂養(yǎng)商業(yè)飲食的大鼠組進(jìn)行了比較，血液學(xué)、血清生化和病理學(xué)檢查、動物生長情況等結(jié)果表明，長期攝入30%的轉(zhuǎn)基因大豆對大鼠沒有明顯的不良影響[27-28]。我國研究人員Zhu 等[29]使用轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆飼喂大鼠13周，監(jiān)測了體重、進(jìn)行了血液學(xué)指標(biāo)、尿常規(guī)和病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)動物沒有出現(xiàn)亞慢性中毒現(xiàn)象。在生殖毒性方面，我國研究人員在飼料中添加20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）加工好的轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆豆粕或近等基因非轉(zhuǎn)基因豆粕，喂食雄性SD 大鼠90 d，每日監(jiān)測體重和行為，檢測血清酶、睪丸組織學(xué)和電鏡表現(xiàn)，以及精子形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂轉(zhuǎn)基因大豆的大鼠未觀察到任何不良反應(yīng)[30]。美國研究人員也曾對小鼠進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，得出轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆對小鼠無生殖毒性的結(jié)論[31]。意大利研究人員曾經(jīng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因大豆喂養(yǎng)小鼠240 d的傳代試驗(yàn)，檢測結(jié)果顯示小鼠臟器中核酸轉(zhuǎn)錄活性改變，作者認(rèn)為是由于大豆中的抗草甘膦基因引起的。但是，這些檢測指標(biāo)不是毒理學(xué)的常用指標(biāo)，并且也沒有動物相關(guān)指標(biāo)自然范圍的數(shù)據(jù)支持。因此，EFSA認(rèn)為這些發(fā)現(xiàn)的毒理學(xué)相關(guān)性尚不清楚[32-37]。類似的，也有一些試驗(yàn)認(rèn)為轉(zhuǎn)基因大豆可能與肝臟老化和胰腺病變有關(guān)，但這些試驗(yàn)的科學(xué)性尚有待探討[38-39]。

3.2 過敏性評價

針對外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)的過敏性評價應(yīng)當(dāng)遵循整體、分步和個案分析的原則，實(shí)現(xiàn)綜合評價。主要包括根據(jù)供體生物過敏性的信息確定評價方法、外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)與已知過敏原氨基酸序列同源性比較、外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)在加工和胃腸消化過程的穩(wěn)定性三個方面[25]。

一項(xiàng)對轉(zhuǎn)基因耐麥草畏大豆中DMO 的過敏性評價結(jié)果表明，DMO 序列中沒有一個與任何已知的過敏原或毒素相似，并采用證據(jù)權(quán)重法進(jìn)一步評價DMO 蛋白的安全性，純化的DMO 蛋白在體外55℃及以上的溫度下加熱活性完全喪失，并且分別可在30 s 或5 min 內(nèi)被胃蛋白酶和胰酶完全消化；小鼠經(jīng)口灌注DMO 蛋白喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)未顯示出任何不良反應(yīng)，這些結(jié)果表明各種形式的DMO蛋白質(zhì)對于食物和飼料消費(fèi)是安全的，并且DMO活性位點(diǎn)之外的小氨基酸序列差異不會引起任何額外的安全問題[26]。對轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆中CP4 EPSPS 蛋白的過敏性分析表明，該基因的供體土壤農(nóng)桿菌不是一種已知的過敏原，該蛋白與公共數(shù)據(jù)庫（GenBank、EMBL、PIR 和SwissProt）中的已知過敏原沒有高度的氨基酸序列同源性。該蛋白可以在模擬胃液和模擬腸液中被迅速消化。截至2020 年，美洲、歐洲以及亞洲都有研究使用易過敏兒童和成年人的血清與轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆提取物和CP4 EPSPS 蛋白進(jìn)行的特異性IgE 結(jié)合試驗(yàn)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該蛋白與任一過敏血清結(jié)合，而轉(zhuǎn)基因大豆提取物和非轉(zhuǎn)基因大豆提取物的內(nèi)源性過敏原的種類和數(shù)量沒有明顯差異[40-45]。采用SD 大鼠所做的動物體內(nèi)體外致敏刺激試驗(yàn)也證實(shí)了CP4 EPSPS蛋白注射或灌胃都不會引起動物的過敏反應(yīng)[46]。2010 年，一項(xiàng)對耐異惡唑酮和草甘膦的FG72 大豆進(jìn)行的過敏性評價實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)G72 大豆種子中的過敏原水平?jīng)]有顯著增加[47]。因此，大豆中轉(zhuǎn)入DMO、CP4 EPSPS 等外源蛋白沒有增加新的過敏性風(fēng)險。

3.3 營養(yǎng)學(xué)評價

耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的營養(yǎng)學(xué)評價應(yīng)考慮大豆中營養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子等相關(guān)成分的自然變異范圍等因素的影響，以及加工條件下對大豆中這些成分的含量、結(jié)構(gòu)、功能和生物利用率的影響[25]。

歷史上在不同時間、不同地點(diǎn)對轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆已經(jīng)進(jìn)行了多次獨(dú)立的營養(yǎng)成分分析，如美國 1992—2011 年多個地點(diǎn)，歐洲 2005 年 5 個地點(diǎn)，巴西2007—2009 年多個地點(diǎn)[48-53]的分析試驗(yàn)。在2000—2002 年美國和加拿大兩地持續(xù)對多種遺傳背景的轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆和它的親本大豆的營養(yǎng)成分分析均表明，二者在大部分營養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量和組成方面無明顯差異，均在相應(yīng)范圍內(nèi)[54]。2017年一項(xiàng)對于耐受多種除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆的評價中，將收獲的具有耐麥草畏和草甘膦的大豆中重要營養(yǎng)素和抗?fàn)I養(yǎng)素的水平與親本非轉(zhuǎn)基因大豆及普通大豆進(jìn)行比較，結(jié)果表明基因修飾對相關(guān)成分沒有影響[55]。因此，插入耐除草劑基因?qū)Υ蠖沟臓I養(yǎng)成分沒有顯著影響。

動物喂養(yǎng)試驗(yàn)常用來評價轉(zhuǎn)基因作物營養(yǎng)成分的生物利用率。使用轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆飼喂鵪鶉、大鼠、牛、雞等動物后，檢測它們的體重、飼料轉(zhuǎn)化率、肌肉和脂肪組成（雞）、牛奶產(chǎn)量和牛奶成分等，發(fā)現(xiàn)兩種大豆對動物的營養(yǎng)價值沒有差別，這些動物試驗(yàn)中大豆的飼喂量達(dá)到人體攝入量的100 倍，也足以說明轉(zhuǎn)基因大豆對動物和人體的安全性[56]。2017 年，一項(xiàng)研究以朝鮮鵪鶉作為實(shí)驗(yàn)動物，隨機(jī)分成5 個處理組，用含有28%和70%的轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾蠖挂约俺Ｒ?guī)基礎(chǔ)日糧飼喂鵪鶉90 d，觀察其對鵪鶉健康狀況和生理指標(biāo)的影響，記錄各組動物體重和攝食量，并在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谑占航馄蕜游镞M(jìn)行病理觀察，計(jì)算臟器系數(shù)，90 d亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因大豆對鵪鶉沒有產(chǎn)生不良反應(yīng)[57]。

4 展望

轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆已經(jīng)商業(yè)化種植了二十多年，迄今為止還沒有觀察到任何不良反應(yīng)。盡管種植轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆的優(yōu)勢非常明顯，但仍有一部分人存在懷疑。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，采用新技術(shù)研發(fā)的新一代轉(zhuǎn)基因作物可能會涉及更復(fù)雜的安全評估。因此，需要建立完整的轉(zhuǎn)基因作物食用安全性評估體系并不斷完善才能更好地評價轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆的安全性，減少公眾的顧慮，促進(jìn)更多優(yōu)勢轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應(yīng)用。