趙 敬，楊漢蕾，陳素素，牟 榮

微小膜殼絳蟲(Hymenolepisnana)是一種人獸共患寄生蟲，主要寄生于人及嚙齒類動物的腸道。我國主要分布在17個省市和自治區(qū)，其中新疆維吾爾自治區(qū)的感染率最高[1]。近年來，在貧困地區(qū)和兒童中微小膜殼絳蟲的感染更是帶來了很多流行病和公共衛(wèi)生的新興問題[2]。目前微小膜殼絳蟲在流行病學、臨床表現(xiàn)及治療方面的研究比較常見，但在免疫方面的研究并不多見。

LY6家族可參與T細胞活化[3-4]、嗅覺[5]和細胞粘附[6]等多種功能。其中LY6A(Lymphocyte antigen 6 complex locus A)又叫作Sca-1(Stem cell antigen-1)，它是LY6基因家族中第1個被鑒定的成員，也是一種糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定細胞表面蛋白。其廣泛表達于不同的細胞類型，包括造血干細胞、大多數(shù)淋巴細胞、胸腺細胞、單核細胞、腎上皮細胞和成骨細胞[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)LY6A(Sca-1)的表達對與炎癥性腸病(IBD)免疫發(fā)病機制有關的趨化因子分泌產(chǎn)生影響[11]。此外，γ-干擾素(IFN-γ)等細胞因子可以廣泛促進LY6A(Sca-1)的表達，并且細胞因子介導的LY6A(Sca-1)的誘導依賴于信號轉導和轉錄激活因子1(Signal transducerand activator of transcription 1，STAT1)[12]。近年來有學者研究發(fā)現(xiàn)LY6A在多形螺旋線蟲感染的小鼠小腸肉芽腫中表達升高[13]。但是目前尚無微小膜殼絳蟲感染后小腸組織中LY6A(Sca-1)及IFN-γ、STAT1表達的研究報道。因此本研究在建立微小膜殼絳蟲實驗感染ICR小鼠動物模型的基礎上，對感染后第2 d和第8 d的小鼠小腸采用HE染色進行組織病理學觀察，RT-PCR技術檢測LY6A、IFN-γ和STAT1的mRNA相對表達量，免疫組織化學技術檢測小腸中LY6A(Sca-1)蛋白陽性細胞百分比，并用PRM技術對LY6A(Sca-1)蛋白和STAT1蛋白的相對豐度進行定量，以探討微小膜殼絳蟲感染小鼠小腸組織中LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1表達情況，為深入研究微小膜殼絳蟲所致宿主腸道免疫病理損傷的分子機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蟲體來源 微小膜殼絳蟲標本采自貴州省貴陽市花溪區(qū)野生小鼠，前期課題組經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定，確定采集蟲體為微小膜殼絳蟲。

1.1.2 實驗動物 120只4～6周齡ICR小鼠購自貴州醫(yī)科大學，體重約26 g，體健，經(jīng)糞檢證實無寄生蟲感染。

1.1.3 主要試劑和儀器 主要試劑Trizol試劑購自美國Sigma公司，逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本TAKARA 公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，二甲苯、無水乙醇、4%多聚甲醛、蘇木素、伊紅均購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗鼠LY6A/Sca-1單克隆抗體(ab109211)購自美國Abcam公司，通用二步法試劑盒、封閉用羊血清、DAB顯色試劑和檸檬酸鹽修復液均購自北京中杉金橋公司。主要儀器熒光定量PCR儀(7300)為美國ABI公司產(chǎn)品，輪轉式切片機及成像系統(tǒng)均為德國公司產(chǎn)品，型號分別為Leica RM2255和Leica DM6B。

1.2 方 法

1.2.1 蟲卵收集和計數(shù) 將微小膜殼絳蟲的末段孕節(jié)放在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中用注射器針頭沿縱軸劃破孕節(jié)使蟲卵溢出，并用生理鹽水反復清洗，2 000 r/min離心10 min，收集蟲卵備用。使用光學顯微鏡觀察收集的蟲卵并反復計數(shù)5次，取平均值，定量300 μL生理鹽水中蟲卵數(shù)為1 000個備用。

1.2.2 實驗動物感染和標本采集 將ICR小鼠隨機分為實驗組和對照組各6只，實驗組以定量1 000個/只蟲卵通過灌胃感染。于感染后第2 d和第8 d按照編號處死實驗組和對照組小鼠各6只，采集實驗組和對照組腸組織，隨機取3只小鼠距回盲部6～8 cm的小腸放入盛有1 mL的EP管內(nèi)液氮速凍后再置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另?只小鼠取小腸相同部位放入4%多聚甲醛中固定后保存。

1.2.3 小腸組織病理學觀察 小腸組織固定后經(jīng)脫水、包埋、切片，切片厚度為4 μm，然后進行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H&E stain)。連續(xù)切片并選擇染色良好的腸管橫切面，在顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.4 實時熒光定量PCR 使用上海生工公司在線軟件設計并合成LY6A(Sca-1)、IFN-γ、STAT1和3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)實時熒光定量 PCR 引物，并由其合成(表 1)。使用Trizol法提取各組小腸組織總RNA，按照試劑盒說明逆轉錄為cDNA。PCR反應條件：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。將實時熒光定量PCR得出的各組LY6A(Sca-1)、IFN-γ、STAT1和內(nèi)參基因GAPDH的CT值記錄下來，重復3次取平均值。計算LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1的△△CT值，采用2-△△CT法計算出各組LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1的相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物

1.2.5 免疫組織化學 常規(guī)制作石蠟切片，厚度為3 μm，并進行脫蠟、脫水、過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、檸檬酸鹽修復，然后加入一抗LY6A(1∶50)4 ℃孵育過夜。復溫30 min，再加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色3 min，蘇木素復染10 s，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判定：陽性細胞表現(xiàn)為細胞質棕黃色著色。每張組織切片隨機選取10個高倍視野，觀察陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比[14]。

1.2.6 PRM技術檢測 樣品從-80 ℃取出，稱取適量組織樣品至液氮預冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末提取動物總蛋白，并利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。將蛋白進行胰酶酶解，肽段使用液相色譜-質譜聯(lián)用分析。最后采用所選肽段的碎片離子峰面積對LY6A和STAT1蛋白的相對豐度進行定量[15]。

2 結 果

2.1 微小膜殼絳蟲實驗感染ICR小鼠結果 ICR小鼠可以感染微小膜殼絳蟲蟲卵，自感染后第7 d開始，實驗組小鼠在距回盲部6～12 cm處可見白色蟲體(圖1)，檢獲率100%。

圖1 小鼠小腸感染后獲取的微小膜殼絳蟲

2.2 小腸組織病理觀察結果 感染后第2 d，HE染色連續(xù)切片顯示小腸組織結構正常，無明顯病理變化(圖2A)。感染第8 d，小腸腸腔內(nèi)可見成蟲節(jié)片，且成蟲寄生部位嗜酸性粒細胞明顯增多(圖2B)。

A:感染后第2 d小鼠腸組織HE染色結果；B:感染后第8 d小鼠腸組織HE染色結果，↑示成蟲節(jié)片。(放大倍數(shù)=100倍)

2.3 實時熒光定量PCR檢測LY6A(Sca-1)、IFN-γ和STAT1的mRNA相對表達量結果 感染后第2 d，實驗組LY6A的mRNA相對表達量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=12.57,P<0.001)；感染后第8 d實驗組LY6A的mRNA相對表達量明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.01,P<0.001)(圖3A)。感染后第2 d，實驗組IFN-γ的mRNA相對表達量高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=7.78,P<0.01)；感染后第8 d，實驗組IFN-γ的mRNA相對表達量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=26.47,P<0.001)(圖3B)。在感染后第2 d，實驗組STAT1的mRNA相對表達量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.13,P<0.001)；而在感染后第8 d實驗組STAT1的表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.19,P<0.001)(圖3C)。

注：①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001

2.4 免疫組織化學檢測小腸LY6A蛋白表達結果 顯微鏡下觀察實驗組和對照組腸組織LY6A蛋白染色均可見陽性細胞,陽性細胞主要出現(xiàn)在小腸間質細胞的細胞質上(圖4A-D)。感染后第2 d實驗組陽性細胞百分比高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.26,P<0.01)；感染后第8 d實驗組陽性細胞百分比顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.18,P<0.001)(圖5)。

A:第2 d對照組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結果；B:感染后第2 d實驗組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結果；C：第8 d對照組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結果；D:感染后第8 d實驗組小鼠腸組織LY6A蛋白免疫組化結果。(A-D放大倍數(shù)為200倍)

注：①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001

2.5 PRM檢測小腸LY6A和STAT1蛋白表達結果 感染后第2 d實驗組LY6A蛋白表達量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.55,P<0.05)；而感染后第8 d實驗組與對照組相比LY6A蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.95,P<0.05)(圖6A)。感染后第2 d STAT1蛋白實驗組與對照組相比無統(tǒng)計學差異，但在感染后第8 d實驗組STAT1蛋白的表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.91,P<0.05)(圖6B)。

注：①P<0.05

3 討 論

T細胞可介導很多與寄生蟲感染免疫相關的反應[16]。目前研究已證實輔助性T淋巴細胞(Th)可通過分泌細胞因子介導宿主抗微小膜殼絳蟲感染的保護性免疫[1]。IFN-γ作為Th1型細胞主要分泌的細胞因子，在先天性免疫和適應性免疫中都發(fā)揮了重要作用[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲感染小鼠的第3 d和第6 d，IFN-γ和Th2型細胞因子的表達明顯升高，呈現(xiàn)出Th1/Th2混合型免疫應答[19]。Toenjes研究肥頭絳蟲(Taeniacrassiceps)感染BALB/c小鼠的第3 d、第5 d和第7 d，腸系膜淋巴結細胞的檢測結果中發(fā)現(xiàn)感染早期IFN-γ增加，隨后IFN-γ的表達水平下降，IL-10快速增加[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)微小膜殼絳蟲感染第2 d實驗組IFN-γ的mRNA相對表達量高于對照組，目前已知微小膜殼絳蟲感染小鼠后其蟲卵在小腸內(nèi)經(jīng)消化液的刺激，六鉤蚴破殼而出，鉆進腸絨毛，在腸絨毛中逐漸發(fā)育，經(jīng)3～4 d形成似囊尾蚴，據(jù)此推測微小膜殼絳蟲感染后早期侵入的幼蟲在腸絨毛內(nèi)的發(fā)育很可能激發(fā)了Th1型免疫應答。本實驗發(fā)現(xiàn)在感染后第8 d，實驗組IFN-γ的mRNA相對表達量明顯低于對照組，且小腸組織切片顯示腸腔內(nèi)含有成蟲節(jié)片，考慮微小膜殼絳蟲在腸腔發(fā)育為成蟲時，宿主的Th1型免疫應答已不占主導地位，但它是否激發(fā)了宿主的Th2型免疫應答，還有待進一步研究。

細胞因子IFN-γ被認為與促進調(diào)節(jié)性T細胞中Sca-1(LY6A)的表達有關[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)微小膜殼絳蟲感染小鼠后第8 d蟲體寄生處小腸黏膜出現(xiàn)急性炎癥反應，表現(xiàn)為嗜酸性粒細胞明顯增多，而且LY6A的表達水平高于對照組，IFN-γ的表達水平卻下降。但是有研究報道LY6A(Sca-1)的RNA表達水平在結腸炎小鼠的腸道上皮細胞中呈現(xiàn)高表達，同時IFN-γ的表達也升高[11]。這與我們的研究結果有矛盾之處，可能反映了內(nèi)源性IFN-γ在系統(tǒng)感染中作用的復雜性，因為在系統(tǒng)性感染中，T細胞抗原受體(TCR)和其他細胞因子都容易促進LY6A(Sca-1)的表達[12]。弓形蟲病中 IFN-γ作為關鍵細胞因子誘導LY6A(Sca-1)的表達，但使用抗IFN-γ抗體處理弓形蟲感染后的小鼠發(fā)現(xiàn)IFN-γ的阻斷反而增加了LY6A(Sca-1)的表達，可見LY6A(Sca-1)的表達并未因IFN-γ的缺乏而下降，這可能是由于IFN-γ的缺乏導致寄生蟲復制和抗原負荷顯著增加，從而導致了T細胞活化增加[12]。據(jù)此我們推測微小膜殼絳蟲感染小鼠后小腸的免疫病理變化是一個復雜的過程，IFN-γ對小鼠小腸LY6A的表達并不起關鍵作用，LY6A的表達是否受其他因子的調(diào)控尚有待進一步研究。

細胞因子所介導的信號通路中有幾個共同要素可以最有力地誘導Sca-1(LY6A)的表達，特別是激活STAT1和上調(diào)T盒子轉錄因子(T-bet)表達的能力[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)STAT1在IFN-γ介導的Sca-1(LY6A)誘導中起關鍵作用[12]。本研究結果顯示感染后第2 d實驗組STAT1在mRNA和蛋白水平的表達量均低于對照組，而感染后第8 d實驗組STAT1在mRNA和蛋白水平的表達均明顯高于對照組，因此推測微小膜殼絳蟲感染可激活STAT1的表達，從而在Sca-1(LY6A)的誘導中起作用。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)微小膜殼絳蟲感染ICR小鼠小腸后LY6A(Sca-1)的mRNA水平和蛋白水平在幼蟲侵入早期呈低表達，成蟲期呈高表達；IFN-γ對LY6A的表達不起主導作用，STAT1可能對LY6A(Sca-1)的表達起誘導作用。今后可進一步檢測其他細胞因子如Ⅰ IFN和IL-27對微小膜殼絳蟲感染小鼠小腸LY6A(Sca-1)表達的影響，并進一步研究LY6A(Sca-1)在促進T細胞活化和遷移中的具體機制。

利益沖突：無