薩福克羊血清激素與超數(shù)排卵效果的相關(guān)性研究

趙冰茹，陳童，董紅，毋狀元，羅永明，季斐,4，鄭新寶*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；2. 新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆阿勒泰地區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆 阿勒泰 836501；4. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

胚胎移植技術(shù)在充分發(fā)揮優(yōu)良母畜繁殖潛力、縮短世代間隔、提高良種化進(jìn)程及保存品種資源方面具有重大意義。超數(shù)排卵技術(shù)是胚胎移植中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)[1-2]，通過(guò)注射外源性激素來(lái)提高血液中促性腺激素濃度，減少閉鎖卵泡數(shù)量，從而使卵泡發(fā)育并排卵。該技術(shù)能夠?yàn)榕咛ヒ浦蔡峁┐罅績(jī)?yōu)質(zhì)胚胎，是優(yōu)質(zhì)種羊進(jìn)行快速繁育的有效途徑[3]，因此研究影響超數(shù)排卵的因素對(duì)于改善超排效果具有重要意義。

目前，已發(fā)現(xiàn)供體羊生理狀態(tài)、激素水平、超排方案、年齡和胎次等均對(duì)超數(shù)排卵存在影響[4]。其中與超數(shù)排卵密切相關(guān)的激素主要是促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體激素(luteinizing hormone，LH)，卵泡生長(zhǎng)需要FSH和LH的作用才能繼續(xù)發(fā)育，在超數(shù)排卵中只有有腔卵泡才可以在外源促性腺激素刺激下發(fā)生排卵，而有腔卵泡卵泡腔的形成、生長(zhǎng)依賴于FSH和LH[5-6]，由此可見(jiàn)FSH和LH對(duì)超數(shù)排卵的效果有重要影響?？箍娎展芗に?anti-müllerian hormone，AMH)是一種糖蛋白激素，是反映卵巢儲(chǔ)存卵泡數(shù)量的內(nèi)分泌標(biāo)記，而AMH也是由超數(shù)排卵中可被外源性促性腺激素誘導(dǎo)發(fā)育的卵泡群所分泌，故而可以利用AMH預(yù)測(cè)供體母畜的超排效果[4]。但是目前關(guān)于動(dòng)物內(nèi)源性FSH、LH和AMH水平對(duì)超數(shù)排卵效果影響的報(bào)道較少，因此，為了解血清中激素水平對(duì)超數(shù)排卵效果的影響，本研究測(cè)定了薩?？四秆蜓逯蠪SH、LH和AMH激素水平，分析其與超數(shù)排卵效果的相關(guān)性，為改善綿羊超數(shù)排卵效果提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物均來(lái)自新疆天山畜牧生物工程股份有限公司種羊場(chǎng)，隨機(jī)選擇了60只2～4歲的健康、無(wú)繁殖疾病的薩福克羊作為供體母羊。所有試驗(yàn)動(dòng)物超排前1個(gè)月根據(jù)供體母羊膘情進(jìn)行補(bǔ)飼，每只母羊每天精料添至800 g、胡蘿卜200 g、苜蓿草2 kg，青貯玉米2 kg，配備舔磚，精料中添加亞硒酸鈉等微量元素。進(jìn)行必要的防檢疫和驅(qū)蟲(chóng)工作。

1.2 藥品和試劑

用于同期發(fā)情和超數(shù)排卵的藥品和試劑有注射用氯前列烯醇鈉(PG)、垂體促卵泡素(FSH)、促黃體素釋放激素A3(LHRH)，均購(gòu)自寧波市三生藥業(yè)有限公司。采卵液為自配，胚胎保存液(Holding)為美國(guó)AB公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 同期發(fā)情

試驗(yàn)時(shí)間為2018年10月，觀察供體母羊體況及繁殖周期，確定體況良好、無(wú)疾病和不良癥狀后，開(kāi)始同期發(fā)情和超數(shù)排卵處理。供體羊同期發(fā)情方法為注射氯前列烯醇鈉(PG)1 mL/只(0.1 mg)，1 d后，試情公羊開(kāi)始試情，3 d內(nèi)確定發(fā)情的羊作為試驗(yàn)羊。將發(fā)情羊分為3組，按照發(fā)情日開(kāi)始超數(shù)排卵處理。使用FSH減量法對(duì)供體母羊進(jìn)行超排，在發(fā)情周期的第11天開(kāi)始，每天早晚各注射1次FSH，連續(xù)注射4 d，第1、2、3、4天的注射劑量分別為4 mg/d、3 mg/d、2 mg/d、1 mg/d，每只羊總劑量為10 mg；在超數(shù)排卵第3天時(shí)，注射1支PG(0.1 mg)，在母羊發(fā)情后14 h進(jìn)行腹腔鏡輸精，并注射促排卵素3號(hào)(LHRH-A3)1支(25 μg)；在供體母羊發(fā)情配種的6～7 d，進(jìn)行手術(shù)法沖胚，同時(shí)統(tǒng)計(jì)黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)等數(shù)據(jù)。

1.3.2 樣本采集

超排前1 d(即發(fā)情周期第10天)，采集外周血樣品，經(jīng)3 000 r/min離心10 min后分離出血清，-20 ℃下冷凍保存，用于測(cè)定LH、FSH和AMH。

1.3.3 激素測(cè)定

血清激素指標(biāo)的測(cè)定均委托專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行，采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，儀器型號(hào): ST-360酶標(biāo)儀，靈敏度強(qiáng)(最低檢測(cè)濃度小于1.0 pg/mL)、準(zhǔn)確度高(標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.99)、特異性強(qiáng)(不與其他可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng))、重復(fù)性好(板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%)。使用UNICEL DXI800全自動(dòng)發(fā)光儀檢測(cè)FSH、LH濃度水平，使用Iflash3000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)血清中AMH濃度水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行LH、FSH和AMH與沖胚效果的相關(guān)性分析，并建立回收胚胎數(shù)與血清激素間的最優(yōu)回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 血清激素指標(biāo)及排卵數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表1可知，薩福克供體母羊的沖胚數(shù)據(jù)中，平均黃體數(shù)為11.00個(gè)，平均回收胚胎數(shù)、平均可用胚胎數(shù)分別為10.30個(gè)、6.12個(gè)，可用胚率為0.58。測(cè)得血清中LH、FSH、AMH含量的均值分別為1.47 ng/L、17.91 U/L、8.13 ng/mL。

表1 超數(shù)排卵效果和血清激素指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析

2.2 血清激素指標(biāo)及超排效果相關(guān)性分析

對(duì)薩?？四秆蜓逯蠰H、FSH、AMH與黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)、可用胚率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明見(jiàn)表2。LH與黃體數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，LH與可用胚率無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；FSH與回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與黃體數(shù)、可用胚率均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；AMH與黃體數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，AMH與可用胚率無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

表2 血清激素與薩?？搜驔_胚數(shù)據(jù)間的相關(guān)系數(shù)

2.3 建立最優(yōu)回歸模型

利用血清激素對(duì)回收胚胎數(shù)進(jìn)行逐步回歸分析，根據(jù)回歸分析原理，回歸模型R2越接近1時(shí)，該回歸模型越接近實(shí)測(cè)值，從表3可看出，所建立回歸模型中，模型3的R2最接近于1，因此該模型為最優(yōu)回歸模型。從表4中發(fā)現(xiàn)，AMH(X1)、FSH(X2)在回歸模型中對(duì)回收胚胎數(shù)影響極顯著(P<0.01)，LH(X3)在回歸模型中對(duì)回收胚胎數(shù)影響顯著(P<0.05)，因此可得出最優(yōu)回歸模型為Y=-50.041+5.732X1+1.030X2-3.110X3，該模型R2為0.914，而表5方差結(jié)果顯示，該模型呈極顯著(P<0.01)水平，表明由AMH、FSH、LH和回收胚胎數(shù)建立的回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)水平的顯著，說(shuō)明該回歸模型可用于利用血清激素指標(biāo)評(píng)估回收胚胎數(shù)。

表3 回收胚胎數(shù)和血清激素回歸分析后模型

表4 回歸模型回歸系數(shù)參數(shù)估計(jì)值

表5 回歸模型方差分析

3 討論

3.1 超數(shù)排卵效果分析

胚胎移植技術(shù)是家畜快速擴(kuò)繁中的重要技術(shù)，而超數(shù)排卵作為其關(guān)鍵技術(shù)對(duì)于快速繁殖優(yōu)良種畜十分重要[7]。在動(dòng)物發(fā)情周期的一定階段，注射超過(guò)體內(nèi)正常量的促卵泡激素類激素，可以拯救99 %即將閉鎖的卵泡，使其能夠進(jìn)行正常發(fā)育成熟，同時(shí)在排卵前注射LH類激素，以此彌補(bǔ)動(dòng)物體內(nèi)源性LH的不足，從而使成熟卵泡可以同時(shí)排出[8]。

本研究使用FSH減量法對(duì)薩福克供體母羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理，獲得平均可用胚胎數(shù)為6.12個(gè)，這與茍想珍等[9]超數(shù)排卵處理黑頭薩?？搜颢@得6.08個(gè)平均可用胚胎數(shù)的結(jié)果相似，而Song等[10]利用褪黑素處理過(guò)的供體母羊獲得的平均可用胚胎數(shù)為7.40個(gè)，略高于本研究，這可能與褪黑激素能夠顯著提高胚泡率有關(guān)[12]。對(duì)部分個(gè)體由于出現(xiàn)帶膿、粘連等原因無(wú)法統(tǒng)計(jì)出黃體數(shù)，以及部分激素檢測(cè)異常的數(shù)據(jù)，進(jìn)行了剔除。

3.2 血清激素與超排效果的相關(guān)性

FSH和LH對(duì)與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是必不可少的，同時(shí)在超數(shù)排卵中也是十分重要的促性腺激素。其中FSH的主要功能在于其對(duì)卵巢卵泡發(fā)育的調(diào)控[12]，其通過(guò)促進(jìn)對(duì)顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的增殖分化、代謝以及類固醇等的合成，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)卵泡發(fā)育調(diào)控的功能。Sirard等[13]研究發(fā)現(xiàn)促卵泡素對(duì)于體內(nèi)、體外卵母細(xì)胞發(fā)育能力的獲得有著重要作用；Khan等[14]在體外培養(yǎng)的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH能夠誘導(dǎo)卵母細(xì)胞生發(fā)泡的破裂，而Dinopoulou等[15]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH能夠起到改善卵母細(xì)胞發(fā)育能力的作用。LH在正常的生殖周期中起到恢復(fù)成熟卵泡中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的作用。研究表明，LH通過(guò)誘導(dǎo)表皮類生長(zhǎng)因子的表達(dá)，以及相關(guān)信號(hào)通路的激活等方式對(duì)卵母細(xì)胞的成熟以及排卵發(fā)揮著重要作用[16-17]，即LH通過(guò)其所介導(dǎo)的細(xì)胞旁分泌和自分泌的方式，調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞的變化。綜上所述，F(xiàn)SH和LH在卵泡發(fā)育及排出中起著不可或缺的作用，在本研究中血清FSH、LH與超數(shù)排卵效果的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH、LH與回收胚胎數(shù)呈強(qiáng)正相關(guān)(0.7≤R<1)，與可用胚胎數(shù)也呈中度正相關(guān)關(guān)系(0.4≤R<0.7)，表明LH、FSH均對(duì)回收胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)有著很大影響。

AMH也被稱為繆勒管抑制物質(zhì)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族成員，是由睪丸未成熟的 Sertoli 細(xì)胞及卵巢竇前卵泡和小竇卵泡的顆粒細(xì)胞所分泌的一種糖蛋白。卵巢內(nèi)的小竇卵泡數(shù)量越多，AMH的濃度便越高，反之，當(dāng)卵泡隨著年齡及各種因素逐漸消耗，AMH濃度也會(huì)隨之降低。研究發(fā)現(xiàn)，該激素在小鼠、牛等卵巢中，由生長(zhǎng)卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞特異性表達(dá)，且外周血中AMH濃度可以反映出生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量，對(duì)卵巢儲(chǔ)備的評(píng)價(jià)和超數(shù)排卵效果的預(yù)測(cè)有重要意義[4]，AMH可作為預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備的標(biāo)志物。本研究在AMH水平與超數(shù)排卵效果的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，AMH水平與回收胚胎數(shù)呈強(qiáng)正相關(guān)(0.7≤R<1)，與可用胚胎數(shù)也呈中度正相關(guān)關(guān)系(0.4≤R<0.7)。Monniaux等[18]對(duì)山羊的研究結(jié)果顯示，血液中AMH濃度與總胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)、黃體數(shù)呈顯著正相關(guān)；王立凱[4]在奶綿羊研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，AMH與回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)均呈顯著正相關(guān)；上述結(jié)果均與本研究結(jié)果一致，表明在一定范圍內(nèi)AMH濃度越高，則可能獲得更多的胚胎。

在超數(shù)排卵過(guò)程中對(duì)動(dòng)物注射外源性促性腺激素，使得母羊排出更多的卵泡。外源性LH量的減少會(huì)引起胚胎回收數(shù)、可用胚胎數(shù)的增加，高劑量的LH會(huì)造成可排卵的FSH劑量的增加，并且在超排中使用高濃度的LH會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育不成熟，進(jìn)而降低胚胎質(zhì)量[19-20]；還有研究認(rèn)為，超排時(shí)內(nèi)源性LH已經(jīng)足夠，不需要注射LH，而外源性FSH純化越高，則胚胎的質(zhì)量越好[21]。因此，在超數(shù)排卵過(guò)程不能盲目使用促性腺激素，需要根據(jù)不同品種、不同環(huán)境等選擇適宜的超排方案，從而達(dá)到更好的超排效果。

3.3 最優(yōu)回歸模型

FSH、LH和AMH作為卵泡發(fā)育及排出過(guò)程中的重要激素指標(biāo)，已被報(bào)道可聯(lián)合檢測(cè)以初步評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能[22]，本研究通過(guò)逐步回歸方法建立了血清激素對(duì)回收胚胎數(shù)的最優(yōu)回歸方程，模型對(duì)應(yīng)R2為0.914，該值越接近1則表示模型越接近真實(shí)值[23]，反映出該回歸模型用于評(píng)估回收胚胎數(shù)的可靠性，而通過(guò)該回歸模型，根據(jù)超數(shù)排卵前供體血清激素來(lái)對(duì)回收胚胎數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，可改善優(yōu)質(zhì)供體母羊的篩選，進(jìn)而節(jié)約超數(shù)排卵成本，改善超數(shù)排卵效果。因此本研究認(rèn)為，通過(guò)這3項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)來(lái)評(píng)估超數(shù)排卵效果具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究分析了薩?？搜蜓寮に嘏c超數(shù)排卵效果的相關(guān)性，結(jié)果表明FSH、LH、AMH與黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)、可用胚胎數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系。在超數(shù)排卵過(guò)程中，要根據(jù)具體品種、條件等設(shè)計(jì)相應(yīng)超排方案，監(jiān)測(cè)控制好動(dòng)物體內(nèi)激素水平，從而提高超數(shù)排卵效果。同時(shí)，本研究還建立了最優(yōu)回歸模型：Y=-50.041+5.732X1+1.030X2-3.110X3，可利用血清中AMH、FSH與LH評(píng)估回收胚胎數(shù)。