耿笑林，王孟月，張翼，劉鵬，李可樂，杜東穎，逄文強，黃玉欣*，田克恭*

(1. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471003；2. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471003)

雞肝炎-心包積液綜合征 (hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒血清4型 (fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)引起的一種高度傳染性疾病，該病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)首次暴發(fā)，隨后在亞洲、歐洲和南美洲等地區(qū)流行[1-4]。2015年7月起，由FAdV-4中國流行株引起的HHS在我國山東、河南、安徽和江蘇等省份大面積流行[5]，死亡率最高可達80%以上，因為缺乏有效的疫苗進行針對性預防，給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。因此，F(xiàn)AdV-4的疫苗研制對防控該病尤為重要。

FAdV-4具有兩條纖突，一條長纖突(Fiber-1)和一條短纖突(Fiber-2)，其中Fiber-2蛋白主要是通過識別宿主細胞上的特異受體而使病毒吸附結合在宿主細胞上，對病毒增殖、組裝或擴散的某個階段是必需的，缺失Fiber-2則不能產(chǎn)生病毒粒子[6]，因此Fiber-2是疫苗研制的潛在抗原蛋白之一。

大腸桿菌由于其生長迅速，容易達到高細胞密度和低成本培養(yǎng)基的優(yōu)勢[7]，無論在實驗室還是在工業(yè)規(guī)模上，成為許多重組蛋白(包括Fiber-2蛋白)的首選表達系統(tǒng)。然而，由于缺乏先進的翻譯后修飾和真核伴侶蛋白，外源蛋白易聚集以包涵體形態(tài)產(chǎn)生[8]。生物系統(tǒng)中存在的各種小分子可以在體外協(xié)助蛋白質折疊，以改善蛋白質在多種情況下的錯誤折疊和聚集，被稱為化學伴侶[9]。蛋白質折疊與伴侶蛋白介導的突變緩沖有關，一些化學物質如鹽、糖、氨基酸和多聚物被用來提高外源蛋白的可溶性表達[10]。如葡萄糖、蔗糖、甘油等可能會緩沖蛋白表面的突變，山梨醇在體外被廣泛用作蛋白質的穩(wěn)定劑[11]，精氨酸作為蛋白質聚集抑制因子的作用已被廣泛認識[12-13]。此外，β-環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡糖，呈筒狀結構，其兩端與外部為親水性，內部為親脂性中心，被用來阻止部分折疊蛋白的不可逆性聚集。

本研究在利用大腸桿菌表達Fiber2蛋白時，大部分的蛋白以包涵體形式存在，且不與陽性血清發(fā)生瓊脂擴散沉淀反應(agar gel diffusion precipitation，AGP)。因此，本研究嘗試在培養(yǎng)基中分別加入甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、山梨醇、蔗糖、精氨酸、甘露醇等物質，篩選可以提高Fiber-2的可溶性表達的化學伴侶分子，為進一步的工藝放大奠定基礎；同時對表達的可溶性Fiber-2進行免疫原性分析，為進一步研制FAdV-4亞單位疫苗提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞、質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；pET28a載體由本實驗室保存；引物及基因序列的合成與測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)高保真DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；T4 DNA連接酶和限制性內切酶購自賽默飛世爾科技公司、FAdV-4陽性血清由普萊柯生物工程股份有限公司制備、鑒定并保存。

酵母提取物、胰蛋白胨購自OXOID公司；葡萄糖、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)購自BBI公司；瓊脂糖購自TaKaRa公司；甘油、萄糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、露醇、精氨酸、山梨醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 FAdV-Fiber-2重組表達載體的構建及鑒定

根據(jù)GenBank公布的Fiber-2基因序列(登錄號為FR872912.1)設計合成特異的引物P1和P2。P1序列NcoⅠ-F：5′-CATGCCATGGGCATGCTCCGAGCCCCTAAA-3′，P2序列HindⅢ-R：5′-CCCAAGCTTTTACGGGACGGAGGCTGCT-3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以本實驗室分離毒株FAV-HN[14]的DNA為模板，使用引物組P1和P2擴增目的基因片段，PCR反應程序為95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與pET28a載體一同由NcoⅠ和HindⅢ限制性內切酶37 ℃酶切1 h，并進行純化回收，回收產(chǎn)物由T4 DNA連接酶室溫連接1 h，然后轉化DH5α感受態(tài)細胞；提取轉化子質粒，進行酶切驗證和測序鑒定。

1.3 重組蛋白FAdV-Fiber-2的表達

將測序鑒定無誤的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落接種于100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中(含50 μg/mL硫酸卡那霉素)，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入0.2 mol/L的IPTG并降溫至28 ℃誘導表達6 h。

1.4 化學伴侶分子對重組蛋白FAdV-Fiber-2在大腸桿菌中可溶性表達的影響

將重組大腸桿菌FAdV-Fiber-2無菌接種于含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落接種于含硫酸卡那霉素的100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中(含50 μg/mL硫酸卡那霉素)，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，此時分別加入40 mL/L的甘油，40 g/L的葡萄糖，2 g/L的β-環(huán)糊精，40 g/L的山梨醇，0.4 mol/L的蔗糖，0.1 mol/L的精氨酸，40 g/L的甘露醇，同時加入0.2 mol/L的IPTG并降溫至28 ℃誘導表達6 h。

選取添加甘油、蔗糖和β-環(huán)糊精的破碎菌體上清液，添加入10 mmol/L咪唑，0.45 μm過濾后，以1 mL/min的流速通過Ni SepharoseTM6 Fast Flow鎳柱，隨后用上樣緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, pH值7.2)和洗雜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L 咪唑, pH值7.2)分別沖洗鎳柱，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 500 mmol/L 咪唑, pH值7.2)洗脫目的蛋白。收集洗脫產(chǎn)物，并用Zetasizer Nano ZSP系統(tǒng)對純化后樣品進行粒徑分析。

1.5 重組蛋白免疫效果評價

為了評價Fiber-2蛋白的免疫效果，將其用PBS緩沖液進行梯度稀釋至AGP效價為1∶20、1∶21和1∶22作為抗原，分別與礦物油佐劑按1∶2的比例乳化制備亞單位疫苗。將50只21日齡SPF雞隨機分為5組(A～E)，每組10只。A～C組雞分別皮下接種0.3 mL亞單位疫苗，F(xiàn)iber-2抗原的AGP效價依次為1∶20、1∶21和1∶22，D組接種0.3 mL FAdV全病毒滅活疫苗(1 mL抗原中含1×106TCID50的細胞源FAdV)，作為陽性對照組[15]，E組雞注射無菌PBS作為空白對照組。所有SPF雞分別于免疫后第0、7、14、21天進行翅下靜脈采血，并通過AGP檢測血清中針對FAdV的特異性抗體水平。

1.6 檢測方法

1.6.1 目的蛋白含量測定

培養(yǎng)結束后，8 000 r/min離心10 min收集菌體，取1 g濕重重懸于40 mL無菌生理鹽水中(1∶40)，冰水浴中超聲波破碎35 min，破碎條件為：超聲功率400 W，工作5 s，間歇15 s。破碎液于2～8 ℃，10 000 r/min離心10 min后取上清，進行SDS-PAGE檢測。

1.6.2 不同表達蛋白的AGP分析

采用AGP進行檢測，具體方法為：稱取1%的瓊脂粉，加入0.01 moL/L的PBS緩沖液，水浴煮沸融化后倒入平皿內，厚度2～3 mm，自然冷卻。使用打孔器打出7個相鄰的梅花孔，挑出孔內瓊脂，并在火焰上緩慢加熱以對孔底邊緣進行封閉。將1.6.1破碎后離心所得上清，用PBS倍比稀釋，緩慢加入外周梅花孔中，加滿為宜，中間孔加入FAdV陽性血清，盡量避免產(chǎn)生氣泡。以PBS緩沖液替代抗原作為陰性對照，中間孔與外周孔之間出現(xiàn)沉淀線判定為一個滴度。

2 結果

2.1 FAdV-Fiber-2重組表達載體的構建及鑒定

以P1、P2為引物，以分離毒株FAV-HN的DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后與pET28a載體一同由NcoⅠ和HindⅢ限制性內切酶37 ℃酶切1 h，并進行純化回收，回收產(chǎn)物由T4 DNA連接酶室溫連接1 h，然后轉化DH5α感受態(tài)細胞；提取轉化子質粒，酶切可得到1 400 bp左右大小的DNA片段(圖1)，與預期的FAdV-Fiber-2基因片段大小相等，并進行測序鑒定。

M.DNA分子質量標準(DL5000)；1.重組載體酶切

2.2 重組蛋白FAdV-Fiber-2的表達

重組菌種于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入0.2 mol/L的IPTG并降溫至28 ℃誘導表達6 h。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，誘導后的重組菌在60 kDa左右處出現(xiàn)明顯表達蛋白條帶，與目的蛋白預期分子量相符。上清中目的條帶較弱，目的蛋白大部分以包涵體形式存在(圖2)。對其進行AGP效價檢測，結果見表1，目的蛋白的AGP效價為1∶32。

M.預染蛋白質分子質量標準；1.未誘導上清；2.誘導后上清；3.誘導后沉淀

2.3 化學伴侶分子對重組蛋白FAdV-Fiber-2在大腸桿菌中可溶性表達的影響

重組菌種于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入不同的化學伴侶分子甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、山梨醇、蔗糖、精氨酸、甘露醇，同時加入0.2 mol/L的IPTG，并降溫至28 ℃誘導表達6 h。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，誘導后的重組菌在60 kDa左右處出現(xiàn)明顯表達蛋白條帶，與目的蛋白預期分子量相符。添加甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、山梨醇、甘露醇，都能提升FAdV-4 Fiber-2的可溶性表達量，且添加β-環(huán)糊精蛋白表達量顯著高于其他試驗組，而添加精氨酸、蔗糖，在菌體裂解上清中目的條帶的可溶性表達量，與不添加任務化學伴侶分子的對照組無顯著差異(圖3)。對其進行AGP效價檢測，結果見表1。

M.預染蛋白質分子質量標準；1.未誘導上清；2.誘導后上清；3.添加甘油組上清；4.添加葡萄糖組上清；5.添加β-環(huán)糊精組上清；6.添加山梨醇組上清；7.添加蔗糖組上清；8.添加精氨酸組上清；9.添加甘露醇組上清

表1 不同化學分子伴侶對FAdV-Fiber-2蛋白表達的影響

選取添加甘油、蔗糖和β-環(huán)糊精的樣品通過蛋白層析純化系統(tǒng)進行鎳柱純化，并利用Zetasizer Nano ZSP系統(tǒng)進行粒徑分析，結果顯示平均粒徑和聚合物分散性指數(shù)(PDI)均為β-環(huán)糊精<甘油<蔗糖(圖4、表2)。

圖4 不同化學伴侶分子處理后Fiber-2蛋白粒徑分析

表2 添加不同化學伴侶分子后Fiber-2蛋白平均粒徑和聚合物分散性指數(shù)(PDI)結果統(tǒng)計

利用德泰生物的生物信息學工具對Fiber-2蛋白的N端150多個氨基酸序列進行疏水性分析顯示其N端存在疏水性較強的結構域(圖5)，在誘導階段加入β-環(huán)糊精可能促進Fiber-2蛋白N端區(qū)肽鏈的正確折疊，從而改變三級結構，實現(xiàn)Fiber-2蛋白的可溶性表達量的提升。而蔗糖由于黏度較高，在誘導階段添加對Fiber-2蛋白的可溶性表達量無正面影響。

圖5 Fiber-2蛋白N端的疏水性分析

2.6 疫苗免疫原性分析

用AGP檢測免疫后血清FAdV-4抗體，結果顯示各組在免疫前和免疫后第7天均未檢測到FAdV-4抗體。A組(Fiber-2 蛋白AGP效價為1∶20)雞于免疫后第14和21天檢測到AGP抗體，分別為2/10和5/10。B組和C組(Fiber-2 蛋白AGP效價分別為1∶21和1∶22)雞于免疫后第14和21天，均檢測到AGP抗體。E組(FAdV全病毒滅活疫苗)在免疫后第14和21天，均檢測到AGP抗體(10/10)，與B組和C組結果一致(表3)。

表3 不同試驗組免疫后抗體反應

3 討論

FAdVs血清型多、致病力差異大。隨著近幾年因禽腺病毒感染發(fā)生的禽病加劇，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[15]，因此，禽腺病毒疫苗的研發(fā)顯得尤為迫切。Fiber-2蛋白具有型和亞群特異性抗原決定簇，可誘導機體產(chǎn)生主要的型特異性中和抗體[16-17]，對FAdV-4的感染、致病及診斷有重要意義[18]。

由于利用大腸桿菌表達Fiber-2蛋白時，大部分的蛋白以包涵體形式存在。本研究在培養(yǎng)基中分別加入甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、甘露醇、精氨酸、山梨醇等化學伴侶分子物質，發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精可以顯著提高Fiber-2蛋白的可溶性表達的量。

β-環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡糖，呈筒狀結構，其兩端與外部為親水性，內部為親脂性中心，可通過其疏水性內核與未折疊蛋白相互作用掩蓋蛋白疏水殘基，幫助蛋白重新折疊，從而提高蛋白的可溶性表達量。Du等[19]通過在細胞培養(yǎng)過程中添加β-環(huán)糊精來提升單鏈Fv抗體可溶性表達量，可溶性單鏈Fv抗體比對照組高出4.17倍。但未見其在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的成功應用，有文獻報道，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中通過添加不同濃度的β-環(huán)糊精，未能提升olFN-tau蛋白的可溶性表達量[20]。

Fiber-2蛋白的N端存在疏水性較強的結構域這一特殊的空間結構，加入β-環(huán)糊精可能促進了其N端區(qū)肽鏈的正確折疊，從而改變了三級結構，使Fiber-2蛋白的可溶性表達量的提升；同時提示，對于其他類似Fiber-2蛋白這種N端具有較強的疏水性特性的蛋白，可以嘗試通過添加β-環(huán)糊精這一方法來提高蛋白的可溶性表達。

以可溶性表達的重組fiber-2蛋白為抗原免疫 SPF 雞，利用AGP檢測接種后雞血清中針對FAdV-4的抗體，抗原AGP效價1∶21和1∶22免疫組與細胞培養(yǎng)的FAV-HN滅活疫苗對照組所有雞在免疫后第14和21天AGP檢測血清抗體轉陽，表明重組蛋白抗原進入機體后能夠有效刺激機體免疫系統(tǒng)快速產(chǎn)生免疫應答，證明表達可溶性重組Fiber-2蛋白具有較好的免疫原性，且產(chǎn)生的抗體能夠與FAdV-4發(fā)生特異性抗原抗體反應，抗原可有效刺激免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體。

4 結論

研究探索了不同化學分子伴侶對重組Fiber-2蛋白可溶性表達的影響，首次發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精可顯著提高FAdV-4 Fiber-2蛋白可溶性表達量，為進一步的工藝放大提供了依據(jù)，同時為其他同類外源蛋白質在原核中的可溶性表達提供了借鑒。對表達的可溶性Fiber-2進行免疫原性分析，為進一步研制FAdV-4亞單位疫苗提供實驗依據(jù)。