申佳佳 汪 珩 張 藝 陳俊鵬 許克銓 王旭龍 王文策 朱勇文* 楊 琳*

(1.華南農業(yè)大學動物科學學院，廣東省動物營養(yǎng)調控重點實驗室，廣州 510642；2.汕頭市白沙禽畜原種研究所，汕頭 515800)

微生物發(fā)酵能夠有效降解、轉化飼料原料中抗營養(yǎng)因子，具有提高動物養(yǎng)分利用率等作用。飼料原料經微生物發(fā)酵后，營養(yǎng)價值得到較大提升，在家禽生產上的應用優(yōu)勢日益凸顯[1]。研究表明，飼糧中添加適宜水平發(fā)酵豆粕或發(fā)酵菜籽粕可提高肉雞蛋白質和氨基酸消化率，促進肌肉中氨基酸、脂肪酸、肌苷酸等風味物質沉積，改善肉品質[2-3]。棉籽粕的氨基酸種類豐富、比例合理，其養(yǎng)分含量接近豆粕[4]。但棉籽粕中的抗營養(yǎng)因子棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸等可與動物消化道中的酶及蛋白質結合，降低蛋白質消化率；同時抑制腸道礦物質和六碳糖的轉運，降低家禽生長性能[5]。而棉籽粕經發(fā)酵后可降低抗營養(yǎng)因子含量，提高養(yǎng)分利用率。目前，發(fā)酵棉籽粕實際生產應用主要集中在肉雞和肉鴨上，且適宜水平的推薦量存在差異。研究表明，飼糧中添加6%發(fā)酵棉籽粕可提高雞的生長性能，并通過影響雞的能量代謝減輕脂肪沉積，降低腹脂和皮脂厚度[6-7]。王婷[8]研究證實，飼糧中添加9.0%～13.5%的發(fā)酵棉籽粕對肉鴨生長性能較為理想，且對肝臟發(fā)育、血液指標無顯著影響。但目前發(fā)酵棉籽粕對肉鵝飼用價值的研究報道甚少，有待探索發(fā)酵棉籽粕在肉鵝飼糧中的適宜水平。因此，本試驗旨在研究飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對28～70日齡馬岡鵝生長性能、屠宰性能、腸道形態(tài)結構及回腸黏膜免疫屏障相關基因表達的影響，以期為發(fā)酵棉籽粕在馬岡鵝非常規(guī)飼料的配制應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計

試驗在汕頭白沙禽畜原種研究所試驗場進行。選用28日齡健康、體重相近的馬岡鵝公鵝432只，采用單因素完全隨機設計，隨機分為6個組，每組6個重復，每個重復12只。試驗期42 d。試驗鵝采用地面平養(yǎng)，自由采食和飲水。

1.2 試驗飼糧

試驗所用發(fā)酵棉籽粕采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母固態(tài)發(fā)酵。經測定，發(fā)酵前、后粗蛋白質含量分別為45.67%、44.26%，游離棉酚含量分別為940、440 mg/kg。

參照NRC(1994)鵝營養(yǎng)需要，以玉米-豆粕型飼糧為基礎，6個等能等氮等纖維飼糧中發(fā)酵棉籽粕水平分別為0(對照組)、5%、10%、15%、20%和25%，游離棉酚含量分別為0、22、44、66、88和110 mg/kg。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items發(fā)酵棉籽粕水平 Fermented cottonseed meal level/%0510152025營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)11.8411.8411.8411.8411.8411.84粗蛋白質 CP17.0617.5217.6917.4417.0517.56粗纖維 CF5.705.705.705.705.705.70鈣 Ca0.800.800.800.800.800.80非植酸磷 AP0.400.400.400.400.400.40蘇氨酸 Thr0.700.700.700.700.700.70賴氨酸 Lys0.810.810.810.810.810.81蛋氨酸 Met0.360.360.360.360.360.36游離棉酚 FG/(mg/kg)022446688110

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 飼糧中粗蛋白質和游離棉酚含量測定

粗蛋白質含量測定：每組準確稱取飼糧樣品各0.5 g，置于消化管中，添加催化劑(K2SO46 g、CuSO40.4 g)，添加濃硫酸12 mL，消煮后上KJELTEC-2300型全自動定氮儀進行測定，記錄氮含量，并計算粗蛋白質含量。

游離棉酚含量測定：每組準確稱取1.00 g飼糧樣品，置于三角瓶中，添加50 mL提取液(715 mL 95%乙醇，285 mL水，200 mL乙醚，0.2 mL冰乙酸)。室溫振蕩提取30 min，過濾(0.5濾膜)清液直接用于Agilent-1290型高效液相色譜儀測定，并計算游離棉酚含量。

1.3.2 生長性能

于70日齡當天08:00對試驗鵝進行空腹稱重(稱前停飼6 h)，記錄耗料量，統計各組試驗鵝每日采食量和增重情況，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.3 屠宰性能

于70日齡時，從每重復中抽取接近該重復體重的2只鵝進行屠宰，頸靜脈放血致死，用濕法拔毛瀝干水分后稱重，測定其屠宰性能。測定指標包括屠宰率、全凈膛率、半凈膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率。試驗操作及指標的測定方法參照《家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》(NY/T 823—2004)進行。

1.3.4 腸道發(fā)育和形態(tài)結構

取完整十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸，剔除脂肪和食糜后測量各部分長度并稱重，計算得到各個腸段相對于試驗鵝活重的相對長度(cm/kg)、相對重量(g/kg)。

根據對腸道發(fā)育具有顯著影響的發(fā)酵棉籽粕水平，篩選0、5%、15%和25%組進一步研究飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對腸道形態(tài)結構及免疫屏障相關基因表達的影響。取十二指腸、空腸、回腸腸段中部相同位置約1.5 cm，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，置于4%甲醛固定液中，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，結果由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.3.5 回腸黏膜免疫屏障相關基因mRNA相對表達量

閉鎖小環(huán)蛋白-1(ZO-1)、閉合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)、核因子-κB(NF-κB)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)基因的引物序列信息見表2，由上海生工生物技術有限公司合成，內參基因為β-肌動蛋白(β-actin)。采用Magen生物公司的RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，實時熒光定量PCR使用Quantifast STBR Green PCR kit試劑盒和Bio-rad CFX-96型熒光定量PCR儀進行，每個實時定量PCR設3個重復。PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火延伸30 s，總計40個循環(huán)。

表2 目的基因的引物序列信息

1.4 數據統計分析

采用SAS v6.12軟件的GLM程序進行單因素方差分析，然后通過Duncan氏法進行多重比較，試驗結果使用平均值和均值標準誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對28～70日齡馬岡鵝生長性能的影響

由表3可知，飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對28～70日齡馬岡鵝ADG和ADFI無顯著影響(P>0.05)，但對F/G有顯著影響(P<0.05)。20%和25%發(fā)酵棉籽粕水平組的F/G顯著高于對照組(P<0.05)，但與其他各組無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對28～70日齡馬岡鵝生長性能的影響

2.2 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝屠宰性能的影響

由表4可知，飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腹脂率均無顯著影響(P>0.05)，但對腿肌率有顯著影響(P<0.05)。25%發(fā)酵棉籽粕水平組的腿肌率顯著低于對照組(P<0.05)，但與其他各組無顯著差異(P>0.05)。

表4 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝屠宰性能的影響

2.3 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝腸道發(fā)育及形態(tài)結構的影響

由表5和表6可知，飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡肉鵝十二指腸、回腸、盲腸和總腸道相對長度以及空腸、回腸、盲腸、直腸和總腸道相對重量均無顯著影響(P>0.05)，但對空腸和直腸相對長度以及十二指腸相對重量有顯著影響(P<0.05)。25%發(fā)酵棉籽粕水平組空腸、直腸相對長度顯著高于對照組和15%發(fā)酵棉籽粕水平組(P<0.05)，且十二指腸相對重量顯著高于其他各組(P<0.05)。

表5 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝腸道相對長度的影響

表6 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝腸道相對重量的影響

由表7可知，飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對十二指腸隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度，空腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度，回腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度均無顯著影響(P>0.05)，但對十二指腸絨毛高度和回腸隱窩深度有顯著影響(P<0.05)。隨著飼糧發(fā)酵棉籽粕水平的增加，十二指腸絨毛高度呈現降低趨勢，15%和25%發(fā)酵棉籽粕水平組十二指腸絨毛高度顯著低于對照組(P<0.05)；隨著飼糧發(fā)酵棉籽粕水平的增加，回腸隱窩深度呈現先降低后升高的趨勢，15%發(fā)酵棉籽粕水平組回腸隱窩深度顯著低于對照組(P<0.05)。

表7 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝腸道形態(tài)結構的影響

2.4 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對鵝回腸黏膜免疫屏障相關基因mRNA相對表達量的影響

由表8可知，飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對回腸黏膜Claudin的mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)，但對回腸黏膜ZO-1、Occludin、NF-κB、IL-6、IL-10的mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)。25%發(fā)酵棉籽粕水平組的回腸黏膜ZO-1、Occludin、NF-κB、IL-6的mRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，回腸黏膜IL-10的mRNA相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。

表8 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對馬岡鵝回腸黏膜免疫屏障相關基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對28～70日齡馬岡鵝生長性能和屠宰性能的影響

棉籽粕中棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸、植酸等抗營養(yǎng)因子含量過高會導致畜禽食欲下降、生長遲緩，影響機體正常代謝和生殖能力[9]。而棉籽粕經發(fā)酵后其中的抗營養(yǎng)因子得到有效降解，從而提高飼料利用率并改善家禽生長性能。目前，發(fā)酵棉籽粕的研究主要集中在肉雞和肉鴨上。Tang等[10]和馮江鑫[11]等先后證實5%～8%發(fā)酵棉籽粕能顯著提高肉雞生長性能，并顯著降低F/G。閆理東等[12]發(fā)現生長期肉仔雞飼喂9%發(fā)酵棉籽粕顯著降低了ADG和ADFI。周聯高等[13]和王雅倩等[14]在櫻桃谷肉鴨上的研究表明，飼喂6%發(fā)酵棉籽粕其生長性能最好，效益最高，且胴體品質能夠得到改善。而Zeng等[15]研究發(fā)現，飼糧33.11%發(fā)酵棉籽粕水平(游離棉酚含量152 mg/kg)顯著降低了ADG和ADFI。上述研究結果不一致的原因可能與棉籽粕發(fā)酵工藝、飼糧抗營養(yǎng)因子含量高低及品種、生長階段不同等因素密切相關。本試驗結果表明，飼糧發(fā)酵棉籽粕水平(5%～25%)對28～70日齡肉鵝ADG和ADFI無顯著影響，與Wang等[16]肉雞方面的研究結果基本一致。但飼糧高水平(20%和25%)發(fā)酵棉籽粕引起28～70日齡肉鵝F/G顯著增加。一方面，隨著發(fā)酵棉籽粕水平增加，高劑量棉酚、植酸等抗營養(yǎng)因子與蛋白質、氨基酸、礦物質結合，使得肉鵝養(yǎng)分利用率下降[17]；另一方面，發(fā)酵棉籽粕中的棉酚對腸道中胃蛋白酶和胰淀粉酶等內源酶有直接的抑制作用，影響蛋白質和淀粉等營養(yǎng)物質吸收利用，從而影響飼料利用效率[18]。

屠宰性能方面，本試驗發(fā)現飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝屠宰率、半凈膛率和全凈膛率無顯著影響，與Yu等[19]在肉鵝上屠宰性能的結果基本一致。但飼糧25%發(fā)酵棉籽粕水平顯著降低70日齡肉鵝腿肌率，其原因可能是發(fā)酵棉籽粕中的棉酚與肌肉中的蛋白質形成復合物，抑制了蛋白質沉積，從而導致腿肌率降低[20]。而魏蓮清等[21]等研究表明，飼糧中添加發(fā)酵棉籽粕可以顯著提高肉雞半凈膛率和腿肌率，且6%發(fā)酵棉籽粕水平組腿肌率最高。上述研究結果不一致的原因可能是飼糧發(fā)酵棉籽粕水平不同以及不同物種對棉籽粕抗營養(yǎng)因子的耐受性高低有關。綜合考慮本試驗生長性能指標，建議28～70日齡肉鵝飼糧發(fā)酵棉籽粕水平控制在20%(游離棉酚含量88 mg/kg)以內。

3.2 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對70日齡馬岡鵝腸道發(fā)育和形態(tài)結構的影響

3.3 飼糧發(fā)酵棉籽粕水平對馬岡鵝回腸黏膜免疫屏障相關基因mRNA相對表達量的影響

腸上皮細胞腸屏障功能可保證腸腔內的物質與外界分離，防止病原體抗原入侵的功能。腸黏膜上皮細胞彼此相連，構成完整的生物屏障，細胞質膜蛋白與接頭蛋白形成的蛋白網狀結構是緊密連接的重要部分[32]。ZO-1是重要的細胞質接頭蛋白，Occludin和Claudin是主要的細胞質跨膜蛋白[33]。這3種蛋白的表達減少或結構損傷可破壞腸道免疫屏障功能，致使腸壁通透性增加。本試驗結果發(fā)現，25%發(fā)酵棉籽粕水平組的回腸黏膜ZO-1和Occludin的mRNA相對表達量顯著升高；Claudin的mRNA相對表達量呈下降趨勢，但并未達到顯著水平。這與Wang等[34]在體外試驗中的發(fā)現一致，高濃度棉酚可通過上調草魚腸道細胞中磷肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達，下調Claudin-b的表達。饒淵[35]發(fā)現高棉籽粕水平組可顯著下調蛋雞空腸Occludin蛋白表達，其原因可能是雞與鵝的物種屬性差異導致其主體整體協調反饋機制不同，同時對于棉酚的耐受反應也不盡相同。肉雞方面的研究發(fā)現，發(fā)酵棉籽粕中的棉酚、植酸等抗營養(yǎng)因子可誘導腸道細菌產生大量毒素，引起壞死性腸炎[36]。飼糧25%發(fā)酵棉籽粕水平(游離棉酚含量120 mg/kg)可顯著上調肉鵝回腸黏膜的NF-κB和IL-6的mRNA相對表達量。研究表明，NF-κB是存在于多種細胞中的一種基因轉錄調控蛋白，受外界信息刺激活化，從胞漿進入胞核與炎性因子(如IL-1、IL-6等)基因啟動子區(qū)域中的κB位點結合，啟動炎性因子基因轉錄為mRNA，從而促進其合成，在炎癥反應中起重要調控作用[37]。此外，肉鵝飼喂高水平發(fā)酵棉籽粕還可抑制抗炎細胞因子IL-10的表達，與在蛋雞[38]和草魚[34]方面的研究結果一致，可能與棉酚會加重生長期草魚腸道組織病理學病變，降低腸道免疫功能有關。由此推測，發(fā)酵棉籽粕中的棉酚可能引起回腸的炎癥反應，進而導致小腸絨毛高度下降等形態(tài)結構的破壞。但其促炎癥反應等的機制是否通過NF-κB信號轉導通路上調炎癥因子表達來發(fā)揮作用，有待進一步研究。

4 結 論

綜上所述，基于F/G、腸道形態(tài)結構和免疫屏障等指標，推薦28～70日齡馬岡鵝飼糧發(fā)酵棉籽粕水平不高于20%(游離棉酚不高于88 mg/kg)。飼糧發(fā)酵棉籽粕水平過高可引起28～70日齡馬岡鵝腸道形態(tài)結構和免疫屏障功能受損，導致飼料轉化率降低。