祝雪麗 熊尚全 陳懷宇 褚劍鋒 吳翔 何紹吾 李瑋

摘要 目的：研究丹參飲通過介導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活型受體γ（PPAR-γ）/肝X受體α（LXR-α）/三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）信號通路減輕大鼠冠狀動脈粥樣硬化的作用機制。方法：選取無特定病原體（SPF）級40只健康Wistar大鼠作為實驗動物，隨機分為空白組、冠狀動脈粥樣硬化組（對照組）、丹參飲低劑量觀察組（低劑量組）和丹參飲高劑量觀察組（高劑量組），比較各組大鼠的炎癥介質(zhì)水平、ICAM-1水平、脂代謝水平、PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達和蛋白表達。結(jié)果：對照組、低劑量組和高劑量組的三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的TG、TC和LDL-C均低于對照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05），但4組的HDL-C表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;對照組、低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達均低于對照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05）;對照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA和蛋白表達均高于空白組（P<0.05），且低劑量組和高劑量組明顯高于對照組（P<0.05），高劑量組明顯高于低劑量組（P<0.05）。結(jié)論：丹參飲可以通過對PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號通路的介導(dǎo)，發(fā)揮出抗冠狀動脈粥樣硬化的作用。

關(guān)鍵詞 丹參飲;冠狀動脈粥樣硬化;過氧化物酶體增殖物激活型受體γ;肝X受體α;三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1;丹參;檀香;砂仁;冠心病預(yù)防

Abstract Objective：To study on Danshen Drink by mediating peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPAR-γ）/liver X receptor α（LXR-α）/adenosine triphosphate binding cassette transporter A1（ABCA1） signaling pathway to alleviate the mechanism of coronary atherosclerosis of rats.Methods：A total of 40 healthy Wistar rats of SPF-free grade were selected as the experimental animals，and were randomly divided into a blank group，a coronary atherosclerosis group（control group），Danshen Drink low-dose treatment group（low-dose group） and Danshen Drink high Dose treatment group（high-dose group）.The levels of inflammatory mediators，ICAM-1，lipid metabolism，PPAR-γ，LXR-α and ABCA1 mRNA expression and protein expression in each group of rats were compared.Results：The triacylglycerol（TG），cholesterol（TC），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C） and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） of the control group，low-dose group and high-dose group were all higher than those of the blank group（P<0.05），the TG，TC and LDL-C of the low-dose group and the high-dose group were lower than those of the control group（P<0.05），and the high-dose group was lower than the low-dose group（P<0.05），but there was no statistically significant difference in the HDL-C expression of 4 groups（P>0.05）; the expressions of inflammatory mediators and ICAM-1 in the control group，low-dose group and high-dose group were higher than those in the blank group（P<0.05），low-dose group and high-dose group The expressions of inflammatory mediators and ICAM-1 in the control group were lower than those in the control group（P<0.05）.The protein expressions of PPAR-γ、LXR-α and ABCA1 mRNA were higher than those of the blank group（P<0.05）.And the low-dose and high-dose groups were significantly higher than those of the control group（P<0.05），and the high-dose group was significantly higher than the low-dose group（P<0.05）.Conclusion：Danshen Drink can play an anti-coronary atherosclerosis effect by mediating the PPAR-γ-LXR-α-ABCA1 signaling pathway.

Keywords Danshen Drink; Coronary atherosclerosis; PPAR-γ; ABCA1; LXR-α; Radix Salviae Miltiorrhizae; Lignum Santali Albi; Fructus Amomi Villosi; Prevention of coronary heart disease

中圖分類號：R289.5;R541.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.010

冠狀動脈是動脈粥樣硬化的主要累及血管，冠狀動脈粥樣硬化會導(dǎo)致患者出現(xiàn)管腔閉塞或破裂、出血，增加了患者的心血管疾病發(fā)生率，威脅到了患者的身體健康[1-3]。近年來，相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活型受體γ（PPAR-γ）/肝X受體α（LXR-α）/三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）信號通路與機體的動脈粥樣硬化密切相關(guān)[4]。其中PPAR-γ的活化可以減少機體內(nèi)趨化因子受體的表達，從而減少了斑塊周圍產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮出了對動脈粥樣硬化的預(yù)防作用[5-6]?；诖?，本研究丹參飲通過介導(dǎo)PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號通路減輕大鼠冠狀動脈粥樣硬化的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

本研究于上海斯萊克實驗動物有限公司內(nèi)購進了40只無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級健康Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為250～310 g，平均體質(zhì)量為（283.55±34.48）g。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005;實驗動物使用許可證SYXK（閩）：2016-0005。動物實驗中心環(huán)境衛(wèi)生清潔符合標準，實驗動物按照要求進行喂食，控制溫度（24±2）℃，濕度控制在50%左右。

1.1.2 藥物

丹參飲（丹參30 g、檀香4.5 g、砂仁4.5 g），購進于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥房，浸泡30 min后，按照W/V=1/8的比例加水煎煮2次（檀香后下），藥液經(jīng)1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min后去除雜質(zhì)，將其濃縮為含生藥量1 g/mL。

1.1.3 試劑與儀器

試劑：PPAR-γ（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：SC-7273）;LXR-α（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：sc-377360）;ABCA1（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：sc-58219）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀生物有限公司，批號：c-23169）;羊抗鼠IgG（北京康為世紀生物有限公司，批號：c-33365）;羊抗兔IgG（北京康為世紀生物有限公司，批號：c-50243）;RIPA裂解液（北京康為世紀生物有限公司，貨號：ps0013）;Trizon（北京康為世紀生物有限公司，批號：39es50）;BCA試劑盒（北京康為世紀生物有限公司，批號：c-44123）。

儀器：小動物呼吸機（北京北瑞未來科技公司，型號：DW-3000B）;高速小型臺式離心機（上海貝曼生物科技發(fā)展有限公司，型號：1-13型）;Realtime-PCR儀（ABI公司，美國，型號：7900型）;水平電泳槽（山東鑫貝西科學(xué)儀器有限公司，型號：DYCP-31DN型）;電泳儀（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心，型號：170-3920型）;電轉(zhuǎn)儀及附件（伯樂BIO-RAD公司，美國，型號：170-3930型）;NC膜Whatman硝酸纖維素膜（上海柏絲特生物公司，型號：10401396）;濾紙（沃特曼Whatman公司，英國，型號：3MMCHR型）;高效液相色譜儀（杭州瑞析科技有限公司，型號：1260Ⅱ型）;微量加樣槍（Eppendorf公司，德國，型號：3114）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

所有SD大鼠自由飼養(yǎng)7 d后，隨機將其分為空白組、對照組和觀察組，空白組10只喂飼普通飼料，對照組10只和觀察組20只喂飼高脂飼料，每日高脂飼料（膽固醇：豬油：丙硫氧嘧啶：基礎(chǔ)飼料=4∶10∶0.2∶86的比例配制）喂養(yǎng)，并灌胃脂肪乳劑10 mL/（kg·d），脂肪乳劑配制方法：將豬油20 g融化后，加入10 g膽固醇、2 g膽酸鈉，攪勻后加入20 mL吐溫，蒸餾水加至100 mL充分混勻，使用時使用37 ℃水浴融化，連續(xù)喂養(yǎng)6周。

1.2.2 給藥方法

觀察組及對照組在喂食開始時一次性腹腔注射維生素D60萬IU/kg，觀察組分為低劑量組和高劑量組各10只。按大鼠與人的體質(zhì)量及體表面積比值換算公式得到大鼠每天灌胃7.74 g/（kg·d），其中低劑量組在高脂飼料基礎(chǔ)上添加濃縮液一半的劑量（計算量=0.5×7.74 g/（kg·d）×大鼠的體質(zhì)量）灌胃治療，1次/d，于中午喂食，高劑量組在高脂飼料基礎(chǔ)上添加全部濃縮液的劑量（計算量=7.74 g/（kg·d）×大鼠的體質(zhì)量）灌胃治療，1次/d，于中午喂食。所有大鼠均飼養(yǎng)6周。

1.2.3 檢測指標與方法

1）經(jīng)大鼠尾靜脈取空腹血液標本，使用全自動生化分析儀對大鼠的脂代謝指標進行檢測，包括三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。2）采用脊柱脫臼法處死大鼠，在冰浴條件下纖維操作分離冠狀動脈標本，采用PCR法和Western Blotting法檢測大鼠的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、核因子κB和黏附因子（ICAM-1）的表達情況。3）采用熒光定量PCR法對大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達水平進行檢測，按照Tirzol試劑盒的相關(guān)操作說明提取總RNA，同時按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并對其進行PCR擴增，于95 ℃的條件下預(yù)變性10 min，隨后在95 ℃條件下15 s，60 ℃條件下60 s反復(fù)循環(huán)40次。4）采用Western Blotting法對大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表達進行檢測，取大鼠主動脈血管，使用液氮研磨后將0.5 mL的RIPA裂解液加入，并進行逆超聲破碎，離心取上清后采用BCA法對蛋白水平進行測定。引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行處理，多組間計量資料使用F檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的脂代謝水平比較

對照組、低劑量組和高劑量組的TG、TC、HDL-C和LDL-C均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的TG、TC和LDL-C均低于對照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05），但各組的HDL-C表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2 各組大鼠的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達比較

對照組、低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達均高于空白組（P<0.05），低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達均低于對照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組（P<0.05）。見表3。

2.3 各組大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達比較

對照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表達均高于空白組（P<0.05），且低劑量組和高劑量組明顯高于對照組（P<0.05），高劑量組明顯高于低劑量組（P<0.05）。見表4。

2.4 各組大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表達比較

對照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表達均高于空白組（P<0.05），且低劑量組和高劑量組明顯高于對照組（P<0.05），高劑量組明顯高于低劑量組（P<0.05）。見表5。

3 討論

動脈粥樣硬化作為心腦血管疾病發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，其與機體的血脂異常密切相關(guān)，合理的使用降脂藥物對動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療具有積極作用[7-9]。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ與LXR-α均屬于和轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，在機體的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮出了重要的作用，同時也是目前高血脂藥物的治療新靶點[10-14]。丹參作為一種傳統(tǒng)中藥，相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的機體免疫調(diào)節(jié)作用，同時還具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等功效[15-17]。有報道指出，丹參中具有多種抗氧化活性成分，其與山楂等中藥是目前臨床中心血管疾病的常用預(yù)防和治療藥物，并發(fā)揮出了較好的療效[18-19]。還有報道發(fā)現(xiàn)，丹參中的主要成分為丹參酮，而其可以通過對機體內(nèi)環(huán)境的改善，發(fā)揮出舒張血管的功效，可以有效調(diào)節(jié)患者的血脂水平[20]。

本研究通過對各組大鼠脂代謝表達的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組、低劑量組和高劑量組的TG、TC、HDL-C和LDL-C均高于空白組，低劑量組和高劑量組的TG、TC和LDL-C均低于對照組（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組，但各組的HDL-C表達并無顯著差異，表明高劑量的丹參飲可以有效降低冠狀動脈粥樣硬化大鼠的血脂表達。對照組、低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達均高于空白組，低劑量組和高劑量組的炎癥介質(zhì)和ICAM-1表達均低于對照組，且高劑量組低于低劑量組，說明丹參飲有利于降低大鼠的炎癥反應(yīng)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)對照組、低劑量組和高劑量組的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA和蛋白表達均高于空白組，且低劑量組和高劑量組明顯高于對照組，高劑量組明顯高于低劑量組，說明丹參飲可以通過對PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號通路的介導(dǎo)，從而實現(xiàn)對冠狀動脈粥樣硬化的治療，主要是因為丹參飲中的丹參具有活血化瘀的功效，藥劑中的砂仁可以通過與檀香的配伍，發(fā)揮出活血行氣、止痛通絡(luò)的功效[21]。

綜上所述，丹參飲作為一種傳統(tǒng)的中藥制劑，其可以通過對PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信號通路的介導(dǎo)，發(fā)揮出抗冠狀動脈粥樣硬化的作用，應(yīng)在臨床廣泛應(yīng)用及推廣。

參考文獻

[1]Siasos G，Sara JD，Zaromytidou M，et al.Local Low Shear Stress and Endothelial Dysfunction in Patients With Nonobstructive Coronary Atherosclerosis[J].J Am Coll Cardiol，2018，71（19）：2092-2102.

[2]趙圣吉，劉超權(quán)，鄭偉民.瑞舒伐他汀鈣片治療冠狀動脈粥樣硬化的臨床研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2019，35（15）：1552-1555.

[3]Ayoub C，Erthal F，Abdelsalam MA，et al.Prognostic value of segment involvement score compared to other measures of coronary atherosclerosis by computed tomography：A systematic review and meta-analysis[J].J Cardiovasc Comput Tomogr，2017，11（4）：258-267.

[4]余承潔，李敬達，修志龍，等.ox-LDL經(jīng)由LOX-1受體對PPARγ-LXRα-ABCA1通路激活的作用研究[J].中國動脈硬化雜志，2017，25（10）：978-984.

[5]Illesca P，Valenzuela R，Espinosa A，et al.Hydroxytyrosol supplementation ameliorates the metabolic disturbances in white adipose tissue from mice fed a high-fat diet through recovery of transcription factors Nrf2，SREBP-1c，PPAR-γ and NF-κB[J].Biomed Pharmacother，2019，109：2472-2481.

[6]Naeini Z，Toupchian O，Vatannejad A，et al.Effects of DHA-enriched fish oil on gene expression levels of p53 and NF-κB and PPAR-γ activity in PBMCs of patients with T2DM：A randomized，double-blind，clinical trial[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2020，30（3）：441-447.

[7]Rifai MA，Blaha MJ，Patel J，et al.Coronary Artery Calcification，Statin Use and Long-Term Risk of Atherosclerotic Cardiovascular Disease Events（from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis）[J].Am J Cardiol，2020，125（6）：835-839.

[8]吳學(xué)正，吳小燕，陳衛(wèi)衛(wèi)，等.阿托伐他汀鈣片聯(lián)合依折麥布片治療冠狀動脈粥樣硬化的臨床研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（4）：406-409.

[9]孟甜甜，解小龍，李婷婷，等.口服中成藥聯(lián)合他汀類藥物治療血脂異常的網(wǎng)狀Meta分析[J].中草藥，2021，53（4）：1092-1104.

[10]趙博文，陳艷昆，張栩，等.基于PPARγ-LXRα-ABCA1通路的中藥降脂成分研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，41（2）：131-139.

[11]Badawy AM，El-Naga RN，Gad AM，et al.Wogonin pre-treatment attenuates cisplatin-induced nephrotoxicity in rats：Impact on PPAR-γ，inflammation，apoptosis and Wnt/β-catenin pathway[J].Chem Biol Interact，2019，308：137-146.

[12]覃琴，馮柏林，唐麗清，等.五加科植物中藥對膽固醇的調(diào)節(jié)作用及機制研究進展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2019，25（10）：197-204.

[13]張美娜，蔣鑫，孫琛，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究丹參中化合物激活T淋巴細胞的潛在作用機制研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2020，36（7）：842-845+848.

[14]莫瓊，郝二偉，覃文慧，等.平性活血化瘀中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與藥理作用的研究進展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2020，26（1）：205-216.

[15]王小平，杜少兵，白吉慶，等.丹參-紅花藥對心肌缺血大鼠CYP450酶活力和mRNA表達的影響[J].中成藥，2021，43（3）：782-786.

[16]張曉，楊帆，徐又佳.丹參水溶性成分對小鼠單核巨噬細胞的增殖、破骨細胞分化的影響及其機制[J].中華實驗外科雜志，2021，38（2）：379-380.

[17]楊寧娟，劉妍如，唐志書，等.基于“質(zhì)量標志物-生物活性”關(guān)聯(lián)分析評價丹參的等級[J].中草藥，2021，53（4）：1135-1142.

[18]何琦，史華，丹陽，等.加味丹參飲對慢性心力衰竭大鼠心臟功能和血清炎性因子IL-6及TNF-α的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2019，45（1）：63-68.

[19]王玉珍，王詩堯，王秀艷.丹參川芎嗪注射液聯(lián)合阿托伐他汀鈣片治療老年高血壓的臨床研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（7）：760-762.

[20]陳亞紅，劉傳鑫，何濤，等.丹參飲治療糖尿病心肌病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中草藥，2019，50（5）：1164-1174.

[21]朱黎霞.丹參飲氣滯血瘀型冠心病患者藥物代謝動力學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（9）：4171-4174.

（2021-04-28收稿 責任編輯：張雄杰）