PPARγ激動因子與胰島素互作影響延邊黃牛前脂肪細(xì)胞分化

郭盼盼，閆 妍，張軍芳，金 鑫，李香子，嚴(yán)昌國*，尹云厚

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000;2.貴州民族大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

延邊黃牛是我國五大地方優(yōu)良品種之一，是我國畜禽品種基因庫中一份極其珍貴的“財富”，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇，已形成了適應(yīng)性強(qiáng)、屠宰率高、肉質(zhì)優(yōu)良等特點，具有生產(chǎn)高檔牛肉的優(yōu)秀潛力，但其優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成的具體調(diào)控機(jī)制仍不是很明確。目前，畜牧學(xué)研究者比較重視肌內(nèi)脂肪的研究，因為動物肉品質(zhì)的好壞與肌內(nèi)脂肪含量的高低顯著相關(guān)[1]，而較低的肌內(nèi)脂肪(大理石花紋)仍是提高延邊黃牛牛肉品質(zhì)的挑戰(zhàn)。而且，在外來商業(yè)肉牛的競爭下，延邊黃牛的經(jīng)濟(jì)價值也因其胴體中較低的肌內(nèi)脂肪(大理石紋)含量而嚴(yán)重降低。因此，提高肌內(nèi)脂肪含量便成為改善肉類品質(zhì)的關(guān)鍵，而脂肪生成分子機(jī)制研究可為改善肉質(zhì)提供寶貴的信息。

肌內(nèi)脂肪的沉積涉及一個連續(xù)的過程鏈，包括前脂肪細(xì)胞的增殖、分化和成熟[2]。胰島素是調(diào)控機(jī)體能量代謝的主要激素之一，可以顯著提高脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因FAS和ACC1的表達(dá)，有效促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化[3-4]，且存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。過氧化物酶體增殖物激活受體-PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)是調(diào)控脂肪細(xì)胞形成、脂肪組織發(fā)育和維持成熟脂肪細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，而環(huán)格列酮(ciglitazone)是PPARγ主要的激活劑之一，可通過激活PPARγ基因從而有效促進(jìn)脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)[5-6]。單不飽和脂肪酸是前脂肪細(xì)胞增殖與分化過程重要的調(diào)控因子。其中油酸就是比其他長鏈脂肪酸更能充分誘導(dǎo)脂肪生成的一種重要的單不飽和脂肪酸(MUFA)，不但可以從牛的胃腸道吸收，還可以通過內(nèi)源性生成[7-8]。而且油酸作為PPARγ的天然配體，可促進(jìn)PPARγ向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[9]。

此前，我們已經(jīng)確定了胰島素、油酸和環(huán)格列酮三者對延邊黃牛前脂肪細(xì)胞分化中主要基因表達(dá)的影響，為了繼續(xù)研究三者在調(diào)控前脂肪細(xì)胞分化機(jī)制中的作用，本試驗以延邊黃牛為研究對象，利用膠原酶消化法，在無菌條件下分離獲得延邊黃牛前脂肪細(xì)胞并建立體外培養(yǎng)體系，通過油紅O染色和實時熒光定量PCR技術(shù)比較分析胰島素和PPARγ激動因子對脂肪細(xì)胞分化過程中相關(guān)基因表達(dá)及脂滴生成情況的影響。試驗材料雖然是采集延邊黃牛皮下脂肪組織的前脂肪細(xì)胞，但目標(biāo)是為了更好地了解調(diào)節(jié)脂肪生成的因素，以便將所發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的發(fā)育研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑FBS、PBS、DMEM、青鏈霉素混合液(雙抗)、胰蛋白酶、TRIzol Reagent、環(huán)格列酮、油酸、油紅O染色試劑盒、甘油三酯試劑盒均購自長春朝陽區(qū)邁希試劑耗材經(jīng)銷處；GAPDH、PPARγ、SCD、SREBP1、LPL、C/EBPβ引物購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)液的配置基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM+10% FBS+1% PS(2.5 mg/L兩性霉素+50 mg/L慶大霉素)；分化培養(yǎng)液:DMEM+5% FBS+1% PS(2.5 mg/L 兩性霉素+50 mg/L慶大霉素)；凍存液:DMEM+10% DMSO+10% FBS；清洗液:1% PS+PBS+二酶(2.5 mg/L兩性霉素+50 mg/L慶大霉素)；消化液:DMEM+1% PS+2 g/L膠原酶(collagenase)+1% BSA。

1.3 原代脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)從延邊黃牛皮下脂肪組織中提取原代脂肪細(xì)胞。取樣部位先用75%乙醇清洗，然后用無菌的手術(shù)刀小心取下100 g脂肪組織，用清洗液清洗2～3次后立即轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)室。

將取回的脂肪組織放置于滅菌的培養(yǎng)皿中，用清洗液清洗4～5次，用無菌鉗和剪刀去除血管和筋膜等，并將其剪碎，再用膠原酶進(jìn)行酶消化，并在37℃水浴中持續(xù)1 h。每隔5 min振蕩1次，以保證充分消化，用等體積的培養(yǎng)液中和該消化混合物后，使用100 μm的細(xì)胞篩過濾。將過濾后的濾液1 500 r/min 離心10 min，去上清液，加入10 mL PBS清洗細(xì)胞顆粒，用70 μm細(xì)胞篩再次過濾，1 500 r/min 離心10 min，去除上清。最后將細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h用PBS沖洗3次，以去除碎屑和游離漂浮細(xì)胞后更換培養(yǎng)液。

1.4 傳代培養(yǎng)及分化處理待細(xì)胞增殖到培養(yǎng)皿底面的70%～80% 時，吸出培養(yǎng)液，用PBS清洗2～3次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶，放入37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中消化2～3 min，加2 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中， 1 500 r/min， 離心5 min，棄上清，再次用基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后傳代至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

待細(xì)胞增殖到70%～80%后進(jìn)行不同的分化處理。CON組：10 mg/L胰島素；IC組：10 mg/L胰島素+10 mg/L環(huán)格列酮；IO組：10 mg/L胰島素+100 μmol/L油酸；ICO組：10 mg/L胰島素+10 mg/L 環(huán)格列酮+100 μmol/L 油酸。每個處理重復(fù)3次，置于 37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換1次分化培養(yǎng)液，分化處理96 h后，進(jìn)行后續(xù)試驗。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.5 油紅O染色參照油紅O染色試劑盒(G1262)進(jìn)行，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2～3次后，用細(xì)胞色素固定劑在室溫條件下將其固定30 min，再使用PBS緩沖液沖洗1次，60%異丙醇清洗 20～30 s后，涂上油紅O染色(工作液)，在室溫下密閉染色 10～15 min，再加入60%異丙醇洗去染液，用PBS緩沖液沖洗2～3次，加入Mayer蘇木素染色液復(fù)染核 1～2 min，加 ORO Buffer處理 1 min，鏡檢采集細(xì)胞圖像，觀察脂質(zhì)滴。

1.6 甘油三酯含量的測定使用普利來甘油三酯測定試劑盒進(jìn)行甘油三酯含量的測定。用PBS清洗細(xì)胞2次，2 mL胰蛋白酶消化2～3 min后，加入同等體積的培養(yǎng)液終止消化，移液槍反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，1 500 r/min，離心5 min，棄上清，反復(fù)2次，加入200 μL裂解液充分混勻，室溫條件下靜止10 min，使細(xì)胞中甘油三酯完全釋放于裂解液中，70℃金屬浴中10 min，2 000 r/min離心5 min并吸取上清。將10 μL待測樣品(每個樣品3個重復(fù))和190 μL工作液加入到96孔板中，放置于37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，之后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定吸光值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甘油三酯含量。

標(biāo)準(zhǔn)液濃度：0,200,400,600,800,1 000,1 200 mmol/L，酶標(biāo)儀于570 nm波長下測定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 相關(guān)基因mRNA表達(dá)量檢測用TRIzolTM試劑從細(xì)胞中提取總RNA,通過D260和D260/D280檢查提取總RNA的完整性。用TRIzol法提取各試驗組脂肪細(xì)胞總RNA，cDNA的構(gòu)建參照TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。GAPDH作為內(nèi)參基因,引物序列參照表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

PCR反應(yīng)條件為：95℃條件下預(yù)變性 15 s，95℃變性 5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計分析使用 2-△△Ct計算相對mRNA表達(dá)量,利用Graph Pad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，差異在P<0.05處有統(tǒng)計學(xué)意義，作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 延邊黃牛前脂肪細(xì)胞生長趨勢應(yīng)用MTS比色法每隔24 h測定1次490 nm的吸光值，每次取3個孔分別進(jìn)行測定并繪制延邊黃牛前脂肪細(xì)胞生長曲線圖。由圖1可見，延邊黃牛前脂肪細(xì)胞具備穩(wěn)定的生長特性，培養(yǎng)2～6 d，細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，進(jìn)入指數(shù)生長期，6～10 d細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，進(jìn)入平臺期，之后逐漸退出細(xì)胞增殖周期，因此可用于后續(xù)試驗。

圖1 延邊黃牛前脂肪細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，將消化酶處理后的細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)皿，細(xì)胞縮成小圓球形(圖2A),培養(yǎng)1 d后，有部分呈不規(guī)則三角形的細(xì)胞已經(jīng)貼壁(圖2B)，之后的培養(yǎng)過程中，貼壁細(xì)胞逐步開始伸展變形,最后形成了均一、完整的單室脂肪細(xì)胞，大多數(shù)呈狹長梭形的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)(圖2C)。繼續(xù)培養(yǎng)延邊黃牛前脂肪細(xì)胞，細(xì)胞增殖速度相對減緩，且細(xì)胞增殖到80%以上，準(zhǔn)備開始進(jìn)入分化階段(圖2D)。

A.復(fù)蘇0 h的細(xì)胞懸濁液,含有雜質(zhì)細(xì)胞及肌肉組織碎片;B.培養(yǎng)1 d后細(xì)胞開始貼壁生長,呈長梭型;C.細(xì)胞進(jìn)入快速生長期,大量增殖;D.細(xì)胞增殖到80%

2.2 不同處理對延邊黃牛前脂肪細(xì)胞脂滴形成及甘油三酯含量的影響油紅O染色結(jié)果(圖3)顯示，在分化處理96 h后，與對照組相比，各試驗組均有脂滴形成，IC組只有少量脂滴形成，而IO和ICO組形成的脂滴數(shù)量較多，且脂滴形態(tài)較大，說明胰島素和油酸共同處理可有效促進(jìn)延邊黃牛前脂肪細(xì)胞脂滴的形成。

A.對照組(CON)組；B.IC組；C.IO組；D.ICO組

由圖4可知，與對照組相比，各試驗組均可提高甘油三酯含量，其中IO和ICO組顯著高于對照組和IC組(P<0.05)，且ICO組含量最高。

注：組間標(biāo)注不同小寫字母示差異顯著，P<0.05。下同

2.3 不同處理對延邊黃牛前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響由圖5可知，各試驗組間PPARγ基因的mRNA表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，與對照組相比，IC和ICO試驗組顯著高于對照組(P<0.05)，IO組與對照組間差異不顯著(P>0.05)。IC和ICO組SCD基因mRNA表達(dá)量高于對照組，其中IC組與對照組間差異顯著(P<0.05)，而IO組SCD基因mRNA的表達(dá)量最低。各試驗組間LPL基因mRNA表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05)，與對照組相比，IC和ICO組顯著上調(diào)LPL基因的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，而IO組卻顯著下調(diào)了LPL基因的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。相比于對照組，各試驗組均顯著提高了C/EBPβ基因mRNA表達(dá)量(P<0.05)，其中IO組表達(dá)量最高。胰島素分別與環(huán)格列酮和油酸處理，可明顯增加SREBP1基因的mRNA表達(dá)量，且顯著高于對照組和ICO組(P<0.05)，而相比于對照組，ICO組卻降低了該基因的表達(dá)量，但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 PPARγ、SCD、 LPL、CEBP/β和SREBP1基因mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

目前細(xì)胞增殖的研究方法比較多，MTS比色法是改良的MTT比色法，與 MTT 或 INT 法相比，對細(xì)胞毒性更小，步驟更為簡便[10-11]。所以本試驗延邊黃牛前脂肪細(xì)胞生長曲線的檢測采用MTS比色法，以期反映細(xì)胞生長的基本規(guī)律。研究表明，前脂肪細(xì)胞生長曲線劃分為潛伏期、指數(shù)生長期、平臺期以及退化衰亡期[12]。本試驗檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)2～6 d，細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，進(jìn)入指數(shù)生長期；6～10 d 脂肪細(xì)胞進(jìn)入平臺期，增殖速度明顯減慢。本試驗沒有出現(xiàn)潛伏期和衰亡期，這可能是由于測定時間點較少而導(dǎo)致的。培養(yǎng)8 d后細(xì)胞生長速度并未出現(xiàn)明顯減緩，這可能是由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分依然滿足高密度細(xì)胞的生長，細(xì)胞競爭性生長還未出現(xiàn)，所以細(xì)胞沒有出現(xiàn)凋亡的現(xiàn)象。

細(xì)胞主要是以甘油三酯和膽固醇酯的形式來儲存多余的能量[13]。油紅O為脂溶性染料，可高度溶解于脂肪內(nèi)，使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色。前期試驗研究結(jié)果顯示，環(huán)格列酮和油酸單獨處理均可促進(jìn)脂滴的形成，而環(huán)格列酮和油酸共同處理，脂滴數(shù)量肉眼判斷雖不如環(huán)格列酮組和油酸組多，但脂滴大小卻明顯大于環(huán)格列酮組和油酸組,而胰島素單獨處理卻不能促進(jìn)脂滴的形成[5,20,22]，這與本試驗研究結(jié)果一致。本試驗中，在與前期試驗條件相一致的條件下，胰島素、油酸和環(huán)格列酮三者共處理組無論是脂滴的數(shù)量還是大小均優(yōu)于其他試驗組，這說明胰島素的添加，可提高油酸和環(huán)格列酮共處理本身對脂滴形成的影響效果。本試驗油紅O染色結(jié)果與甘油三酯結(jié)果相一致。

胰島β細(xì)胞分泌的內(nèi)分泌激素——胰島素，在機(jī)體的血糖調(diào)節(jié)、能量代謝及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等多個方面扮演重要角色[14-16]。在脂肪細(xì)胞中，胰島素是調(diào)節(jié)脂肪形成的主要激素，在抑制脂肪分解的同時，可誘導(dǎo)血液中脂肪的生成和對脂肪酸的攝取[3,17]。GUO等[18]研究發(fā)現(xiàn)胰島素可通過與前脂肪細(xì)胞膜表面的 IR 結(jié)合，激活PPARγ2 促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。FARMER等[19]發(fā)現(xiàn)胰島素信號通路在胰島素及cAMP激活劑的誘導(dǎo)刺激下，可促進(jìn)多個成脂轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子SREBP-1c、C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ2 的表達(dá)。金鑫等[20]研究結(jié)果表明,胰島素處理牛的前脂肪細(xì)胞，雖不能促進(jìn)脂滴的形成，但可顯著提高PPARγ基因的表達(dá)量。前期試驗表明，與油酸和環(huán)格列酮單獨處理相比較，兩者共同處理并不會顯著促進(jìn)脂肪生成基因的表達(dá)。而本試驗中，胰島素添加后，胰島素與油酸、環(huán)格列酮共處理對PPARγ基因表達(dá)的促進(jìn)作用卻明顯高于胰島素分別與油酸和環(huán)格列酮共處理對其的影響，這可能是由于胰島素促進(jìn)了油酸和環(huán)格列酮的疊加使用導(dǎo)致的PPARγ信號通路上某些基因的表達(dá)。

游離脂肪酸是甘油三酯的重要組成成分,盡管其在血液中濃度很低,但卻是脂類代謝中最活躍的部分。大量研究結(jié)果表明游離脂肪酸能夠促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞的分化。GARCIA等[21]研究發(fā)現(xiàn)來源于牛飼料的不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素能夠提高PPARγ的表達(dá)，是PPARγ的天然活化劑。金鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)油酸不僅對脂滴的形成有著明顯的促進(jìn)作用,同時還顯著提高了PPARγ和SREBP1基因的表達(dá)量。張軍芳等[23]研究結(jié)果表明，添加油酸和棕櫚油酸等不飽和脂肪酸可增加脂肪合成相關(guān)基因PPARγ、SREBP1、C/EBPα表達(dá),抑制SCD基因表達(dá)。張靖偉等[24]在細(xì)胞分化的過程中，用不同濃度(20，40，60 μmol/L)的油酸分別作用細(xì)胞3 d，應(yīng)用油紅O染色和胞內(nèi)甘油三酯測定法分析發(fā)現(xiàn)油酸可以在體外顯著地促進(jìn)細(xì)胞胞漿中脂質(zhì)的積累，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成脂分化。宋沙等[25]研究發(fā)現(xiàn)油酸能促進(jìn)肉牛前脂肪細(xì)胞的分化或提高脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量,提高牛肉的大理石紋等級和風(fēng)味。以上研究結(jié)果均表明，油酸可促進(jìn)相關(guān)脂肪生成基因的表達(dá)量，從而促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化。而本試驗中，在油酸處理中添加胰島素以后，在抑制SCD基因表達(dá)同時，也抑制了LPL基因的表達(dá)，但是卻提高了PPARγ、SREBP1和C/EBPβ基因mRNA的表達(dá)量，這與前人研究結(jié)果相似，說明胰島素和油酸共處理不會影響油酸本身對前脂肪細(xì)胞分化的影響，有可能還會提高促進(jìn)分化的效果。

PPARγ的特異性配體主要是噻唑烷二酮類化合物，而環(huán)格列酮就屬于噻唑烷二酮類藥物(TZDs)，是PPARγ最主要的激活劑之一，其能夠?qū)PARγ活化，并提高相關(guān)脂肪因子的表達(dá)從而提高肌內(nèi)脂肪沉積水平[26]。飼糧中添加PPARγ激活劑會使豬肌內(nèi)脂肪含量和大理石紋評分等級顯著提高[27]。本試驗前期研究結(jié)果表明環(huán)格列酮單獨處理可提高PPARγ、C/EBPβ和SCD基因的相對表達(dá)量。而在本試驗中，環(huán)格列酮和胰島素共處理，均可顯著提高PPARγ、SCD、C/EBPβ、LPL以及SREBP1的表達(dá)量，這說明胰島素的添加并沒有抑制環(huán)格列酮對PPARγ的激活效果。

綜上所述，我們推測胰島素和PPARγ激動劑油酸和環(huán)格列酮共處理對延邊黃牛前脂肪細(xì)胞分化的促進(jìn)作用要高于各因素單獨處理或兩兩共同處理的效果，這一研究結(jié)果為延邊黃牛脂肪代謝的研究提供一個新視角。但胰島素是如何與環(huán)格列酮和油酸相互作用來調(diào)控脂肪細(xì)胞成脂分化過程的具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。