雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 法鑒別酸棗仁和理?xiàng)椚?/h1>
2021-08-11 02:54:36朱殿龍裴社強(qiáng)鄧自新
農(nóng)產(chǎn)品加工 2021年14期
楊 寶，郭 星，鄭 巍，朱殿龍，裴社強(qiáng)，鄧自新，張 燁，李 靜
（1.太原市食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原 030006；2.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原 030006；3.大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116021；4.山西省食品檢驗(yàn)技術(shù)研究院，山西太原 030012）
0 引言
酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子[1]。在我國主要產(chǎn)地為山西、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、山東。酸棗仁具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津的藥效[2]。酸棗仁無毒副作用，是我國35 種貴重中藥材之一，也是最早進(jìn)入藥食同源品種目錄的中藥材之一[3]。近年來，隨著酸棗仁野生資源的減少，需求量增加，價(jià)格上漲，市場(chǎng)上出現(xiàn)以滇刺棗（Ziziphus mauritiana Lam.）、枳椇子（Hoveni adulcis Thunb.）、兵豆（Lens culinaris Medic.）、紫荊（Cercis chinensis Bge.）的種子摻雜摻偽的現(xiàn)象[4]。其中，理?xiàng)椚逝c酸棗仁性狀極為相似，炒制和染色后更加難以區(qū)分，但價(jià)格僅為酸棗仁1/4，與酸棗仁性狀極為相似，理?xiàng)椚食蔀樗釛椚首畛Ｒ姷膫纹贰Ｆ溆? 個(gè)品種偽品由于性狀上差異較大，極少作為摻偽品種。理?xiàng)椚蕿樵颇鲜≈兴庯嬈瑯?biāo)準(zhǔn)品種，國內(nèi)其他省份沒有明確規(guī)定禁止使用，各省市場(chǎng)均有流通，但無論從傳統(tǒng)功效、化學(xué)成分、藥理作用上2 種中藥材均存在差異[5]，混用誤用都不利于藥效的發(fā)揮。因此，建立更加快速、可靠、操作簡(jiǎn)單的酸棗仁鑒別方法對(duì)于保護(hù)中藥材種植戶權(quán)益、保障酸棗仁藥材的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。
目前，對(duì)于酸棗仁的鑒別研究多采用藥材性狀[6]、顯微特征[7]、薄層色譜[8]、電泳[9-10]、紫外光譜[11-12]、掃描電鏡[13]等傳統(tǒng)鑒別方法。近年來，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)從基因水平對(duì)酸棗仁及其偽品進(jìn)行鑒定，與常規(guī)檢測(cè)方法相比，其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、有效降低污染率、連續(xù)快速、操作簡(jiǎn)單易于掌握等特點(diǎn)，已報(bào)道的有DNA 條形碼[14-16]、普通PCR 檢測(cè)技術(shù)[17]實(shí)時(shí)多重實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)在酸棗仁及其常見偽品理?xiàng)椚收鎮(zhèn)舞b定方面尚無相關(guān)報(bào)道。李桂林等人[17]開發(fā)的PCR 檢測(cè)方法，僅能鑒別出是否是酸棗仁正品，不能在同一反應(yīng)體系同時(shí)鑒別酸棗仁及其偽品理?xiàng)椚?。?shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)便，無需電泳即可自動(dòng)化獲得檢測(cè)結(jié)果，并進(jìn)行快速定性定量分析[18-20]。而多重實(shí)時(shí)熒光PCR 通過檢測(cè)不同的熒光信號(hào)還可以在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速高通量的檢測(cè)[21-23]。
擬采用基于Taqman 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法對(duì)中藥材酸棗仁中摻偽成分進(jìn)行鑒別和檢測(cè)，針對(duì)酸棗仁及其常見摻偽成分理?xiàng)椚?，設(shè)計(jì)不同熒光標(biāo)記特異性探針，建立主成分酸棗仁及常見摻偽成分理?xiàng)椚实碾p重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，形成高靈敏度、高特異性和高通量的酸棗仁及其制品摻偽成分理?xiàng)椚实目焖贆z測(cè)技術(shù)。彌補(bǔ)市場(chǎng)對(duì)于酸棗仁中藥材檢測(cè)技術(shù)的缺口和需求，為市場(chǎng)、生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門提供精準(zhǔn)、快速、高效率、高通量的基因組學(xué)檢測(cè)方法。
1 材料與方法
1.1 材料
共收集酸棗仁樣品14 份，理?xiàng)椚蕵悠?0 份，枳椇子、紫荊子、兵豆各1 份，樣品產(chǎn)地及來源于河北安國、安徽亳州、廣西玉林、大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心、太原市藥店和飲片生產(chǎn)企業(yè)等地，由大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心朱殿龍副主任藥師鑒定。
樣品信息見表1。
表1 樣品信息
1.2 試劑與設(shè)備
香港力康Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī)；Eppendorf 微量核酸分析儀；美國熱電ABI7500fast 熒光定量PCR 儀；BIO-RAD C1000 TOUCH 梯度PCR儀；Power Pac Basic 電泳儀；美國伯樂凝膠成像系統(tǒng)；植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，Cat#305）；上海生工生物公司合成的引物、探針；TaqManTMMultiplex Master Mix（ABI，NO.4461881）。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 樣品DNA 提取
為了避免污染，樣品用75%酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛?、晾干，用球磨儀粉碎成細(xì)粉狀，稱取20 mg置于滅菌的2 mL 離心管中。采用TIANGEN 提取試劑盒提取樣本DNA，用核酸分析儀測(cè)定DNA 的純度及質(zhì)量濃度，將OD260/OD280 在1.7～1.9，且質(zhì)量濃度達(dá)到10～100 ng/μL 的DNA 溶液作為模板DNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 ITS2 引物PCR 擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)序
將樣品DNA 用ITS2 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL（見表2）。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃下保存。進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)，觀察是否能夠產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，將擴(kuò)增成功的樣品進(jìn)行測(cè)序。
反應(yīng)體系配制見表2。
表2 反應(yīng)體系配制
1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增
引物的設(shè)計(jì)：通過檢索NCBI 的數(shù)據(jù)庫和查閱文獻(xiàn)后獲得酸棗仁、理?xiàng)椚始捌渌Ｒ娊次锓N序列結(jié)合1.3.2 測(cè)序結(jié)果，使用NCBI 的Primer-Blast，用Snap gene 軟件比對(duì)，設(shè)計(jì)出能夠用于酸棗仁及其偽品真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針，探針分別使用不同的熒光標(biāo)記，由上海生工生物公司合成。
酸棗仁及理?xiàng)椚收蛞铮?'-GCCGCAGCAA TCGGTGG-3'；
酸棗仁反向引物：5'-TATTTCGGCCAGCCGCGG-3'；
理?xiàng)椚史聪蛞铮?'-CGTTTCGGCCAGCCGCGA-3'；
酸棗仁探針：5'FAM-ACCTCGACCTCGAGGCGAAGAG-3'BHQ1；
理?xiàng)椚侍结槪?'-VIC-AACCTCCGCCTCGGAAGG G-3'BHQ1。
反應(yīng)體系配制見表3。
表3 反應(yīng)體系配制
反應(yīng)條件為：50 ℃2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個(gè)循環(huán)。
1.3.4 特異性試驗(yàn)
將1.3.1 中提取的酸棗仁樣品、理?xiàng)椚蕵悠芳捌渌麡悠返腄NA 作為模板。按照上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，以水作為空白對(duì)照，驗(yàn)證引物和探針對(duì)酸棗仁、理?xiàng)椚蕵悠窋U(kuò)增的特異性。
1.3.5 樣品覆蓋度試驗(yàn)
將14 批酸棗仁DNA、10 批理?xiàng)椚蔇NA 為模板，按照1.3.3 進(jìn)行擴(kuò)增，以水作為空白對(duì)照，進(jìn)行覆蓋度試驗(yàn)。
1.3.6 靈敏度試驗(yàn)
酸棗仁DNA 模板和理?xiàng)椚蔇NA 模板各取50 ng，分別10 倍遞減稀釋，至10-4，每個(gè)梯度做5 個(gè)平行試驗(yàn)，按照1.3.3 中反應(yīng)體系和條件擴(kuò)增，測(cè)試雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的絕對(duì)靈敏度。
1.3.7 混合樣本檢測(cè)
中國藥典2020 年版四部規(guī)定，藥屑及雜質(zhì)通常不得超過3%[24]，在酸棗仁DNA 模板中分別摻入50%，20%，10%，5%，3%，1%的理?xiàng)椚蔇NA 模板，對(duì)上述樣品充分混勻，混合樣品的DNA 質(zhì)量濃度在10～40 ng/μL，每個(gè)樣品做2 個(gè)平行，檢測(cè)樣品是否摻入了偽品理?xiàng)椚?，?yàn)證檢測(cè)方法是否能夠應(yīng)用于樣品摻入偽品的檢測(cè)。
2 結(jié)果與分析
2.1 特異性試驗(yàn)
酸棗仁特異性擴(kuò)增圖譜見圖1。
由圖1 可知，非酸棗仁類樣品無明顯的FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，Ct 值均大于40；酸棗仁樣品有FAM熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值小于35。
圖1 酸棗仁特異性擴(kuò)增圖譜
理?xiàng)椚侍禺愋詳U(kuò)增圖譜見圖2。
由圖2 可知，非理?xiàng)椚暑悩悠窡o明顯的VIC 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，Ct 值均大于40；理?xiàng)椚蕵悠酚蠽IC 熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值小于35。
圖2 理?xiàng)椚侍禺愋詳U(kuò)增圖譜
以酸棗仁及其偽品理?xiàng)椚蕿檠芯繉?duì)象，設(shè)計(jì)和篩選了2 種中藥材特異性引物探針，擴(kuò)增結(jié)果顯示只有對(duì)應(yīng)靶標(biāo)物種產(chǎn)生熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增Ct值在12～14，與非靶標(biāo)物種之間未產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，說明篩選的引物探針特異性較好。
2.2 樣品覆蓋度試驗(yàn)
酸棗仁樣品擴(kuò)增圖譜見圖3，理?xiàng)椚蕵悠窋U(kuò)增圖譜見圖4。
圖3 酸棗仁樣品擴(kuò)增圖譜
由圖3 和圖4 可知，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，14酸棗仁樣品和10 批理?xiàng)椚蕵悠吩?0 個(gè)循環(huán)中均相應(yīng)的熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，酸棗仁樣品擴(kuò)增Ct 值在12～24，理?xiàng)椚蕵悠稢t 值擴(kuò)增Ct 值在10～22 均小于40。雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法可以有效檢測(cè)出相應(yīng)靶標(biāo)物熒光信號(hào)，該方法適用于市場(chǎng)上酸棗仁及其偽品理?xiàng)椚实蔫b別。
圖4 理?xiàng)椚蕵悠窋U(kuò)增圖譜
2.3 絕對(duì)靈敏度試驗(yàn)
酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增圖譜見圖5，酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。
圖5 酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增圖譜
圖6 酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖5 可知，酸棗仁樣品在稀釋度10-4～100時(shí)，Ct 值均＜35，有明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均＜3.5%。以稀釋度量值對(duì)Ct 值作圖。由圖6 可知，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997，線性方程為Y=-3.564X+15.94，線性范圍為5 pg～50 ng，即5～50 ng/反應(yīng)，該方法具有良好的線性相關(guān)度。該方法靈敏度高達(dá)5 pg/反應(yīng)。
理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增圖譜見圖7，理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。
圖7 理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增圖譜
圖8 理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖7 可知，理?xiàng)椚蕵悠吩谙♂尪?0-4～100時(shí)，Ct 值均＜35，有明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均＜3.5%。以稀釋度量值對(duì)Ct 值作圖。由圖8 可知，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.992，線性方程為Y=-3.321X+17.005，線性范圍為5 pg～50 ng，即5～50 ng/反應(yīng)，該方法具有良好的線性相關(guān)度，靈敏度高達(dá)5 pg/反應(yīng)。
2.4 偽品理?xiàng)椚蕦?shí)際檢出限
為了進(jìn)一步分析雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系對(duì)酸棗仁摻入偽品理?xiàng)椚蕶z測(cè)的實(shí)際靈敏度，結(jié)合市售樣品實(shí)際摻偽情況，在酸棗仁DNA 模板中分別摻入50%，20%，10%，5%，3%，1%（W/W）的偽品DNA 模板，雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品中同時(shí)存在酸棗仁和理?xiàng)椚? 種親源關(guān)系相近的物種DNA，混合體系出現(xiàn)了交叉反應(yīng)。由圖9 可知，偽品理?xiàng)椚蕵悠返淖畹蜋z出限可達(dá)3%（W/W），檢測(cè)Ct 值在24 左右，可以滿足藥典規(guī)定雜質(zhì)含量檢測(cè)需求。因此，確定該方法可用于實(shí)際中藥材酸棗仁樣品中理?xiàng)椚蕮絺螜z測(cè)。
理?xiàng)椚蕮絺螜z測(cè)結(jié)果見圖9。
圖9 理?xiàng)椚蕮絺螜z測(cè)結(jié)果
3 討論
近年來，由于酸棗仁中藥材野生資源有限，存在著偽品和混淆品現(xiàn)象，在染色和炒制后，更加不易區(qū)分。傳統(tǒng)鑒別方法往往是通過外觀性狀，如眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等，必要時(shí)借助顯微觀察和薄層鑒別，這種鑒別方式對(duì)檢驗(yàn)人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，而且存在主觀差別，不適用于快速、準(zhǔn)確、廣泛地推廣。理化檢測(cè)方法專屬性不強(qiáng)、操作繁瑣、耗時(shí)長、檢測(cè)分析成本較高。2020 年版中國藥典收錄了PCR-RFLP 方法鑒別川貝母、霍山石斛，PCR方法鑒別烏梢蛇和蘄蛇及金錢白花蛇，也首次制定了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的指導(dǎo)原則，隨著中藥材制假售假的手段不斷提高，分子生物學(xué)檢測(cè)方法必將成為重要的檢測(cè)手段。
ITS 作為真核生物核糖體DNA 的非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，物種間差異較大，遺傳信息較豐富，片段長度適宜，有利于找到特異性的靶標(biāo)片段，所以ITS 分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中。通過試驗(yàn)證實(shí)該方法特異性好、能夠同時(shí)檢測(cè)正偽品成分、靈敏度高，檢測(cè)核酸含量可達(dá)pg 級(jí)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸棗仁與理?xiàng)椚试贗TS2 片段上同源性達(dá)到了94%以上，差異位點(diǎn)少，設(shè)計(jì)引物探針難度大，兩物種上游引物采用兩物種共有引物序列，在探針上游很難找到差異位點(diǎn)，偽品理?xiàng)椚蕦?shí)際檢出限試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩物種混合樣品實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增出現(xiàn)了交叉反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)被抑制，但實(shí)際檢出限仍然能達(dá)到3%，能夠滿足中國藥典摻入雜質(zhì)檢測(cè)要求。
4 結(jié)論
基于ITS 分子標(biāo)記，分別設(shè)計(jì)了特異性鑒別酸棗仁和理?xiàng)椚实囊锖蚑aqMan 探針，在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)酸棗仁和理?xiàng)椚蕵悠肪邢鄳?yīng)的熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，其他物種樣品無熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，利用多重多色實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，一管反應(yīng)同時(shí)鑒別酸棗仁、偽品理?xiàng)椚?，大大提高了檢測(cè)效率和實(shí)用性；經(jīng)實(shí)際市售酸棗仁和理?xiàng)椚蕵悠返臋z測(cè)驗(yàn)證了其可行性和適用性；整個(gè)試驗(yàn)2～3 h，用時(shí)較短、靈敏度較高、整個(gè)過程閉管操作，降低了出現(xiàn)假陽性的概率，同時(shí)也避免了有毒有害物質(zhì)對(duì)環(huán)境和操作員的傷害；試驗(yàn)結(jié)果由儀器判讀，更加準(zhǔn)確，減小了檢驗(yàn)人員判讀時(shí)的主觀誤差。該方法操作簡(jiǎn)單可快速掌握，檢測(cè)結(jié)果與性狀鑒定結(jié)果完全一致，在酸棗仁生產(chǎn)加工質(zhì)量監(jiān)控及監(jiān)管部門監(jiān)管中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
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0 引言
酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子[1]。在我國主要產(chǎn)地為山西、河北、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、山東。酸棗仁具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津的藥效[2]。酸棗仁無毒副作用，是我國35 種貴重中藥材之一，也是最早進(jìn)入藥食同源品種目錄的中藥材之一[3]。近年來，隨著酸棗仁野生資源的減少，需求量增加，價(jià)格上漲，市場(chǎng)上出現(xiàn)以滇刺棗（Ziziphus mauritiana Lam.）、枳椇子（Hoveni adulcis Thunb.）、兵豆（Lens culinaris Medic.）、紫荊（Cercis chinensis Bge.）的種子摻雜摻偽的現(xiàn)象[4]。其中，理?xiàng)椚逝c酸棗仁性狀極為相似，炒制和染色后更加難以區(qū)分，但價(jià)格僅為酸棗仁1/4，與酸棗仁性狀極為相似，理?xiàng)椚食蔀樗釛椚首畛Ｒ姷膫纹贰Ｆ溆? 個(gè)品種偽品由于性狀上差異較大，極少作為摻偽品種。理?xiàng)椚蕿樵颇鲜≈兴庯嬈瑯?biāo)準(zhǔn)品種，國內(nèi)其他省份沒有明確規(guī)定禁止使用，各省市場(chǎng)均有流通，但無論從傳統(tǒng)功效、化學(xué)成分、藥理作用上2 種中藥材均存在差異[5]，混用誤用都不利于藥效的發(fā)揮。因此，建立更加快速、可靠、操作簡(jiǎn)單的酸棗仁鑒別方法對(duì)于保護(hù)中藥材種植戶權(quán)益、保障酸棗仁藥材的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。
目前，對(duì)于酸棗仁的鑒別研究多采用藥材性狀[6]、顯微特征[7]、薄層色譜[8]、電泳[9-10]、紫外光譜[11-12]、掃描電鏡[13]等傳統(tǒng)鑒別方法。近年來，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)從基因水平對(duì)酸棗仁及其偽品進(jìn)行鑒定，與常規(guī)檢測(cè)方法相比，其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、有效降低污染率、連續(xù)快速、操作簡(jiǎn)單易于掌握等特點(diǎn)，已報(bào)道的有DNA 條形碼[14-16]、普通PCR 檢測(cè)技術(shù)[17]實(shí)時(shí)多重實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)在酸棗仁及其常見偽品理?xiàng)椚收鎮(zhèn)舞b定方面尚無相關(guān)報(bào)道。李桂林等人[17]開發(fā)的PCR 檢測(cè)方法，僅能鑒別出是否是酸棗仁正品，不能在同一反應(yīng)體系同時(shí)鑒別酸棗仁及其偽品理?xiàng)椚?。?shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)便，無需電泳即可自動(dòng)化獲得檢測(cè)結(jié)果，并進(jìn)行快速定性定量分析[18-20]。而多重實(shí)時(shí)熒光PCR 通過檢測(cè)不同的熒光信號(hào)還可以在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速高通量的檢測(cè)[21-23]。
擬采用基于Taqman 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法對(duì)中藥材酸棗仁中摻偽成分進(jìn)行鑒別和檢測(cè)，針對(duì)酸棗仁及其常見摻偽成分理?xiàng)椚?，設(shè)計(jì)不同熒光標(biāo)記特異性探針，建立主成分酸棗仁及常見摻偽成分理?xiàng)椚实碾p重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法，形成高靈敏度、高特異性和高通量的酸棗仁及其制品摻偽成分理?xiàng)椚实目焖贆z測(cè)技術(shù)。彌補(bǔ)市場(chǎng)對(duì)于酸棗仁中藥材檢測(cè)技術(shù)的缺口和需求，為市場(chǎng)、生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門提供精準(zhǔn)、快速、高效率、高通量的基因組學(xué)檢測(cè)方法。
1 材料與方法
1.1 材料
共收集酸棗仁樣品14 份，理?xiàng)椚蕵悠?0 份，枳椇子、紫荊子、兵豆各1 份，樣品產(chǎn)地及來源于河北安國、安徽亳州、廣西玉林、大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心、太原市藥店和飲片生產(chǎn)企業(yè)等地，由大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心朱殿龍副主任藥師鑒定。
樣品信息見表1。
表1 樣品信息
1.2 試劑與設(shè)備
香港力康Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī)；Eppendorf 微量核酸分析儀；美國熱電ABI7500fast 熒光定量PCR 儀；BIO-RAD C1000 TOUCH 梯度PCR儀；Power Pac Basic 電泳儀；美國伯樂凝膠成像系統(tǒng)；植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，Cat#305）；上海生工生物公司合成的引物、探針；TaqManTMMultiplex Master Mix（ABI，NO.4461881）。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 樣品DNA 提取
為了避免污染，樣品用75%酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛?、晾干，用球磨儀粉碎成細(xì)粉狀，稱取20 mg置于滅菌的2 mL 離心管中。采用TIANGEN 提取試劑盒提取樣本DNA，用核酸分析儀測(cè)定DNA 的純度及質(zhì)量濃度，將OD260/OD280 在1.7～1.9，且質(zhì)量濃度達(dá)到10～100 ng/μL 的DNA 溶液作為模板DNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 ITS2 引物PCR 擴(kuò)增檢測(cè)測(cè)序
將樣品DNA 用ITS2 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL（見表2）。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃下保存。進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)，觀察是否能夠產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，將擴(kuò)增成功的樣品進(jìn)行測(cè)序。
反應(yīng)體系配制見表2。
表2 反應(yīng)體系配制
1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增
引物的設(shè)計(jì)：通過檢索NCBI 的數(shù)據(jù)庫和查閱文獻(xiàn)后獲得酸棗仁、理?xiàng)椚始捌渌Ｒ娊次锓N序列結(jié)合1.3.2 測(cè)序結(jié)果，使用NCBI 的Primer-Blast，用Snap gene 軟件比對(duì)，設(shè)計(jì)出能夠用于酸棗仁及其偽品真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針，探針分別使用不同的熒光標(biāo)記，由上海生工生物公司合成。
酸棗仁及理?xiàng)椚收蛞铮?'-GCCGCAGCAA TCGGTGG-3'；
酸棗仁反向引物：5'-TATTTCGGCCAGCCGCGG-3'；
理?xiàng)椚史聪蛞铮?'-CGTTTCGGCCAGCCGCGA-3'；
酸棗仁探針：5'FAM-ACCTCGACCTCGAGGCGAAGAG-3'BHQ1；
理?xiàng)椚侍结槪?'-VIC-AACCTCCGCCTCGGAAGG G-3'BHQ1。
反應(yīng)體系配制見表3。
表3 反應(yīng)體系配制
反應(yīng)條件為：50 ℃2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個(gè)循環(huán)。
1.3.4 特異性試驗(yàn)
將1.3.1 中提取的酸棗仁樣品、理?xiàng)椚蕵悠芳捌渌麡悠返腄NA 作為模板。按照上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，以水作為空白對(duì)照，驗(yàn)證引物和探針對(duì)酸棗仁、理?xiàng)椚蕵悠窋U(kuò)增的特異性。
1.3.5 樣品覆蓋度試驗(yàn)
將14 批酸棗仁DNA、10 批理?xiàng)椚蔇NA 為模板，按照1.3.3 進(jìn)行擴(kuò)增，以水作為空白對(duì)照，進(jìn)行覆蓋度試驗(yàn)。
1.3.6 靈敏度試驗(yàn)
酸棗仁DNA 模板和理?xiàng)椚蔇NA 模板各取50 ng，分別10 倍遞減稀釋，至10-4，每個(gè)梯度做5 個(gè)平行試驗(yàn)，按照1.3.3 中反應(yīng)體系和條件擴(kuò)增，測(cè)試雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的絕對(duì)靈敏度。
1.3.7 混合樣本檢測(cè)
中國藥典2020 年版四部規(guī)定，藥屑及雜質(zhì)通常不得超過3%[24]，在酸棗仁DNA 模板中分別摻入50%，20%，10%，5%，3%，1%的理?xiàng)椚蔇NA 模板，對(duì)上述樣品充分混勻，混合樣品的DNA 質(zhì)量濃度在10～40 ng/μL，每個(gè)樣品做2 個(gè)平行，檢測(cè)樣品是否摻入了偽品理?xiàng)椚?，?yàn)證檢測(cè)方法是否能夠應(yīng)用于樣品摻入偽品的檢測(cè)。
2 結(jié)果與分析
2.1 特異性試驗(yàn)
酸棗仁特異性擴(kuò)增圖譜見圖1。
由圖1 可知，非酸棗仁類樣品無明顯的FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，Ct 值均大于40；酸棗仁樣品有FAM熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值小于35。
圖1 酸棗仁特異性擴(kuò)增圖譜
理?xiàng)椚侍禺愋詳U(kuò)增圖譜見圖2。
由圖2 可知，非理?xiàng)椚暑悩悠窡o明顯的VIC 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，Ct 值均大于40；理?xiàng)椚蕵悠酚蠽IC 熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值小于35。
圖2 理?xiàng)椚侍禺愋詳U(kuò)增圖譜
以酸棗仁及其偽品理?xiàng)椚蕿檠芯繉?duì)象，設(shè)計(jì)和篩選了2 種中藥材特異性引物探針，擴(kuò)增結(jié)果顯示只有對(duì)應(yīng)靶標(biāo)物種產(chǎn)生熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增Ct值在12～14，與非靶標(biāo)物種之間未產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，說明篩選的引物探針特異性較好。
2.2 樣品覆蓋度試驗(yàn)
酸棗仁樣品擴(kuò)增圖譜見圖3，理?xiàng)椚蕵悠窋U(kuò)增圖譜見圖4。
圖3 酸棗仁樣品擴(kuò)增圖譜
由圖3 和圖4 可知，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，14酸棗仁樣品和10 批理?xiàng)椚蕵悠吩?0 個(gè)循環(huán)中均相應(yīng)的熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，酸棗仁樣品擴(kuò)增Ct 值在12～24，理?xiàng)椚蕵悠稢t 值擴(kuò)增Ct 值在10～22 均小于40。雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法可以有效檢測(cè)出相應(yīng)靶標(biāo)物熒光信號(hào)，該方法適用于市場(chǎng)上酸棗仁及其偽品理?xiàng)椚实蔫b別。
圖4 理?xiàng)椚蕵悠窋U(kuò)增圖譜
2.3 絕對(duì)靈敏度試驗(yàn)
酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增圖譜見圖5，酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。
圖5 酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增圖譜
圖6 酸棗仁樣品靈敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖5 可知，酸棗仁樣品在稀釋度10-4～100時(shí)，Ct 值均＜35，有明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均＜3.5%。以稀釋度量值對(duì)Ct 值作圖。由圖6 可知，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997，線性方程為Y=-3.564X+15.94，線性范圍為5 pg～50 ng，即5～50 ng/反應(yīng)，該方法具有良好的線性相關(guān)度。該方法靈敏度高達(dá)5 pg/反應(yīng)。
理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增圖譜見圖7，理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。
圖7 理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增圖譜
圖8 理?xiàng)椚蕵悠缝`敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖7 可知，理?xiàng)椚蕵悠吩谙♂尪?0-4～100時(shí)，Ct 值均＜35，有明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均＜3.5%。以稀釋度量值對(duì)Ct 值作圖。由圖8 可知，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.992，線性方程為Y=-3.321X+17.005，線性范圍為5 pg～50 ng，即5～50 ng/反應(yīng)，該方法具有良好的線性相關(guān)度，靈敏度高達(dá)5 pg/反應(yīng)。
2.4 偽品理?xiàng)椚蕦?shí)際檢出限
為了進(jìn)一步分析雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系對(duì)酸棗仁摻入偽品理?xiàng)椚蕶z測(cè)的實(shí)際靈敏度，結(jié)合市售樣品實(shí)際摻偽情況，在酸棗仁DNA 模板中分別摻入50%，20%，10%，5%，3%，1%（W/W）的偽品DNA 模板，雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品中同時(shí)存在酸棗仁和理?xiàng)椚? 種親源關(guān)系相近的物種DNA，混合體系出現(xiàn)了交叉反應(yīng)。由圖9 可知，偽品理?xiàng)椚蕵悠返淖畹蜋z出限可達(dá)3%（W/W），檢測(cè)Ct 值在24 左右，可以滿足藥典規(guī)定雜質(zhì)含量檢測(cè)需求。因此，確定該方法可用于實(shí)際中藥材酸棗仁樣品中理?xiàng)椚蕮絺螜z測(cè)。
理?xiàng)椚蕮絺螜z測(cè)結(jié)果見圖9。
圖9 理?xiàng)椚蕮絺螜z測(cè)結(jié)果
3 討論
近年來，由于酸棗仁中藥材野生資源有限，存在著偽品和混淆品現(xiàn)象，在染色和炒制后，更加不易區(qū)分。傳統(tǒng)鑒別方法往往是通過外觀性狀，如眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等，必要時(shí)借助顯微觀察和薄層鑒別，這種鑒別方式對(duì)檢驗(yàn)人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，而且存在主觀差別，不適用于快速、準(zhǔn)確、廣泛地推廣。理化檢測(cè)方法專屬性不強(qiáng)、操作繁瑣、耗時(shí)長、檢測(cè)分析成本較高。2020 年版中國藥典收錄了PCR-RFLP 方法鑒別川貝母、霍山石斛，PCR方法鑒別烏梢蛇和蘄蛇及金錢白花蛇，也首次制定了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的指導(dǎo)原則，隨著中藥材制假售假的手段不斷提高，分子生物學(xué)檢測(cè)方法必將成為重要的檢測(cè)手段。
ITS 作為真核生物核糖體DNA 的非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，物種間差異較大，遺傳信息較豐富，片段長度適宜，有利于找到特異性的靶標(biāo)片段，所以ITS 分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中。通過試驗(yàn)證實(shí)該方法特異性好、能夠同時(shí)檢測(cè)正偽品成分、靈敏度高，檢測(cè)核酸含量可達(dá)pg 級(jí)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸棗仁與理?xiàng)椚试贗TS2 片段上同源性達(dá)到了94%以上，差異位點(diǎn)少，設(shè)計(jì)引物探針難度大，兩物種上游引物采用兩物種共有引物序列，在探針上游很難找到差異位點(diǎn)，偽品理?xiàng)椚蕦?shí)際檢出限試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩物種混合樣品實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增出現(xiàn)了交叉反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)被抑制，但實(shí)際檢出限仍然能達(dá)到3%，能夠滿足中國藥典摻入雜質(zhì)檢測(cè)要求。
4 結(jié)論
基于ITS 分子標(biāo)記，分別設(shè)計(jì)了特異性鑒別酸棗仁和理?xiàng)椚实囊锖蚑aqMan 探針，在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)酸棗仁和理?xiàng)椚蕵悠肪邢鄳?yīng)的熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，其他物種樣品無熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，利用多重多色實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，一管反應(yīng)同時(shí)鑒別酸棗仁、偽品理?xiàng)椚?，大大提高了檢測(cè)效率和實(shí)用性；經(jīng)實(shí)際市售酸棗仁和理?xiàng)椚蕵悠返臋z測(cè)驗(yàn)證了其可行性和適用性；整個(gè)試驗(yàn)2～3 h，用時(shí)較短、靈敏度較高、整個(gè)過程閉管操作，降低了出現(xiàn)假陽性的概率，同時(shí)也避免了有毒有害物質(zhì)對(duì)環(huán)境和操作員的傷害；試驗(yàn)結(jié)果由儀器判讀，更加準(zhǔn)確，減小了檢驗(yàn)人員判讀時(shí)的主觀誤差。該方法操作簡(jiǎn)單可快速掌握，檢測(cè)結(jié)果與性狀鑒定結(jié)果完全一致，在酸棗仁生產(chǎn)加工質(zhì)量監(jiān)控及監(jiān)管部門監(jiān)管中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
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