四川養(yǎng)豬場(chǎng)常見(jiàn)病毒性病原流行病學(xué)調(diào)查及疾病有效防控能力分析

鄔旭龍 ，林 華 ，肖 璐 ，王 印

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130；2.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川 成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院 動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

中國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)正向?qū)I(yè)化和規(guī)?；缆钒l(fā)展，即由當(dāng)初農(nóng)戶散養(yǎng)為主體的市場(chǎng)格局轉(zhuǎn)變成當(dāng)前的多種養(yǎng)殖規(guī)模并存的格局。在經(jīng)歷了自然淘汰、市場(chǎng)選擇和養(yǎng)殖重整后，尤其是近兩年受環(huán)境治理拆遷、非洲豬瘟疫情和國(guó)家生豬布局優(yōu)化調(diào)整的影響，傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式正加速向規(guī)模化和智能化飼養(yǎng)轉(zhuǎn)變[1]，散養(yǎng)和小規(guī)模養(yǎng)殖不斷退出，數(shù)量減少，大型規(guī)?；i場(chǎng)逐漸成為中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)重要的新生力量，在未來(lái)的發(fā)展中，規(guī)?；妥詣?dòng)化的養(yǎng)豬模式必定成為國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)。盡管我國(guó)養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)型升級(jí)進(jìn)程明顯加快，但微型和小型養(yǎng)豬場(chǎng)在少數(shù)地區(qū)仍然存在，這些豬場(chǎng)大多飼養(yǎng)條件差，養(yǎng)殖水平低，防疫、消毒、隔離等措施不到位，甚至飼喂泔水，因此導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。某些規(guī)?；i場(chǎng)在養(yǎng)殖過(guò)程中，因其飼養(yǎng)管理和疫病防控能力差，同樣存在多種疾病混合感染的情況，使豬場(chǎng)對(duì)疾病的預(yù)防和控制越來(lái)越困難。加之豬場(chǎng)在引種、購(gòu)買(mǎi)和養(yǎng)殖等過(guò)程中，生豬及其產(chǎn)品長(zhǎng)距離調(diào)運(yùn)，增大了各種病原體的傳播及生豬疾病感染和發(fā)病的空間跨度，加劇了各種病原體在豬場(chǎng)間的傳播，嚴(yán)重影響豬群健康水平和生物安全體系，豬場(chǎng)對(duì)疾病的有效防控能力降低，從而進(jìn)一步加大了豬場(chǎng)對(duì)新發(fā)和外來(lái)動(dòng)物疫病感染的可能性[2-5]。由于一些新發(fā)疫病病毒的復(fù)制能力強(qiáng)、突變速率高、并且具有重配和重組的變異方式[6-7]，這些疾病不僅嚴(yán)重威脅我國(guó)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)安全，同時(shí)給人類(lèi)和動(dòng)物的健康以及社會(huì)穩(wěn)定帶來(lái)巨大威脅。

近年來(lái)通過(guò)流行病學(xué)的調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析，我國(guó)豬場(chǎng)疾病流行現(xiàn)狀為：豬病毒性疫病感染增多逐漸成為豬傳染病的主體；傳染性疾病的種類(lèi)變多并有逐年增多的趨勢(shì)；多種病毒性疾病的混合感染越來(lái)越嚴(yán)重；非典型性病例的數(shù)量不斷增多，疾病的臨床癥狀和流行特點(diǎn)相似，給病原確診帶來(lái)了很大的困難。在面臨大量樣品的多種疾病鑒別診斷時(shí)，單病原診斷技術(shù)在未來(lái)的發(fā)展中已經(jīng)很難滿足臨床檢測(cè)的需要，而準(zhǔn)確快速鑒別診斷病原對(duì)于制定治療和用藥方案、控制傳染病的流行具有重要意義。因此，更加高效率、自動(dòng)化、高通量的檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)多種豬病原體，為快速診斷和大批量樣品檢測(cè)提供新平臺(tái)。該研究通過(guò)高通量檢測(cè)方法對(duì)豬場(chǎng)病毒性疾病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，通過(guò)檢測(cè)豬場(chǎng)病原的感染情況，從而反映和分析豬場(chǎng)對(duì)疾病的有效防控能力，可進(jìn)一步為豬場(chǎng)對(duì)新發(fā)或外來(lái)動(dòng)物疫病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、日本乙型腦炎病毒（JEV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）陽(yáng)性毒株來(lái)源于商品化疫苗，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器

梯度PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；QIAxcel Advanced全自動(dòng)核酸毛細(xì)管電泳儀購(gòu)于德國(guó)QIAGEN公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)、-80 ℃超低溫冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)均購(gòu)于Thermo Scientifi c。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR Mastermix、 病毒核酸提取試劑盒、DL2000 DNA Marker，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa；瓊脂糖、GoldView染料，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Multiplex PCR Kit，購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 臨床樣品

采集近年來(lái)四川不同地區(qū)25個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)臨床樣品共計(jì)426份，其中包括6個(gè)微型養(yǎng)豬場(chǎng)臨床樣品61份，8個(gè)中小型養(yǎng)豬場(chǎng)臨床樣品118份，11個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)臨床樣品247份。臨床樣品包括脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟等組織器官，精液、血液和糞便。具體樣品信息見(jiàn)表1。

表1 臨床樣品信息 個(gè)

1.5 病原檢測(cè)方法

利用高通量檢測(cè)方法[8]毛細(xì)管電泳全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)對(duì)不同養(yǎng)豬場(chǎng)采集的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。其中內(nèi)臟組織器官在混合剪樣研磨后提取其核酸進(jìn)行檢測(cè)，以滿足不同病原在各器官中的分布和含量不同的檢測(cè)需要。而精液和血液樣品中可能無(wú)法檢測(cè)到腹瀉病毒，因此需對(duì)同批采集的豬的糞便或肛門(mén)拭子同時(shí)檢測(cè)，從而保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6 豬場(chǎng)疾病有效防控能力分析

對(duì)不同養(yǎng)豬場(chǎng)重要豬病毒性疫病進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，通過(guò)臨床樣品的陽(yáng)性檢出率及混合感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從病原感染角度分析微型養(yǎng)豬場(chǎng)、中小型養(yǎng)豬場(chǎng)和規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)，三種不同規(guī)模豬場(chǎng)對(duì)疾病的有效防控能力，而進(jìn)一步推測(cè)豬場(chǎng)對(duì)新發(fā)和外來(lái)動(dòng)物疫病，例如PRRSV NADC30-like、ASFV（非 洲 豬 瘟病毒）和PCV3（豬圓環(huán)病毒3型）等疫病的防控能力和感染易感性，為不同豬場(chǎng)針對(duì)新發(fā)和外來(lái)動(dòng)物疫病病原監(jiān)測(cè)提供參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豬場(chǎng)病原檢測(cè)結(jié)果

利用高通量檢測(cè)方法對(duì)不同養(yǎng)豬場(chǎng)采集的臨床樣品，進(jìn)行9種豬重要病毒病原PRV、CSFV、FMDV、JEV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和PPV檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果可知（表2），426份臨床樣品中，至少檢測(cè)到一種病原感染的陽(yáng)性樣品數(shù)為234份，陽(yáng)性檢出率為54.93%（234/426），表明四川養(yǎng)豬場(chǎng)感染病毒性病原情況已較為嚴(yán)重。對(duì)3種不同規(guī)模類(lèi)型養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行病原分子流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，微型養(yǎng)豬場(chǎng)的病原陽(yáng)性檢出率最高，達(dá)到80%以上，中小型養(yǎng)豬場(chǎng)病原陽(yáng)性檢出率為58.47%，規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的病原陽(yáng)性檢出率最低，為46.96%。在對(duì)不同樣品檢測(cè)中，組織器官的病原陽(yáng)性檢出率較高，均在70%以上，其次為血液和糞便的混合樣品，而精液的陽(yáng)性檢出率最低。分析原因可能是因?yàn)榻M織樣品和流產(chǎn)胎均采集于已死亡或者發(fā)病的豬群，而其他樣品包括血液和精液均采集于正常飼養(yǎng)的豬，其具有較高的飼養(yǎng)管理水平，因此陽(yáng)性檢出率較低。

表2 不同規(guī)模豬場(chǎng)病原檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同豬場(chǎng)病原感染情況分析

三種類(lèi)型養(yǎng)豬場(chǎng)的病原檢測(cè)結(jié)果顯示（表3），豬場(chǎng)均普遍存在多種病原混合感染的情況，且較為嚴(yán)重，特別是微型養(yǎng)豬場(chǎng)，多重病原混合感染的陽(yáng)性檢出率達(dá)到60%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單一病原的陽(yáng)性檢出率，3種及以上不同病原的感染也較其他兩種豬場(chǎng)更為嚴(yán)重。多病原的混合感染以PCV2、PRRSV、PEDV、PRV最為常見(jiàn)，導(dǎo)致免疫抑制性疾病感染嚴(yán)重，使得豬群抵抗力和免疫力降低，為病原體的侵入和感染提供了條件，因此加大了其他傳染病感染和傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 不同豬場(chǎng)病原感染情況

2.3 豬場(chǎng)疾病有效防控能力分析

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)豬場(chǎng)病原陽(yáng)性檢出率和多病原混合感染情況，綜合分析來(lái)看，無(wú)論是病原的陽(yáng)性檢出率，還是單一病原或多病原的混合感染復(fù)雜程度，都呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場(chǎng)＞中小型養(yǎng)豬場(chǎng)＞規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的趨勢(shì)，表明微型養(yǎng)豬場(chǎng)病原感染情況最為嚴(yán)重，對(duì)疾病的防控效果也最差。中小型養(yǎng)豬場(chǎng)和規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)雖各項(xiàng)陽(yáng)性檢出率有所下降，特別是多重病原混合感染有明顯降低，但病原的陽(yáng)性檢出率仍較高，疾病防控形勢(shì)仍然不容樂(lè)觀，特別是PCV2和PRRSV免疫抑制類(lèi)疫病的檢出率仍非常嚴(yán)重，使得豬場(chǎng)在面對(duì)新發(fā)和外來(lái)動(dòng)物疫病PRRSV NADC30-like和ASFV傳播時(shí)，具有極高的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此推測(cè)豬場(chǎng)對(duì)PRRSV NADC30-like和ASFV等外來(lái)與新發(fā)疫病的感染風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場(chǎng)＞中小型養(yǎng)豬場(chǎng)＞規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的趨勢(shì)。

3 討論

隨著我國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)化程度逐年提高，并呈加速增長(zhǎng)趨勢(shì)，近年來(lái)在政策和行業(yè)發(fā)展要求之下，我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展已經(jīng)進(jìn)入了快速發(fā)展期，特別是在非洲豬瘟疫情和生豬復(fù)養(yǎng)發(fā)展的影響下，更加加速了我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的步伐[9]，生豬生產(chǎn)方式加快轉(zhuǎn)變，養(yǎng)殖綠色化、規(guī)模化優(yōu)勢(shì)明顯，規(guī)模化飼養(yǎng)模式將會(huì)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的散養(yǎng)模式，具有非常好的發(fā)展前景。但在養(yǎng)殖過(guò)程中，仍然存在較多問(wèn)題，許多養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全和飼養(yǎng)管理措施不全，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。因此該研究在進(jìn)行豬場(chǎng)疾病分子流行病學(xué)調(diào)查的過(guò)程中，主要考慮從三種不同飼養(yǎng)管理和規(guī)模類(lèi)型的豬場(chǎng)進(jìn)行臨床樣品的采集，利用建立的高通量檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，能較全面了解四川省豬場(chǎng)疾病感染情況，為病原流行病學(xué)調(diào)查及疾病防控提供參考。

疾病的暴發(fā)和流行不僅對(duì)豬場(chǎng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也是制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要因素。近年來(lái)，豬場(chǎng)傳染病流行主要以病毒性疫病為主，因此該研究主要針對(duì)豬場(chǎng)常見(jiàn)的病毒性疾病進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，利用高效的高通量方法進(jìn)行檢測(cè)，在面臨較大數(shù)量樣品的多項(xiàng)目檢測(cè)過(guò)程中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，從結(jié)果分析可以看出，無(wú)論是病原的總陽(yáng)性檢出率，還是多病原的混合感染情況，都呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場(chǎng)最高、中小型養(yǎng)豬場(chǎng)次之，規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)最低的趨勢(shì)，表明微型養(yǎng)豬場(chǎng)疾病感染情況最為嚴(yán)重，病原的陽(yáng)性檢出率高達(dá)80%，表明微型養(yǎng)豬場(chǎng)在飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理和疫病防控等各方面的現(xiàn)狀，更容易造成疾病的發(fā)生和傳播。在病原感染中，混合感染情況非常嚴(yán)重，并且呈有增無(wú)減的流行趨勢(shì)，不但病原種類(lèi)增多，而且流行具有普遍性，成為豬場(chǎng)疾病感染的主流。病原以PCV2、PRRSV、PEDV的感染最為常見(jiàn)，特別是PCV2和PRRSV的感染，已經(jīng)成為目前豬病中最為多發(fā)的病毒性疾病。

研究根據(jù)對(duì)不同豬場(chǎng)病原檢測(cè)結(jié)果，初步分析了豬場(chǎng)對(duì)疾病的有效防控能力，進(jìn)而反映了在新發(fā)或外來(lái)動(dòng)物疫病發(fā)生和傳播時(shí)，不同豬場(chǎng)的易感染性，推測(cè)其對(duì)新發(fā)和外來(lái)動(dòng)物疫病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，可早期發(fā)現(xiàn)隱患，及時(shí)有針對(duì)性地采取策略和措施，有效提高防控效率和質(zhì)量，遏制疫病流行傳播，保障養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。該分析和推測(cè)是完全基于樣品病原檢出結(jié)果，而其余影響疾病發(fā)生的因素例如豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理水平，免疫效果評(píng)價(jià)，外界環(huán)境變化等，這些防控措施的實(shí)施，最終都在疾病感染或病原陽(yáng)性檢出率的結(jié)果中體現(xiàn)，無(wú)論豬場(chǎng)管理和防控措施做得再好，病原的監(jiān)測(cè)和臨床檢測(cè)結(jié)果最能表明豬場(chǎng)對(duì)疾病的有效防控綜合能力，從而為預(yù)防新發(fā)疫病的感染提供參考。另一方面，病原體是動(dòng)物疫病傳播流行的根本，其他所有因素也是通過(guò)對(duì)生物學(xué)因素的作用而影響動(dòng)物疫病的流行傳播[10]。通過(guò)分析結(jié)果可知，微型養(yǎng)豬場(chǎng)病原陽(yáng)性檢出率最高，且多病原混合感染最為嚴(yán)重，表明微型養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)疾病的防控能力最差，推測(cè)其在新發(fā)或外來(lái)動(dòng)物疫病的防控中面臨嚴(yán)峻形勢(shì)和挑戰(zhàn)。