張雪瑩 朱彤 樊賽軍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室 300192

隨著核技術(shù)的發(fā)展和核能應(yīng)用的增多，核泄漏或核戰(zhàn)爭發(fā)生的可能性增加，一旦事故發(fā)生，人們將受到電離輻射造成的不可逆損傷。核工業(yè)的從業(yè)人員也存在潛在風(fēng)險，若意外暴露于電離輻射下，輕者可導(dǎo)致機體發(fā)生病理變化，重者會損傷其組織和器官[1-2]。核在醫(yī)療中的應(yīng)用越來越多，比如放療是癌癥患者常用的治療方法。其射線產(chǎn)生的不良反應(yīng)包括急性胃腸道反應(yīng)、皮膚反應(yīng)，程度從輕微皮疹、水腫、腹瀉、嘔吐到嚴(yán)重潰瘍、組織器官的壞死、瘺及其他并發(fā)癥的發(fā)生[3]。約85%接受放療的患者會出現(xiàn)中度至重度的不良反應(yīng)，但是臨床上沒有用于評價放射性不良反應(yīng)嚴(yán)重程度及預(yù)后的有效指標(biāo)。早期準(zhǔn)確診斷輻射損傷是目前臨床上急需的。然而，利用穩(wěn)定的染色體畸變進(jìn)行輻射損傷診斷的生物劑量法費時費力，且有許多局限性，不適合對受照個體進(jìn)行快速地判斷和分類[4-5]。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡稱線蟲）是第一個基因組被完全測序的多細(xì)胞生物[6]。目前的研究數(shù)據(jù)表明，38%以上的線蟲蛋白表達(dá)基因與人類同源，60%～80%的人類基因都可在線蟲基因組中找到同源基因，其中包括40%的人類疾病相關(guān)基因[7]。因此，線蟲作為一種模式生物已被廣泛應(yīng)用于人類疾病的研究。線蟲獨特的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)決定了它具有靈敏的嗅覺[8-10]。有研究結(jié)果表明，野生型線蟲對人類腫瘤細(xì)胞的分泌物、腫瘤組織以及腫瘤患者的尿液具有趨向性，但對健康者的尿液沒有趨向性，同時也發(fā)現(xiàn)，線蟲能通過嗅覺神經(jīng)元“感覺”到尿液中的氣味[11-12]。這種趨向性已在乳腺癌、宮頸癌和黑色素瘤等多種類型腫瘤中得到證實[13]。由此可見，通過嗅覺靈敏的線蟲對患者的體液氣味進(jìn)行分析，可以更好地觀察和預(yù)測疾病的發(fā)生發(fā)展[14-18]。

本研究通過全身照射建立小鼠輻射損傷模型，利用線蟲的嗅覺，研究其對照射后小鼠和未照射小鼠的尿液是否表現(xiàn)出不同的趨向性、照射劑量和照射后不同時間的關(guān)系、照射后小鼠的尿液中是否有吸引線蟲的代謝性物質(zhì)等，為臨床輻射損傷的診斷和治療提供新思路，為輻射損傷代謝標(biāo)志物的研究打基礎(chǔ)，以期開發(fā)出一種用于臨床的放射性核素造成不良反應(yīng)的評估體系。

1 材料與方法

1.1 小鼠的飼養(yǎng)

清潔級C57/BL6 品系雄性小鼠168 只，6～7 周齡，體重（20±2）g，購自北京華阜康生物科技有限公司[許可證號：SCXK（京）2020-0004]。均飼養(yǎng)于無特定病原體級動物房，控制室內(nèi)溫度25℃左右，相對濕度（60±5）%，保持12 h/12 h 的明暗循環(huán)，小鼠隨意采食全價鼠飼料及清潔水。

1.2 小鼠的照射和分組

使用加拿大Best Theratronics 公司Gammacell?40 Exactor 照射儀，137Cs γ 射線對小鼠進(jìn)行全身照射，劑量率為0.84 Gy/min。按照區(qū)組隨機法分為對照組和照射組，其中對照組為未照射小鼠，照射組為不同劑量、不同時間點照射后的小鼠。

1.3 小鼠尿液的收集

將小鼠固定，輕柔按壓小鼠腹部，待有尿液流出，用1.5 mL 離心管分別收集每只小鼠的尿液（50～100 μL），放入臺式高速離心機（美國Thermo公司Micro21R 型），12 000 r/min 離心（離心半徑8 cm）10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，立刻加到培養(yǎng)皿上進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 線蟲的培養(yǎng)

線蟲均為N2 品系野生型（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院張成崗研究員饋贈），使用固體NGM 培養(yǎng)基（3 g/L NaCl、2.5 g/L 細(xì)菌蛋白胨、5 mg/L 膽固醇和1.5%瓊脂高溫高壓滅菌后，加入至已過濾除菌的1 mol/L PBS 25 mL、1 mol/L MgSO41 mL 和1 mol/L CaCl21 mL 溶液中）及OP50 大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。涂布適量菌液（約1 mL）至固體NGM 培養(yǎng)基（90 mm 平皿）中后風(fēng)干表面液體，將線蟲挑至培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)箱（RQX-250 型，青島名博環(huán)?？萍加邢薰荆┲械怪门囵B(yǎng)。

1.5 線蟲的同步化

培養(yǎng)線蟲至L4 產(chǎn)卵期，在體視顯微鏡（日本尼康公司SMZ1270 型）下觀察到有大部分線蟲已產(chǎn)卵。用M9 緩沖液（6 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4和5 g/L NaCl）將線蟲清洗下來，收集到1.5 mL 離心管中，2000 r/min 離心（離心半徑8 cm）2 min 后棄上清。加入1 mL 卵回收裂解液（0.5 mol/L NaOH和0.5% NaClO 溶于M9 緩沖液）后劇烈震蕩15～30 s，2000 r/min 離心（離心半徑8 cm）2 min 后棄上清。加入1 mL M9 緩沖液清洗裂解體系，重復(fù)清洗2 次，隨后用100 μL 的M9 緩沖液重懸，加入到無OP50 大腸桿菌的NGM 培養(yǎng)基（35 mm 平皿）上，置于20℃培養(yǎng)箱中孵化24 h。待所有卵在培養(yǎng)基上孵化至L1 幼蟲期后，將幼蟲轉(zhuǎn)移至含OP50大腸桿菌的NGM 培養(yǎng)基（90 mm 平皿）上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至L3 幼蟲期用于后續(xù)實驗。

1.6 線蟲的趨化實驗

將小鼠分為7.5 Gy 照射組和對照組，每組12 只，于照射后24 h 收集每只小鼠尿液。將90 mm平皿NGM 培養(yǎng)基平均劃分為8 個扇形，于每個扇形靠培養(yǎng)皿邊緣畫一個直徑為10 mm 的圓形區(qū)域，將照射組和對照組小鼠的尿液分別間隔滴于同一培養(yǎng)皿的8 個圓形區(qū)域中，含有線蟲約700 條的M9 緩沖液滴至中心區(qū)域，靜置30 min，拍照記錄，而后置于體視顯微鏡下觀察并統(tǒng)計每個圓形區(qū)域中線蟲的數(shù)量，計數(shù)統(tǒng)計3 次，取平均值，然后分別計算不同區(qū)域內(nèi)線蟲的百分?jǐn)?shù)。

1.7 線蟲的爬行實驗

如圖1 所示，使用90 mm 平皿NGM 培養(yǎng)基，在距培養(yǎng)皿中心40 mm 的兩端各劃出以該點為圓心的直徑為10 mm 的圓形區(qū)域，將下述實驗對照組和照射組小鼠的尿液分別滴至兩側(cè)圓形區(qū)域中心，水平放置確保液滴不會外溢或擴(kuò)散，將有約100 條線蟲的M9 緩沖液滴于培養(yǎng)皿中心，靜置30 min，置于體視顯微鏡下觀察并統(tǒng)計每個圓形區(qū)域中線蟲的數(shù)量。計數(shù)統(tǒng)計3 次，取平均值，然后分別計算不同區(qū)域內(nèi)線蟲的百分?jǐn)?shù)。

圖 1 秀麗隱桿線蟲爬行實驗方法的示意圖Figure 1 Schematic diagram of experimental method ofCaenorhabditis elegans crawling

（1）照射后不同時間點的爬行實驗：將小鼠分為7.5 Gy 照射組和對照組，每組12 只，于照射后0、2、4、8、12、24、48、72 h 收集每只小鼠的尿液。

（2）不同劑量照射后的爬行實驗：將小鼠分為2、4、6 Gy 照射組和對照組，每組12 只，于照射后24 h 收集每只小鼠的尿液。

（3）時間與劑量之間的正交實驗：將小鼠分為2、4、6 Gy 照射組和對照組，每組12 只，于照射后4、8、24 h 收集每只小鼠的尿液。

（4）風(fēng)扇實驗和加熱實驗：將小鼠分為7.5 Gy 照射組和對照組，每組12 只，于照射后24 h 收集每只小鼠的尿液。在滴加小鼠的尿液后進(jìn)行風(fēng)扇實驗，即在培養(yǎng)皿一側(cè)打開小風(fēng)扇進(jìn)行吹風(fēng)，使培養(yǎng)皿表面氣體流動，吹風(fēng)30 min 后進(jìn)行爬行實驗。在加熱實驗中，分別取每只小鼠的尿液后稱重，放在干浴鍋中98℃高溫加熱5 min，將小鼠尿液中可揮發(fā)物質(zhì)盡量蒸發(fā)，再次稱重，比較尿液蒸發(fā)前后的重量差異，待30 min 尿液冷卻后進(jìn)行爬行實驗。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，在方差齊的條件下，2 組間的比較采用獨立樣本t檢驗；小鼠尿液加熱前后的比較采用配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線蟲的趨向性

趨化實驗結(jié)果見圖2A，結(jié)果顯示線蟲對照射后小鼠的尿液有明顯趨向性，與對照組相比，照射組區(qū)域內(nèi)聚集了更多的線蟲。0.5 h 后，對照組有約（1.83±0.17）%的線蟲，而照射組線蟲達(dá)（14.17±1.01）%，二者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002，圖2B）。

2.2 照射后不同時間點的爬行實驗

如圖3 所示，7.5 Gy 照射后8 h 時線蟲開始出現(xiàn)聚集，這說明此時小鼠尿液中產(chǎn)生了相關(guān)代謝物，且該代謝物在照射后72 h 并未消失，同樣可吸引線蟲在尿液區(qū)域內(nèi)聚集。與對照組線蟲的百分?jǐn)?shù)相比，照射組在照射后8、12、24、48、72 h 時的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.073、42.947、53.333、67.518、61.250，均P＜0.01）。

圖 2 秀麗隱桿線蟲對7.5 Gy 照射后24 h 小鼠尿液的趨向性 A 圖中左側(cè)為培養(yǎng)皿的圖片（C 為對照組小鼠尿液的區(qū)域；IR 為照射組小鼠尿液的區(qū)域），右側(cè)為體視顯微鏡下秀麗隱桿線蟲的圖片。a 表示與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.105，P=0.002）Figure 2 Tendency of Caenorhabditis elegans to urine of mice 24 h after 7.5 Gy irradiation

圖 3 7.5 Gy 照射后不同時間點小鼠尿液中秀麗隱桿線蟲的百分?jǐn)?shù) a 表示與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.073～67.518，均P＜0.01）Figure 3 Percentage of Caenorhabditis elegans in urine of mice at different time points after 7.5 Gy irradiation

圖 4 不同劑量照射后24 h 小鼠尿液中秀麗隱桿線蟲的百分?jǐn)?shù) A 為秀麗隱桿線蟲的百分?jǐn)?shù)；B 為體視顯微鏡下秀麗隱桿線蟲的圖片。a 表示與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.955、30.320、51.463，均P＜0.001）Figure 4 Percentage of Caenorhabditis elegans in urine of mice at 24 hours after different doses of irradiation

2.3 不同劑量照射后的爬行實驗

如圖4 所示，2 Gy 照射后小鼠的尿液可吸引線蟲聚集，照射組區(qū)域的線蟲百分?jǐn)?shù)為（69.58±7.00）%、對照組為（29.33±5.79）%。同樣，4、6 Gy照射組也有線蟲聚集[照射組線蟲的百分?jǐn)?shù)分別為（84.42±5.55）%和（88.58±3.45）%、對照組分別為（11.58±3.60）%和（9.08±2.19）%]，與對照組相比，經(jīng)不同劑量照射后小鼠的尿液中線蟲的百分?jǐn)?shù)均增加，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。由此可知，線蟲靈敏的嗅覺可識別2 Gy 及以上劑量照射后小鼠的尿液。

2.4 時間與劑量之間的正交實驗

由表1 可知，在2、4、6 Gy 不同劑量照射4 h后，小鼠尿液中無相關(guān)代謝物，其線蟲的百分?jǐn)?shù)與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.152、-1.012、-0.087，均P＞0.05）；在照射后8 h，不同劑量照射組小鼠尿液的線蟲百分?jǐn)?shù)與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。這表明在照射后8 h 時，不論照射劑量多少，該代謝途徑已經(jīng)產(chǎn)生。

2.5 風(fēng)扇實驗和加熱實驗

風(fēng)扇實驗結(jié)果顯示，照射組和對照組的線蟲百分?jǐn)?shù)均增多，但二者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（3.17±1.37）%對（2.38±1.26）%，t=1.250，P＞0.05]，即風(fēng)扇實驗后線蟲不能識別照射后小鼠的尿液而產(chǎn)生聚集。加熱實驗結(jié)果顯示，小鼠尿液加熱前后整體重量差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（1.060±0.028）g 對（1.051±0.026）g，t=-11.814，P＜0.001]，這表示有大量組分揮發(fā)；蒸發(fā)后尿液的線蟲爬行結(jié)果顯示，照射組和對照組的線蟲百分?jǐn)?shù)均增多，但二者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（17.46±11.00）%對（12.70±9.91）%，t=0.585，P＞0.05]，即經(jīng)加熱后的小鼠尿液并不能被線蟲識別出是否經(jīng)過照射。因此，我們認(rèn)為照射后小鼠尿液中能被線蟲特異性識別的物質(zhì)為揮發(fā)性代謝物。

表 1 不同劑量照射后不同時間點小鼠尿液中秀麗隱桿線蟲的百分?jǐn)?shù)（ ±s，%）Table 1 Percentage of Caenorhabditis elegans in urine of mice at different time points after different doses of irradiation( ±s, %)

表 1 不同劑量照射后不同時間點小鼠尿液中秀麗隱桿線蟲的百分?jǐn)?shù)（ ±s，%）Table 1 Percentage of Caenorhabditis elegans in urine of mice at different time points after different doses of irradiation( ±s, %)

注：a 表示與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.628～133.349，均P＜0.001）

組別 4 h 8 h 24 h對照組（n=12） 20.00±2.04 21.00±1.41 20.17±1.75 2 Gy照射組（n=12） 22.25±2.99 63.25±7.55a 83.92±4.27a 4 Gy照射組（n=12） 18.58±3.26 77.33±8.77a 88.50±3.34a 6 Gy照射組（n=12） 19.92±1.97 72.58±6.14a 88.75±1.76a

3 討論

由于核污染等意外照射引起的電離輻射暴露可造成人體多處組織和器官損傷，同時在體內(nèi)誘導(dǎo)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致機體功能障礙[19]，因此，當(dāng)意外發(fā)生時，對受照人群的快速辨別成為臨床上急需解決的問題之一。然而，由于個體差異，臨床上現(xiàn)有的診斷方法僅能從表觀癥狀對暴露于電離輻射的人群進(jìn)行區(qū)分，經(jīng)常導(dǎo)致進(jìn)一步的臨床指導(dǎo)和治療出現(xiàn)拖延。因此，我們需要一種可用于快速評估個人輻射劑量的生物標(biāo)志物，已有研究者利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定量分析輻射誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)，篩選出了一些特異度高、靈敏度好的輻射標(biāo)志物[20-21]，但這些方法所用到的組織樣本需要活檢，并不適用于大規(guī)模的輻射暴露。目前已知與腫瘤預(yù)后相關(guān)的揮發(fā)性化合物存在于尿液中[22-23]，且國外已有研究者嘗試使用嗅覺靈敏的生物，如豬、狗、線蟲等，以及電子氣味識別系統(tǒng)對患者的體液氣味進(jìn)行分辨，以此獲得更好的疾病預(yù)測和臨床指導(dǎo)[23-25]，但是關(guān)于輻射劑量生物標(biāo)志物的研究仍以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為主，尚未有關(guān)于尿液揮發(fā)性代謝物和輻照暴露的報道。故人群意外暴露于電離輻射后，識別尿液中的揮發(fā)性代謝物有待成為早期評估個人輻射劑量和輻射損傷程度的方法之一，此法快速、樣本采集方便且無創(chuàng)，可更好地幫助輻照后區(qū)域劑量重建、評估患者預(yù)后情況、指導(dǎo)早期用藥和手術(shù)，從而制定最佳的治療策略。

在本研究中，尿液均經(jīng)離心后使用，前期發(fā)現(xiàn)線蟲對不離心的尿液同樣具有趨向性，因此尿液中的沉淀物質(zhì)對線蟲趨向性無影響，但為了便于實驗統(tǒng)一，本研究一律采用離心法。在照射后不同時間點的爬行實驗中，對于受照射后小鼠尿液產(chǎn)生代謝物的時間，我們展開了以時間為軸的取樣方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠受照8 h 后，線蟲可通過其尿液識別受照個體。由于線蟲對未照射小鼠尿液并無排斥性，因此，對照組小鼠尿液中線蟲百分?jǐn)?shù)在8 h 后明顯低于8 h 前，這是由于線蟲在未照射小鼠尿液中屬于隨機分散分布，并無規(guī)律，同樣在其他結(jié)果中也出現(xiàn)此情況，并未明顯聚集。在劑量與時間的關(guān)系實驗中，我們發(fā)現(xiàn)照射劑量在2 Gy 時，照射組小鼠尿液仍吸引線蟲聚集，且不論劑量高低，均在8 h時出現(xiàn)差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義；而低于2 Gy 劑量照射時，小鼠尿液中揮發(fā)性代謝物是否依然可以吸引線蟲，有待進(jìn)一步驗證。風(fēng)扇實驗結(jié)果顯示，線蟲是通過氣味辨別照射后小鼠尿液的。加熱實驗中，照射組與對照組無明顯差異，這表明加熱后照射組小鼠的尿液中不再具有特異性代謝物，因而判斷小鼠尿液中吸引線蟲的代謝物為揮發(fā)性物質(zhì)?？紤]到進(jìn)一步臨床應(yīng)用將脫離線蟲模式，未來我們的工作中將不再使用線蟲進(jìn)行更低劑量的檢測，而是使用氣相色譜-質(zhì)譜分析直接對該氣質(zhì)代謝物進(jìn)行鑒定和定量。已有研究對血吸蟲感染的小鼠尿液進(jìn)行氣質(zhì)代謝物分析，其中馬尿酸鹽被指出與感染有關(guān)[26]。在未來的工作中，我們也將對照射后小鼠的尿液進(jìn)行氣質(zhì)代謝物分析，由于物種差異，當(dāng)憑借該代謝物進(jìn)行臨床早期診斷時，人類受到射線照射后該代謝物在尿液中的出現(xiàn)時間有待更多考證。

在本研究中，小鼠輻射損傷模型是通過2、4、6 Gy 或7.5 Gy 全身照射建成的，因此不同劑量照射對小鼠身體造成的損傷有所不同。其中2 Gy 或4 Gy 照射可能造成小鼠造血系統(tǒng)的損傷，而7.5 Gy則可能造成小鼠全身不同器官不同程度的損傷。其中包括腎臟，腎臟的損傷對尿液質(zhì)量及成分有所影響，因此，本實驗結(jié)果不排除腎臟損傷造成對小鼠尿液質(zhì)量的影響。基于以上原因，對尿液中氣質(zhì)標(biāo)志物的篩選至關(guān)重要。在未來工作中，可采用不同動物模型，使用氣相色譜-質(zhì)譜分析代謝組學(xué)方法從尿液中篩選表達(dá)代謝產(chǎn)物，并分析生物標(biāo)志物與輻射劑量的關(guān)系，為探索一種新的方便可行的診斷方法提供依據(jù)。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明張雪瑩負(fù)責(zé)實驗的實施、數(shù)據(jù)的處理、論文的撰寫；朱彤負(fù)責(zé)實驗思路的提供與設(shè)計、論文的修訂；樊賽軍負(fù)責(zé)實驗思路的提供與設(shè)計。