脂質(zhì)特異基質(zhì)分散萃取超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉制品中4種獸藥殘留

胡雪郢，薛豐

（重慶市渝中區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 400010）

β-受體激動(dòng)劑（俗稱為瘦肉精），曾被用作牛、羊等畜禽的飼料添加劑，其能夠促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積、加快脂肪分解，顯著提高脂肪性動(dòng)物的高飼料轉(zhuǎn)化率（廋肉率）［1］，但是科學(xué)知識(shí)缺乏和經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，導(dǎo)致不規(guī)范、不合理使用瘦肉精的現(xiàn)象普遍存在。藥物濫用會(huì)導(dǎo)致藥物在動(dòng)物體內(nèi)滯留和蓄積，并以殘留的方式進(jìn)入人體以及生態(tài)壞境中。誤食含瘦肉精的肉類后，會(huì)出現(xiàn)頭暈、惡心、手腳顫抖、心跳加速甚至心臟驟停，甚致昏迷死亡，對(duì)心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病和甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)等患者有極大危害［2］。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國(guó)際化，食品安全已經(jīng)成為一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題，而動(dòng)物源食品違禁藥物殘留成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)［3–4］。為確保食品安全，我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的193號(hào)公告中明確規(guī)定了動(dòng)物性食品中不得檢出β-受體激動(dòng)劑類藥物。

目前，β-受體激動(dòng)劑殘留的檢測(cè)方法主要有發(fā)光法［5–7］，氣相色譜法［8–10］和質(zhì)譜法［11–22］。發(fā)光法屬于快檢方法，其操作簡(jiǎn)單，成本低，但特異性差，靈敏度較低，目前只作為應(yīng)急快檢手段和初篩方法；氣相色譜法測(cè)定需要進(jìn)行樣品衍生化處理，操作煩瑣、結(jié)果重現(xiàn)性、可靠性較差，且靈敏度較低，僅能依靠保留時(shí)間來進(jìn)行定性和定量分析等；質(zhì)譜法通過測(cè)定質(zhì)核比對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析，其特異性和靈敏度較好，氣相色譜–質(zhì)譜法［11–12］應(yīng)用于瘦肉精殘留的測(cè)定，與單純氣相色譜法相比，其特異性有所提高，但仍需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)。液相色譜–質(zhì)譜法（LC–MS／MS）［13–21］因其靈敏度高、分離性好且操作簡(jiǎn)便、無需衍生化反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，成為獸藥殘留檢測(cè)的首選方法。

肉類食品中獸藥殘留的檢測(cè)主要面臨兩方面的挑戰(zhàn)：（1）獸藥原型進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)發(fā)生代謝反應(yīng)，生成一系列的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致原藥檢測(cè)結(jié)果的假陰性；（2）動(dòng)物組織以及內(nèi)臟中含有大量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，它們性質(zhì)、含量各異，尤其是大量飽和與非飽和脂肪酸的存在，使得樣品基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)；即便通過內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線［13，21］或者基質(zhì)曲線來減輕基質(zhì)效應(yīng)，也會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性產(chǎn)生較大影響，甚至導(dǎo)致方法檢出限無法達(dá)到限量值要求。

因此，建立高效、快捷的肉類樣品中復(fù)雜脂質(zhì)去除前處理方法，是肉類樣品檢測(cè)函待解決的問題。目前，肉類食品中瘦肉精殘留檢測(cè)的前處理方法主要包括：固相萃?。⊿PE）法［9–10，14–18］和傳統(tǒng)基質(zhì)分散固相萃?。≦uEChERS）［19–21］法，后者操作簡(jiǎn)單、快捷，通用性強(qiáng)，已應(yīng)用于蔬菜、水果、水產(chǎn)品等樣品中農(nóng)殘和獸殘的測(cè)定，但是對(duì)于肉類基質(zhì)而言，其脂類凈化能力有限，不僅無法有效降低基質(zhì)效應(yīng)，且在大量樣本分析過程中，脂質(zhì)還會(huì)導(dǎo)致色譜和質(zhì)譜系統(tǒng)發(fā)生污染和堵塞，因此，使用新型脂質(zhì)特異性吸附材料（如免疫親和萃取法），成為解決此類問題有效途徑之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道，將脂質(zhì)特異性吸附材料用于水產(chǎn)品、烘焙食品中抗生素［22］、抗氧化劑［23］、真菌毒素［24］以及牛肉中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)［25］，尚未發(fā)現(xiàn)在高脂肪含量的豬肉和豬肝樣品中β-受體激動(dòng)劑殘留的檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。筆者采用脂質(zhì)特異性吸附EMR–Lipid QuEChER法，結(jié)合超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC–MS／MS），建立肉類食品中4類β-受體激動(dòng)劑殘留的檢查方法，并與已有混合陽(yáng)離子交換（MCX）固相萃取法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果證明，脂質(zhì)特異性EMR–Lipid QuEChER方法能夠更為有效的去除肉類樣品中的脂質(zhì)成分，降低基質(zhì)效應(yīng)，重復(fù)性好，能夠滿足日常檢測(cè)工作需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：Dionex UltiMate 3000／AB Sciex 3200 Qtrap型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

全自動(dòng)固相萃取儀：GX–274型，美國(guó)吉爾森公司。

恒溫震蕩培養(yǎng)箱：ZWY–100H型，上海智城分析儀器制造有限公司。

高速冷凍離心機(jī)：AvantiJ–26XP型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

電子天平：BL310型，感量值為0.01 g，德國(guó)賽多利斯公司。

電子天平：XSR204／AC型，感量值為0.1 mg，梅特勒–托利多國(guó)際有限公司。

氮吹儀：N–EVAP型，美國(guó)Organomation公司。

渦旋混勻儀：VORTEX 3型，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

增強(qiáng)型脂質(zhì)去除分散SPE管：Bond Elut EMR–Lipid型，美國(guó)安捷倫科技公司。

β-葡萄糖醛酸苷肽酶／芳基磺酸脂酶：純度為99%，德國(guó)默克公司。

尼龍濾膜：0.22 μm，德國(guó)默克公司。

甲醇、甲酸：質(zhì)譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

乙酸–乙酸鈉緩沖溶液：優(yōu)級(jí)純，0.2 mol／L，pH 5.2，美國(guó)希格瑪公司。

氨水：優(yōu)級(jí)純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，電阻率大于18 MΩ·cm，由Mili–Q超純水系統(tǒng)純化制得。

4種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品以及對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品基本信息見表1。

表1 4種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品以及對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品

1.2 溶液配制

一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取4種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋定容，得到一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4種β-受體激動(dòng)劑的質(zhì)量濃度均為1.0 μg／mL。

二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，用50%甲醇稀釋至1 mL，得到二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4種β-受體激動(dòng)劑的質(zhì)量濃度均為100 ng／mL。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：分別用1 mL 50%甲醇溶解1.00 mg D6-萊克多巴胺、1.00 mg D3-沙丁胺醇和1.00 mg D9-特布他林，得到質(zhì)量濃度均為1.00 mg／mL的D6-萊克多巴胺、D3-沙丁胺醇、D9-特布他林的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用2.13 mL 50%甲醇溶解2.40 mg D9-鹽酸克倫特羅，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg／mL的D9-鹽酸克倫特羅內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。其中，D9-鹽酸克倫特羅的質(zhì)量濃度以D9-克倫特羅計(jì)，換算系數(shù)為88.8%。

混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液：分別取4種同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液各10 μL于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋定容，得到4種同位素內(nèi)標(biāo)混合應(yīng)用液，質(zhì)量濃度為1.0 μg／mL。

內(nèi)標(biāo)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、50 μL，以及一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、30、50 μL，分別加入30 μL內(nèi)標(biāo)混合應(yīng)用液，再用超純水稀釋至1 mL，混勻。4種化合物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度依次為：0.5、1.0、2.0、5.0、10、30、50 ng／mL；4種內(nèi)標(biāo)化合物的濃度均為30.0 ng／mL。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Welch Xtimate C18型柱［100 mm×2.1 mm，3 μm，月旭科技（上海）股份有限公司］；柱溫：40 ℃；流量：300 μL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸，B相為甲醇，梯度洗脫程序列于表2。

表2 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI+；噴霧電壓：5 000 V；離子源溫度：500 ℃；霧化氣(Gas l)流量：50 mL／min；輔助加熱氣(Gas 2)流量：50 mL／min；氣簾氣流量：25 mL／min；碰撞氣流量：6 mL／min；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

稱取5 g（精確到0.01 g）粉粹的樣品于50 mL離心管中，加入30 μL 1.0μg／mL的混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液，再加入15 mL 0.2 mol／L pH 5.2乙酸–乙酸鈉緩沖溶液，均質(zhì)器勻漿后，再加入100 μLβ-葡萄糖醛酸苷肽酶／芳基磺酸脂酶，于（37±1）℃震蕩酶解過夜，然后于4 ℃以12 000 r／min離心10 min，取上清液待凈化。

1.4.2 樣品凈化

（1）混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換反相吸附（MCX）固相萃取法。取Oasis MCX型固相萃取小柱［(150 mg)／3 mL，美國(guó)沃特世公司］，經(jīng)40 mmol／L HCl水溶液活化后，取上清液全部上樣，分別用5 mL水和甲醇淋洗，再用6 mL 5%氨水–甲醇分3次洗脫，每次2 mL。合并洗脫液，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊螅眉状绩C0.1%甲酸（5∶95）定容至1.0 mL，用0.22 μm濾膜過濾，采用UPLC–MS／MS法測(cè)定。

（2）增強(qiáng)型脂質(zhì)去除(EMR–Lipid QuEChERS)法。移取上清液至EMR–Lipid d-SPE管中，然后加入等體積的甲醇，立即渦旋混合使樣品分散，渦旋60 s后以5 000 r／min離心3 min，移取5 mL上清液至含有2 g 鹽(氯化鈉與硫酸鎂質(zhì)量比為1∶4)的15 mL EMR–Lipid Polish管中，漩渦混合1 min后，以5 000 r／min離心3 min ，上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊螅眉状绩C0.1%甲酸（5∶95）定容至1.0 mL，用0.22 μm濾膜過濾，采用UPLC–MS／MS法測(cè)定。4種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1，其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2。

圖1 4種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖2 4種β-受體激動(dòng)劑同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 4種β-受體激動(dòng)劑動(dòng)物體內(nèi)的存在形式研究

藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)之后排出體外，反應(yīng)中將生成一系列的代謝產(chǎn)物，由于藥物理化性質(zhì)的差異以及作用位點(diǎn)不同，其代謝場(chǎng)所各異，其中參與藥物代謝比較活躍的組織器官包括腸道、肝臟、腎臟以及肌肉組織。本研究通過體外培養(yǎng)模擬肝臟和肌肉組織中4種β-受體激動(dòng)劑的代謝反應(yīng)，研究4種化合物在上述動(dòng)物組織中的存在形式。

稱取5.0 g新鮮豬肉和豬肝各兩份，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組含豬肉和豬肝樣品各1份；均加入1 mL 50 ng／mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)過程中不加入β-葡萄糖醛酸苷肽酶／芳基磺酸脂酶，對(duì)照組則完全按照1.4.1標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，培養(yǎng)完成后所有樣品按照1.4.2（1）方法進(jìn)行樣品凈化后測(cè)定。結(jié)果表明，4種化合物在豬的肌肉和肝臟中幾乎都以化合物原型存在。

2.2 離子對(duì)選擇和質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

將一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液等體積混合，通過針泵直接進(jìn)樣方式，對(duì)每種化合物的母離子和子離子進(jìn)行選擇，同時(shí)分別優(yōu)化其質(zhì)譜采集參數(shù)：碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）、入口電壓（EP）和碰撞池出口電壓（CXP），優(yōu)化結(jié)果列于表3。

表3 4種β-受體激動(dòng)劑及其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)監(jiān)測(cè)離子、質(zhì)譜參數(shù)

2.3 前處理方法比較

動(dòng)物組織樣品進(jìn)行分析時(shí)，大量脂質(zhì)的存在是干擾分析結(jié)果準(zhǔn)確性的主要原因。動(dòng)物所含脂質(zhì)的分子量較大（含碳原子數(shù)≥6），且多為直鏈結(jié)構(gòu)，支鏈較少，EMR–Lipid QuEChERS中的脂質(zhì)特異性吸附填料通過其自身特殊的多孔構(gòu)象，能夠?qū)﹂L(zhǎng)直鏈脂肪進(jìn)行基于空間位阻理論的特異性吸附。本研究以1.4.2中混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換反相吸附（MCX）固相萃取法為參照，與EMR–Lipid QuEChERS法進(jìn)行比較，通過相同基質(zhì)（肌肉組織和肝臟）提取液進(jìn)行凈化處理，對(duì)樣液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS1）100～850m／z質(zhì)量范圍內(nèi)全掃描分析。結(jié)果表明，選擇C18填料的色譜柱、0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相的色譜分離體系中，脂質(zhì)的保留能力較強(qiáng)，其色譜流出時(shí)間位于流動(dòng)相中有機(jī)相比例較高的時(shí)間段（5～7 min），在此時(shí)間段內(nèi)，經(jīng)MCX處理的樣液中有明顯雜質(zhì)色譜峰出現(xiàn)。與MCX法相比，EMR–Lipid QuEChERS法對(duì)豬肉以及豬肝中脂質(zhì)去除效果更好。

2.4 線性方程與檢出限

為了盡量減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，以4種β-受體激動(dòng)劑類藥物的色譜峰面積（x）為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)信噪比S／N=3計(jì)算方法的檢出限。各化合物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表4。結(jié)果表明，4種化合物的質(zhì)量濃度在0.5～50 ng／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.997，檢出限均為0.1 μg／kg。

表4 4種β-受體激動(dòng)劑類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.5 精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)

取經(jīng)過檢測(cè)的空白新鮮豬肉和豬肝樣品，選取2.0、5.0、10.0 ng／kg 3個(gè)加標(biāo)水平，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，按照1.4.2（2）中優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果列于表5和表6。由表5和表6可知，4種β-受體激動(dòng)劑在豬肉基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為79.8%～92.3%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%～9.50%；在豬肝中的加標(biāo)回收率為81.5%～95.6%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.47%～8.05%。表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，滿足日常檢測(cè)需求。

表5 4種β-受體激動(dòng)劑類在豬肉樣品中加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表6 4種β-受體激動(dòng)劑類在豬肝樣品中加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

將本研究所建立的脂質(zhì)特異性基質(zhì)分散（EMR–Lipid QuEChERS）凈化結(jié)合超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)市售的34個(gè)肉類樣品（包括豬肉、豬肝、雞肉、牛肉、魚肉5個(gè)大類）進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)未檢出克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林的違法添加。

3 結(jié)語(yǔ)

脂質(zhì)特異性基質(zhì)分散（EMR–Lipid QuEChERS）凈化法用于肉類樣本中脂質(zhì)的去處，采用類似QuEChERS標(biāo)準(zhǔn)樣品前處理流程，相比傳統(tǒng)固相萃取法，操作更加簡(jiǎn)便、靈活和快捷，且脂質(zhì)去處效果也更好，結(jié)合超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法的高特異性和靈敏度，能夠滿足日常工作中獸藥殘留的檢測(cè)工作。由于EMR–Lipid QuEChERS能夠特異性得吸附脂質(zhì)（尤其是含6個(gè)C以上的長(zhǎng)鏈脂肪），而非對(duì)待測(cè)物進(jìn)行吸附和富集，因此，此法也可應(yīng)用于其他高油脂樣品中脂質(zhì)的去除，從而降低機(jī)制效應(yīng)的干擾，提高目標(biāo)化合的檢出限以及定量準(zhǔn)確性。