趙 敏，岳潔麗，周賢思，梁 赟

(1.四川省眉山生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，四川 眉山 620010；2. 成都先導(dǎo)藥物開(kāi)發(fā)股份有限公司，成都 610200)

引 言

土壤對(duì)生物圈的發(fā)展具有無(wú)可替代的地位[1]。在土壤中，重金屬污染累積到一定程度就會(huì)對(duì)“土壤-植物”系統(tǒng)產(chǎn)生難以想象的毒害[2～4]，并間接危及人類(lèi)健康[5]。利用超富集植物修復(fù)土壤重金屬污染具有無(wú)可比擬的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、環(huán)境效益優(yōu)勢(shì)，作為一種新興高效的生物修復(fù)技術(shù)，也是當(dāng)今的一大研究熱點(diǎn)[6～12]。

鎘、鉛是較為常見(jiàn)的兩種典型土壤重金屬污染物[13]，主要源于其在自然界中的廣泛分布。他們通過(guò)物質(zhì)循環(huán)，能影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)[14]，也能引起人體血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)病變[15]。目前對(duì)重金屬污染土壤的植物修復(fù)研究大多只針對(duì)單個(gè)元素污染，而對(duì)兩種及以上復(fù)合污染的研究還不夠細(xì)致深入，且目前僅僅發(fā)現(xiàn)了很少一部分超富集植物[16～19]。鎘、鉛污染對(duì)生物圈的毒害機(jī)制十分復(fù)雜[20]，對(duì)不同研究對(duì)象得到的研究結(jié)果也是五花八門(mén)。尤其對(duì)植物在鎘、鉛脅迫下的抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)特征研究不夠全面[21～23]，設(shè)置的重金屬濃度組合有限，探討的內(nèi)容單一缺乏系統(tǒng)性。

魚(yú)腥草生存能力強(qiáng)，在我國(guó)分布范圍廣，儲(chǔ)量大，可作為食材，亦可入藥[24]。已有許多研究課題表明魚(yú)腥草對(duì)土壤中的鎘和鉛具有較強(qiáng)的吸附能力，但對(duì)其在吸附時(shí)所產(chǎn)生的生理生化特性變化研究尚不夠深入具體。開(kāi)展鎘鉛脅迫下魚(yú)腥草的生理生化特性變化研究，特別是對(duì)其抗氧化酶系統(tǒng)的影響，對(duì)于探討植物對(duì)重金屬的富集機(jī)理、尋找超富集植物品種的意義重大。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源及前處理、土培實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見(jiàn)趙敏[25]的研究。

植物和土壤：以魚(yú)腥草地下莖為種植基材，進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。植物和土壤均取自雅安三九中藥材科技產(chǎn)業(yè)化有限公司的種植基地。供培土壤為水稻土，經(jīng)除雜質(zhì)、風(fēng)干、碾碎并過(guò)篩(2目)后混勻方能使用。

采用二因素完全設(shè)計(jì)，Cd、Pb分別設(shè)5個(gè)水平、4個(gè)水平，共20種處理(詳見(jiàn)表1中處理編碼)，各處理水平均重復(fù)3次。盆栽試驗(yàn)培養(yǎng)基地設(shè)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)的教學(xué)科研園區(qū)大棚內(nèi)。

以Cd(CH3COO)2·2H2O和Pb(CH3COO)2·3H2O 供給土壤Cd和Pb。稱(chēng)取土樣18kg，加入無(wú)機(jī)肥(按N∶P2O5∶K2O比值為1∶ 0.42∶ 2.37，其中N以200mg/kg計(jì))作為基肥，再按照表1濃度設(shè)置在相應(yīng)組中加入Cd、Pb混勻，轉(zhuǎn)入塑料盆中(盆直徑36cm，盆高40cm)，每盆盛土6kg，重復(fù)3次。進(jìn)行土壤預(yù)處理，加水至田間持水量的60%～70%，自然風(fēng)干，再加水風(fēng)干，鈍化30d后再行土培試驗(yàn)。將魚(yú)腥草地下莖種入處理后的土壤中(每盆6根)，并放入大棚內(nèi)進(jìn)行盆栽，定期澆水和除雜草。

待魚(yú)腥草植株成熟后，取葉片按照相關(guān)方法[26]分析超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性、過(guò)氧化氫酶活性。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及制圖主要采用Microsoft Excel 2007、SPSS Statistics 19以及OriginPro 2017等軟件。

表1 土培實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experiment design of soil cultivation (mg/kg)

2 結(jié)果與討論

抗氧化酶主要包括POD、CAT和SOD，當(dāng)植物受到重金屬脅迫時(shí)，抗氧化酶活性會(huì)顯著提高[27]。SOD、POD和CAT等酶系統(tǒng)的作用是清除動(dòng)植物體內(nèi)的活性氧和抗氧化物質(zhì)[28]。機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧自由基對(duì)生物體的毒害作用很強(qiáng)。正常情況下植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除過(guò)程是相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡的。如果植物處于逆境(例如重金屬脅迫、干旱)條件下，其體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基的速度就可能會(huì)超出其清除自由基的能力，由此導(dǎo)致傷害。因此，常用SOD、CAT、POD的活性來(lái)衡量植物對(duì)毒物的敏感性，從分子水平上去顯示逆境因子對(duì)生物帶來(lái)的傷害[29-30]。鎘鉛脅迫對(duì)魚(yú)腥草葉片中的POD、CAT、SOD的影響差異顯著性對(duì)比見(jiàn)圖1。觀察圖1，CAT、SOD、POD三指標(biāo)各自的處理組之間凡有一個(gè)相同小寫(xiě)字母的，為差異不顯著(0.05水平)；凡無(wú)相同字母的，為差異顯著。因此，CAT中凡是含有f或(和)g、SOD中含有b或(和)c、POD中含有a或(和)b字母標(biāo)識(shí)的處理組與空白對(duì)照組差異不顯著。

注：①圖中不同小寫(xiě)字母表示P<0.05水平下差異顯著；②圖中過(guò)氧化氫酶活性、過(guò)氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性單位依次為mgH2O2/g.minFW、OD470/g. minFW、U/g.FW。圖1 鎘、鉛單一及交互作用對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶系統(tǒng)的影響差異顯著性對(duì)比Fig.1 Comparision of the effects of Cd and Pb on the Antioxidant enzyme system of Houttuyniae Herba

2.1 鎘、鉛脅迫對(duì)魚(yú)腥草CAT活性的影響

觀察圖2(d)，鉛單一污染時(shí)，隨鉛濃度的增加，CAT呈“V”字形變化。當(dāng)加入鉛濃度為250～500mg/kg時(shí)，CAT活性明顯受抑制，而當(dāng)鉛濃度大于500mg/kg時(shí)，CAT活性開(kāi)始增大，可能是由于CAT對(duì)高濃度鉛比較敏感，高濃度鉛能促進(jìn)CAT活性。再觀察圖2(a)黑線，鎘單一污染時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨鎘濃度的增加，CAT活性先被促進(jìn)然后受抑制，在鎘濃度大于10mg/kg后又被促進(jìn)。圖2(a)其余幾條線顯示，在鎘中加入鉛濃度為250、500、1 000mg/kg時(shí)，CAT活性主要是受鎘鉛復(fù)合污染的控制。在鎘中加入鉛濃度為2 000mg/kg時(shí)，CAT活性與加入鎘濃度成負(fù)相關(guān)，主要受鎘濃度影響。

2.2 鎘、鉛脅迫對(duì)魚(yú)腥草SOD活性的影響

在活性氧防御酶家族中，SOD對(duì)超氧物自由基的清除、脂質(zhì)過(guò)氧化作用的減輕以及膜傷害方面作用重大[31]。

觀察圖2(d)，在鉛單一污染時(shí)，隨鉛濃度增大，SOD活性先增大后減小再趨于穩(wěn)定。在加入鉛濃度小于250mg/kg時(shí)SOD活性上升，可能是受低濃度鉛的刺激，將其激活。但鉛濃度大于250mg/kg后，SOD活性下降則是受高濃度鉛的抑制。當(dāng)鉛濃度大于1 000mg/kg以后，SOD活性趨于穩(wěn)定，可能是由于土壤吸附的鉛已經(jīng)達(dá)到了飽和狀態(tài)。再觀察圖2(b)中黑線，在鎘單一污染時(shí)，SOD變化趨勢(shì)先平穩(wěn)下降再陡然上升最后又平穩(wěn)下降，說(shuō)明鎘濃度在10mg/kg時(shí)最適合植物的生長(zhǎng)需求。

注：圖中過(guò)氧化氫酶活性、過(guò)氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性單位依次為mgH2O2/g.minFW、OD470/g. minFW、U/g.FW。圖2 鎘、鉛單一及交互作用對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶系統(tǒng)的影響Fig.2 Influence of Cd and Pb on the Antioxidant enzyme system of Houttuyniae Herba

圖2(b)中，各鎘鉛復(fù)合污染曲線(除鉛濃度為2 000mg/kg以外)與鎘單一污染曲線變化趨勢(shì)基本一致，可能是因?yàn)橥寥乐杏坞x態(tài)的鎘濃度達(dá)到一定程度時(shí)才能被魚(yú)腥草根部吸收轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片部位，從而激活SOD酶活性。當(dāng)鎘濃度超過(guò)10mg/kg后，各曲線變得穩(wěn)定，說(shuō)明土壤對(duì)鎘的吸附達(dá)到飽和狀態(tài)了。比較圖2中各曲線，不難發(fā)現(xiàn)鎘濃度50mg/kg-鉛濃度250mg/kg組合是魚(yú)腥草SOD對(duì)鎘鉛復(fù)合污染響應(yīng)的一個(gè)極佳組合，并且鉛鎘復(fù)合污染時(shí)，魚(yú)腥草SOD活性主要受鎘濃度影響。

2.3 鎘、鉛脅迫對(duì)魚(yú)腥草POD活性的影響

POD作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要組員之一，在植物呼吸代謝過(guò)程中舉足輕重。

觀察圖2(d)，鉛單一污染時(shí)，POD的活性變化趨勢(shì)隨鉛濃度的增加呈兩個(gè)折線的組合。加入鉛濃度0～250mg/kg時(shí)，可能是微量的鉛是魚(yú)腥草生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)，使得POD活性增大。但是鉛加入濃度從250增加到1 000mg/kg時(shí)，POD活性又下降，表明POD活性受到抑制。然而當(dāng)鉛加入濃度大于1 000mg/kg后，POD活性又陡然上升。說(shuō)明加入低濃度或者較高濃度的鉛更能增加POD活性。再看圖2(c)中黑線，即鎘單一污染的曲線，其與鉛單一污染曲線大致相同，但POD活性均較小，說(shuō)明相較于鉛，POD對(duì)鎘濃度的變化更為敏感。

圖2(c)中鎘鉛復(fù)合污染時(shí)，鉛濃度為250、500、2 000mg/kg那3條曲線里POD變化趨勢(shì)與鉛、鎘單一污染時(shí)恰好相反，說(shuō)明這時(shí)POD活性主要受鎘鉛復(fù)合污染的影響。當(dāng)在鎘中加入的鉛濃度為1 000mg/kg時(shí)，POD活性隨鎘濃度增加而顯著上升，即促進(jìn)了POD活性。

在鎘濃度≤10mg/kg以及鉛濃度≤500mg/kg情況下，鎘單一脅迫和鉛單一脅迫對(duì)魚(yú)腥草CAT活性、SOD活性、POD活性的影響整體上呈現(xiàn)倒“V”形，這與許娜[32]、李錚錚[33]、孟曉霞[34]等人研究的鎘、鉛脅迫對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶系統(tǒng)的影響規(guī)律基本一致。相較于許娜、李錚錚等人的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法以及孟曉霞的水培、土培下鉛單一脅迫研究，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為土培，鎘、鉛濃度上限更高，同時(shí)探討了鎘、鉛單一及復(fù)合污染對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶的影響，實(shí)驗(yàn)方案更接近植物生長(zhǎng)在受高濃度重金屬污染或多種重金屬?gòu)?fù)合污染的土壤天然環(huán)境中所誘發(fā)的生理生化指標(biāo)變化特征。而由于魚(yú)腥草在全球的分布原因，國(guó)外在研究重金屬超富集植物時(shí)鮮有使用魚(yú)腥草為研究對(duì)象的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。另外，除魚(yú)腥草以外，目前已發(fā)現(xiàn)多種植物對(duì)鉛具有較強(qiáng)的富集能力，例如金絲草[35]、柳葉箬[36]、狗牙根[37]等。

2.4 鎘、鉛脅迫對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶系統(tǒng)影響的相關(guān)性及多元回歸分析

表2 鎘、鉛單一污染對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶系統(tǒng)的影響相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis on the Antioxidant enzyme system of Houttuyniae Herba caused by single Cd and single Pb pollution

由表2中的鎘、鉛單一污染對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶系統(tǒng)影響的相關(guān)性分析檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在鎘單一污染情況下P值均大于0.05，所以四個(gè)指標(biāo)在鎘單一脅迫下，在a=0.05水平下線性關(guān)系不顯著；在鉛單一污染情況下P值均大于0.05，所以四個(gè)指標(biāo)在鉛單一脅迫下，在a=0.05水平下線性關(guān)系不顯著。表明鎘、鉛單一污染下，魚(yú)腥草的SOD、POD、CAT特性變化較為復(fù)雜，不能用簡(jiǎn)單的線性進(jìn)行描述。

植物對(duì)重金屬元素的富集通常不是單一富集，而是多種元素共同進(jìn)行，他們彼此之間即可能相互促進(jìn)，也可能相互抑制[38]。參照陳懷滿(mǎn)和鄭春榮[39]在研究Pb、Cd、Cu、Zn對(duì)水稻的復(fù)合污染時(shí)所采用的回歸方程法模擬交互作用，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中可見(jiàn)影響CAT、SOD、POD的各因素大小排序依次分別為：Cd>Cd-Pb>Pb；Cd>Cd-Pb>Pb；Pb>Cd-Pb>Cd，但只有POD的P值<0.05，即鎘鉛交互作用對(duì)魚(yú)腥草POD活性的影響顯著。

表3 Cd、Pb處理對(duì)魚(yú)腥草抗氧化酶系統(tǒng)影響的多元回歸分析Tab.3 Multiple regression analysis on the Antioxidant enzyme system of Houttuyniae Herba caused by Cd and Pb interaction

3 結(jié) 論

通過(guò)經(jīng)Cd 、Pb處理后的土壤培養(yǎng)魚(yú)腥草，以探討?hù)~(yú)腥草葉片中抗氧化酶系統(tǒng)的變化特征，主要得出以下結(jié)果：

3.1 Cd 、Pb單一作用時(shí)，低濃度促進(jìn)魚(yú)腥草SOD的活性，高濃度對(duì)SOD的活性影響不顯著。Cd-Pb交互作用時(shí)基本上都有一個(gè)SOD活性的最低點(diǎn)，且其影響程度表現(xiàn)為Cd>Cd-Pb>Pb；

3.2 Cd 、Pb單一作用時(shí)，低濃度處理先促進(jìn)然后抑制魚(yú)腥草POD活性，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，大大促進(jìn)POD活性。Cd-Pb交互作用對(duì)魚(yú)腥草POD的影響顯著，影響程度表現(xiàn)為Pb>Cd-Pb>Cd；

3.3 Cd 、Pb單一作用對(duì)魚(yú)腥草CAT的影響和對(duì)POD的影響差不多。Cd-Pb交互作用對(duì)魚(yú)腥草CAT的影響程度表現(xiàn)為Cd>Cd-Pb>Pb。

結(jié)果表明，Cd對(duì)魚(yú)腥草的影響和傷害作用遠(yuǎn)大于Pb，魚(yú)腥草對(duì)Pb具有較強(qiáng)的富集能力，Cd-Pb交互作用對(duì)于魚(yú)腥草的影響介于鎘、鉛單一脅迫之間。因此，可考慮將魚(yú)腥草用于修復(fù)土壤中的Pb污染以及Cd-Pb復(fù)合污染。