肺炎支原體肺炎患兒外周血白細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及臨床意義*

侯雪 劉燕 楊曉麗 李靜

(1.山西醫(yī)科大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)系小兒內(nèi)科教研室,山西 太原 030001； 2.山西省人民醫(yī)院兒科,山西 太原 030012)

肺炎支原體(Mycoplasma Pneumoniae，MP)是引起兒童社區(qū)獲得性肺炎(Community Acquired Pneumonia，CAP)的最常見病原體之一。近年來引起重癥及難治性肺炎支原體肺炎病例(Refractory Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia,RMPP)報(bào)道逐漸增多，故了解MP引起的肺炎支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，MPP)的發(fā)病機(jī)制越來越迫切。目前關(guān)于MPP致病的具體機(jī)制仍不明確，主要包括上皮黏附、毒素作用及免疫紊亂[1]。自噬是機(jī)體的一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制，通過溶酶體降解途徑處理受損的細(xì)胞器、變性蛋白質(zhì)以及侵入的病原體，是近些年發(fā)現(xiàn)具有防御病原菌的天然免疫和獲得性免疫的新途徑[2]。關(guān)于自噬與肺部感染性疾病如金黃色葡萄球菌、新型隱球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和結(jié)核分枝桿菌感染[3-6]的一些體外和動物實(shí)驗(yàn)表明，自噬在肺部感染性疾病中具有十分重要的作用，但目前國內(nèi)外尚缺乏自噬在MPP患兒外周血中的研究，且有關(guān)MPP患兒外周血白細(xì)胞自噬水平的研究國內(nèi)外仍然缺乏。本研究通過檢測MPP患兒外周血白細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比例、Beclin1表達(dá)量及細(xì)胞因子的表達(dá)量，分析自噬與細(xì)胞因子和不同程度MP的相關(guān)性，探討自噬在MPP中所發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月～2020年5月山西省人民醫(yī)院兒科病房收治的MPP患兒進(jìn)行前瞻性分析。MPP感染急性期患兒50例，所有患兒診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》MPP感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。依照病情將50例MPP患兒分為輕癥組及重癥組。重癥組納入標(biāo)準(zhǔn)[8]：在確診MPP基礎(chǔ)上出現(xiàn)以下任意一條表現(xiàn)：①明顯氣促或心動過速(根據(jù)不同年齡有不同評判標(biāo)準(zhǔn))，伴或不伴呼吸困難(鼻翼搧動、呻吟、三凹征)及紫紺等。②低氧血癥，吸入空氣條件下，脈搏血氧飽和度(SaO2)≤0.92。③經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物正規(guī)治療7 d及以上，臨床征象加重、仍持續(xù)發(fā)熱、肺部影像學(xué)加重。④胸部影像學(xué)表現(xiàn)為多葉段受累或受累面積≥2/3肺。⑤出現(xiàn)胸腔積液、肺不張、肺膿腫等肺內(nèi)并發(fā)癥。⑥合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害(中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、心力衰竭、心肌炎、消化道出血、明顯電解質(zhì)/酸堿平衡紊亂等)。家長自愿參與研究，簽署同意書。排除其他疾病所致肺炎、嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、糖皮質(zhì)激素或抗生素及免疫抑制劑服藥史等患兒。其中輕癥組28例，重癥組22例。選取該院同期門診體檢的兒童在排除肺炎支原體近遠(yuǎn)期感染后認(rèn)定為健康兒童25例為對照組。入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡1～12歲,性別不限。②近1月內(nèi)無咳嗽、發(fā)熱鼻塞、流涕等急性呼吸道癥狀,無嘔吐、腹瀉等消化道癥狀者。③無免疫缺陷性疾病，排除慢性疾病者。④患兒依從性好，能配合檢查。本研究獲得山西省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

MPP輕癥組28例，年齡3～12歲，平均(6.12±2.32)歲；重癥組22例，年齡3～12歲，平均(7.06±1.91)歲；對照組25例，年齡3～12歲，平均(6.42±2.46)歲。3組受試對象性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑及設(shè)備 LC3Ⅱ/I、 Beclin1的一抗及二抗(北京百奧菜博科科技有限公司)；白細(xì)胞介素6( Interleukin6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis Factor-α，TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附( Enzyme Linked Immune Sorbent Assay，ELISA)試劑盒(伊來瑞特)；二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物( Thermo Fisher公司，美國)。

1.2.2 標(biāo)本采集及檢測 輕癥組、重癥組在確診時(shí)靜脈抽取2 mL非抗凝靜脈血，對照組則在清晨空腹抽取2 mL非抗凝靜脈血，分離血清，置-20℃冰箱保存待測，標(biāo)本采集前兩周患兒無激素和免疫調(diào)節(jié)劑治療史。其中1 mL檢測細(xì)胞因子，1 mL分離并裂解白細(xì)胞檢測 LC3Ⅱ、LC3I和 Bec1in1表達(dá)量,計(jì)算 LC3Ⅱ/I比例。 每組設(shè)置 3 個復(fù)孔,試驗(yàn)均重復(fù) 3 次取平均值。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測患兒血清TNF-a、IL-6濃度，試驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用 Pearson相關(guān)性分析比較自噬水平和細(xì)胞因子之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血細(xì)胞LC3II/I比例及Beclin1表達(dá)量 MPP輕癥組、重癥組外周血白細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3II/I及Beclin1表達(dá)量高于對照組，MPP重癥組高于輕癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1～2。

圖1 3組白細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3II/I表達(dá)情況

圖2 3組白細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)情況

2.2 血清細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平表達(dá)量 MPP輕癥組、重癥組IL-6、TNF-α水平高于對照組，MPP重癥組IL-6、TNF-α水平高于輕癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖3。

圖3 3組外周血白細(xì)胞血清細(xì)胞因子表達(dá)水平

2.3 LC3II/I、 Beclin1及細(xì)胞因子的相關(guān)性 自噬相關(guān)蛋白LC3II/I、 Beclin1表達(dá)與IL-6、TNF-α成正相關(guān)(均P<0.05)，見表1。

表1 肺炎支原體患兒白細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和炎癥指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

MP感染在兒童肺炎中占比約為20%～40%，且主要集中于5～9歲的群體，近年來MPP發(fā)病率逐漸上升[9]，重癥肺炎支原體肺炎(Severe Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，SMPP)和RMPP在國內(nèi)呈逐年升高的趨勢，SMPP不僅可引起肺部實(shí)變、肺不張、胸腔積液、氣胸等肺內(nèi)并發(fā)癥，還可導(dǎo)致多系統(tǒng)肺外并發(fā)癥，病程長，病情重，甚至可引起多器官功能障礙綜合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)或多器官功能衰竭 (Multiple Organ Failure，MOF)，甚至死亡[10]。因此，臨床對肺炎支原體病原學(xué)及免疫機(jī)制的研究也逐漸深入。迄今為止，MPP的發(fā)病機(jī)制尚不明確，隨著研究的深入，目前已有免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制、呼吸道上皮細(xì)胞吸附和MP直接侵入學(xué)說[1，11]。因此，研究MPP的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是及時(shí)治療MPP和降低SMPP患病率的關(guān)鍵。

自噬是真核細(xì)胞生物體在不斷進(jìn)化過程中形成的一個高度保守的過程，其參與多種生物學(xué)過程，自噬功能的改變影響老化和有缺陷的細(xì)胞器、蛋白聚集體以及入侵病原體的清除，它既能對抗外來病原微生物的入侵，又能保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)毒物的損害[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬與很多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、克羅恩病、腫瘤及感染性疾病等[13-14]。一些動物實(shí)驗(yàn)表明，綿羊肺炎支原體(Mycoplasma Ovipneumoniae，MO)感染早期可通路激活巨噬細(xì)胞自噬，隨著感染時(shí)間的延長，可通過調(diào)節(jié)PI3K通路抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，利于MO在胞內(nèi)的存活，利于避免被其它免疫細(xì)胞識別、清除[15]。MP可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，同時(shí)一些細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激物也會誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。自噬對胞內(nèi)應(yīng)激物的清除可以影響炎性小體裝配，繼而影響到炎癥水平[16]。

自噬是由多種自噬相關(guān)基因 (Autophagy Related Gene, ATG)和受體信號分子通路調(diào)控的免疫過程[17]。Beclin-1和LC3作為自噬的標(biāo)志性蛋白[18]，是實(shí)驗(yàn)中檢測自噬作用最常用的蛋白，Beclin-1是最早被發(fā)現(xiàn)的多功能自噬蛋白之一，它可調(diào)節(jié)自噬性細(xì)胞死亡途徑，與自噬體形成密切相關(guān)，對促進(jìn)不同蛋白質(zhì)之間相互作用起重要作用[19]。LC3是涉及自噬體形成的泛素樣蛋白質(zhì), 它與酵母Atg8蛋白同源。LC3II定位于參與自噬途徑的細(xì)胞膜上，其數(shù)量與自噬體形成程度相關(guān)，是很好的自噬體標(biāo)記物[20]。在哺乳動物的自噬誘導(dǎo)時(shí)，磷脂酰乙醇胺(PE)修飾LC3-I轉(zhuǎn)化為LC3-II是自噬體形成的關(guān)鍵步驟[21]。LC3II/I比例與自噬泡的數(shù)量成正相關(guān)，某種程度上反應(yīng)細(xì)胞的自噬活性，比值越高，自噬活性越高[22]。本研究中細(xì)胞中LC3II/I、Beclin1表達(dá)均高于對照組，提示MPP患兒中性粒細(xì)胞中發(fā)生了自噬反應(yīng)。

目前許多研究表明，多種細(xì)胞因子參與了MPP炎癥反應(yīng)過程，TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子，若細(xì)胞因子在血清中表達(dá)出現(xiàn)失控，可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。本研究中輕癥組、重癥組患兒血清中IL-6、TNF-α均高于對照組，表示IL-6、TNF-α參與了MPP炎癥反應(yīng)發(fā)生的過程，重癥組患兒血清中IL-6、TNF-α高于輕癥組，證明患兒病情越重，則血清中IL-6、TNF-α的含量越高，病情與炎癥因子水平呈正相關(guān)，結(jié)合臨床可作為MPP嚴(yán)重程度的指標(biāo)及病情發(fā)展的參考。自噬在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)中具有重要作用，并能夠影響細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生[23]，而在失調(diào)控的免疫反應(yīng)中,大量的促炎因子和聚集的白細(xì)胞可以通過炎癥信號通路誘導(dǎo)組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,線粒體損傷,活性氧過量生成,誘發(fā)保護(hù)性自噬反應(yīng)以包裹損傷的細(xì)胞器,限制損傷信號的進(jìn)一步擴(kuò)散。自噬被認(rèn)為是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫及對抗應(yīng)激的重要防線。MPP發(fā)病重要機(jī)制之一是支原體脂蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制不明，間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過分泌相關(guān)細(xì)胞因子：TNF-α、IL-1、IL-6等發(fā)揮作用。若細(xì)胞因子在血清中的表達(dá)失控，則可直接引起細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬關(guān)系密切。

本研究中重癥組自噬蛋白水平高于輕癥組，表明自噬和病情程度有關(guān)，病情越重，自噬程度越高。同時(shí)IL-6、TNF-α與自噬蛋白成正相關(guān)，考慮可能是MPP中發(fā)生自噬會影響細(xì)胞因子的改變從而影響病情的輕重程度。推測通過測定自噬在不同程度MPP肺炎中的水平可對MPP的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后做出評估。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，MPP患兒外周血白細(xì)胞自噬蛋白、炎癥因子顯著增加，提示自噬參與MPP的發(fā)病過程，細(xì)胞因子水平越高，炎癥反應(yīng)越明顯，且自噬和細(xì)胞因子呈正相關(guān)，可能與MPP中發(fā)生自噬影響細(xì)胞因子的改變從而影響病情有關(guān)。目前，MPP細(xì)胞自噬處于基礎(chǔ)研究階段，自噬體和肺炎支原體互相作用的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，今后仍需大量的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。