香蕉MaGA20ox4和MaGA20ox5基因克隆、表達及亞細胞定位分析

段雅婕 陳經(jīng)燁 陳晶晶

摘? 要：以威廉斯香蕉（Musa spp. AAA group）‘8818及其突變體‘8818-1的假莖為試材，同源克隆MaGA20ox4和MaGA20ox5基因的gDNA及啟動子序列，比較它們在基因組測序品種以及‘8818和‘8818-1中的序列差異。序列比對結(jié)果表明：MaGA20ox4和MaGA20ox5基因的gDNA相似性達93.82%，而二者的啟動子序列相似性僅有40%，威廉斯品種與基因組測序品種間MaGA20ox4和MaGA20ox5基因無論gDNA還是啟動子序列均存在較大差異，特別是啟動子序列。威廉斯‘8818和‘8818-1間MaGA20ox4基因gDNA也存在一定的堿基序列差異，但啟動子序列基本相同，MaGA20ox5結(jié)果同MaGA20ox4類似。啟動子分析推測2個基因的啟動子屬于誘導性啟動子，存在較多光響應和激素響應元件。進一步構(gòu)建了MaGA20ox4和MaGA20ox5的亞細胞定位表達載體，定位結(jié)果顯示，MaGA20ox4和MaGA20ox5蛋白均定位于細胞核上，可能定位于細胞質(zhì)或細胞膜。在不同品種香蕉果實的不同發(fā)育時期qRT-PCR結(jié)果表明，MaGA20ox4和MaGA20ox5具有品種特異性，在威廉斯香蕉品種果實中可能不是主要的赤霉素合成調(diào)控基因。

關(guān)鍵詞：香蕉;赤霉素20氧化酶;基因克隆;亞細胞定位

中圖分類號：S668.1 ?????文獻標識碼：A

Cloning， Expression and Subcellular Localization Analysis of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 Gene from Banana

DUAN Yajie， CHEN Jingye， CHEN Jingjing^*

Institute of South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / National Field Genebank for Tropical Fruit / Key Laboratory of Hainan Province for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： Using the false stem of Musa spp. AAA Group ‘8818 and its mutant ‘8818-1 as the materials， the gDNA and promoter sequences of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 genes were cloned homogeneously， and the sequence differences in the genome-sequencing variety， ‘8818 and ‘8818-1 were compared. The results of sequence alignment showed that the gDNA similarity of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 genes reached 93.82%， while the promoter sequence similarity of the two genes was only 40%. There were large differences in gDNA and promoter sequences of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 genes between Williams varieties and genome-sequencing variety， especially the promoter sequence. The gDNA of MaGA20ox4 gene of Williams ‘8818 and ‘8818-1 also had difference in base sequence， but the promoter sequence was basically the same， and the result of MaGA20ox5 was similar to MaGA20ox4. Promoter analysis suggested that the promoters of the two genes belonged to inducible promoters， and there were more light response and hormone response elements. The subcellular localization vectors of MaGA20ox4 and MaGA20ox5 were further constructed. The localization results showed that MaGA20ox4 and MaGA20ox5 proteins were localized on the nucleus and might be localized on the cell membrane or cytoplasm. Quantitative RT-PCR results at different developmental stages of different banana fruits showed that MaGA20ox4 and MaGA20ox5 were species-specific， and may not be the main gene regulating gibberellin synthesis in Williams banana fruits.

Keywords： banana; GA20ox; gene clone; subcellular localization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.001

赤霉素（GA）作為調(diào)控植物發(fā)育的重要激素，最明顯的生理作用是促進伸長，但不增加節(jié)間^[1]。赤霉素氧化酶是調(diào)控赤霉素代謝的關(guān)鍵酶，其中GA-20氧化酶（GA20ox）和GA3氧化酶（GA3ox）能將GA₁₂和GA₅₃催化合成有活性的GA₁和GA₄;而GA2氧化酶（GA2ox）能通過β-羥基化作用將活性GA₁和GA₄催化形成無活性的GA₈和GA₃₄，這些關(guān)鍵基因的表達同時受到活性赤霉素的反饋和前饋調(diào)節(jié)^[1-3]。赤霉素氧化酶屬于多基因家族，研究發(fā)現(xiàn)，水稻中存在8個GA20ox、2個GA3ox、11個GA2ox基因;擬南芥中存在5個GA20ox、4個GA3ox、8個GA2ox基因;大豆中存在8個GA20ox、6個GA3ox、10個GA2ox基因^[4]。赤霉素氧化酶基因家族一般可分為GA20ox、GA3ox、C19-GA2ox、C20-GA2ox 4個亞類^[3-5]，但近年來通過進化分析發(fā)現(xiàn)有些基因不屬于上面4個亞類，Huang等^[3]提出了增加GAox-A、GAox-B、GAox-C和GAox-D 4個亞類的劃分，例如水稻OsGA20ox5、OsGA20ox6、OsGA20ox7和OsGA20ox8分別屬于這4類。對于GA20ox、GA3ox、C19-GA2ox、C20-GA2ox 4個亞類中的基因，均具有赤霉素氧化酶基因典型功能的特征，如GA20ox和GA3ox催化合成活性赤霉素，GA2ox降解活性赤霉素為無活性的形式，并且這4類基因的功能研究最多，其中與調(diào)控株高最相關(guān)的赤霉素基因在這4類基因中都有研究，而對于GAox-A、GAox-B、GAox-C、GAox-D等4個亞類的基因還沒有很多的研究，對于其明確的基因功能還沒有相關(guān)的研究報道。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)香蕉威廉斯矮化突變體（8818-1）大部分器官中的GA含量均低于親本（8818）的水平，且含量差異較大;用不同濃度的GA₃對8818-1植株進行外源噴施處理，發(fā)現(xiàn)外源的GA₃處理后對突變體8818-1株高有明顯恢復作用，因此推測8818-1的矮化是由赤霉素含量降低引起^[5-6]。在香蕉A基因組^[7]查找了赤霉素所有合成代謝的基因，經(jīng)同源進化分析發(fā)現(xiàn)了10個GA20ox-like （MaGA20ox 1-10）、4個GA3ox-like （MaGA3ox1-3）、14個GA2ox-like （MaGA2ox1-15）基因，并篩選出了在假莖中起主要調(diào)節(jié)作用的赤霉素氧化酶基因為MaGA20ox基因家族的MaGA20ox4、MaGA20ox5、MaGA20ox7和MaGA2ox基因家族的MaGA2ox7、MaGA2ox12、MaGA2ox14^[5]。其中在假莖中明顯差異表達的MaGA20ox4、MaGA20ox5和OsGA20ox5聚為一類，屬于GAox-A亞類^[5]。本研究在此基礎上進一步通過qRT-PCR方法分析這2個基因MaGA20ox4和MaGA20ox5在不同香蕉品種果實發(fā)育不同階段的表達模式，并克隆其在親本和突變體中g(shù)DNA序列和啟動子，分析其表達差異是否是突變體堿基序列存在突變引起，或是啟動子元件存在差異導致。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗材料? 4個香蕉品種威廉斯香蕉‘8818（‘8818，AAA）、突變體‘8818-1（‘8818-1，AAA）、巴西香蕉（‘BX，AAA）、貢蕉（‘GJ，AA）由本研究室提供，成年植株種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所香蕉種質(zhì)資源圃。果實取樣：取同一生長時期的4個香蕉品種果實發(fā)育的3個不同生長階段，即極幼果、幼果、七分熟果的果肉為材料。同時取‘8818和‘8818-112葉期的假莖部位作為克隆基因的材料。取樣后放?80?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 試劑 ?RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)大腸桿菌，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化（北京）有限公司;Qiagen植物DNA提取試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司;pMD19-T克隆載體、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit和PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser），LA Taq、dNTPs、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司;Dynamo Color Flash SYBR Green qPCR Kit（Thermo Fisher）購自廣州賽哲生物公司;內(nèi)切酶AarI和BsaI購自廣州萃本生物科技有限公司;酵母提取物、蛋白胨、瓊脂糖、IPTG、X-Gal、氨芐青霉素等從上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司購買。

1.2 方法

1.2.1? 香蕉MaGA20ox4和MaGA20ox5gDNA和啟動子克隆? 參照Qiagen植物DNA提取試劑盒（DNeasy plant）的方法，提取威廉斯香蕉‘8818和‘8818-1假莖DNA。

在香蕉A基因數(shù)據(jù)庫中下載小果野蕉（Musa acuminata，DH Pahang，AA）MaGA20ox4（GSMUA_Achr7T08230_001）和MaGA20ox5（GSMUA_Achr7T08240_001）的基因序列（包含內(nèi)含子區(qū)和UTRs區(qū)），設計gDNA全長和啟動子同源克隆的上下游引物（表1）。PCR模板為‘8818和‘8818-1假莖DNA，體系為25?μL（DNA 1?μL;上下引物各1?μL;dNTPs 0.5?μL;ddH₂O 18.80?μL;Buffer 2.5?μL;LATaq0.2?μL）。擴增參數(shù)為：95?℃預變性4?min;95?℃變性40?s，50?℃退火40?s，72?℃延伸2?min，35個循環(huán);72?℃延伸7?min。最后PCR擴增產(chǎn)物回收，產(chǎn)物純化后連接pMD-19T載體，陽性菌液送公司測序。

1.2.2? 基因序列的生物信息學分析? 將測序結(jié)果拼接獲得MaGA20ox4和MaGA20ox5基因gDNA和上游啟動子序列，利用DNAMAN（Ver. 6.0.3.99）軟件進行序列比對，利用NCBI中的BLAST（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/）對MaGA20ox4和MaGA20ox5蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行分析;利用PlantCARE軟件（http：//bioinfor?matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子順式作用元件預測分析。

1.2.3 ?亞細胞定位分析 ?表達載體的構(gòu)建與鑒定：根據(jù)MaGA20ox4和MaGA20ox5的ORF設計帶有酶切位點的引物（表1），以MaGA20ox4和MaGA20ox5基因開放閱讀框（ORF）正確的克隆產(chǎn)物提取質(zhì)粒，基因用AarI進行酶切，載體用BsaI進行酶切，用T₄DNA連接酶連接到pBWA（V） HS-ccdb-GLosgfp載體上，將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR擴增、酶切篩選和測序驗證正確后，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒，獲得GFP與目的基因的融合表達載體pBWA（V） HS-MaGA20ox4-GLosgfp和pBWA（V）HS-MaGA?? 20ox5-GLosgfp。

煙草葉片的瞬時轉(zhuǎn)化及激光共聚焦顯微觀察：將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，30?℃培養(yǎng)2?d;將農(nóng)桿菌從固體接于10?mL YEB液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，懸浮液重懸菌體，調(diào)OD₆₀₀至0.6左右;注射煙草下表皮，弱光培養(yǎng)2?d，取標記的農(nóng)桿菌注射的煙草葉片制作成玻片，用Nikon C2-ER激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4? 香蕉MaGA20ox4和MaGA20ox5基因在果實中的表達分析? 參照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒中的方法，提取‘8818和‘8818-1不同品種香蕉果實中總RNA。采用TaKaRa公司PrimeScript?RT reagent Kit（用于基因克?。┖蚉rimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（用于qRT-PCR）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照其說明書進行逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

采用SYBR Green I染料法，利用熒光定量qRT-PCR探討MaGA20ox4和MaGA20ox5基因在果實中的表達情況。根據(jù)克隆獲得的香蕉MaGA20ox4和MaGA20ox5 CDS序列，在二者序列不一致區(qū)域設計定量引物（表1）。內(nèi)參為Actin（AB022041）。qRT-PCR反應體系為：2×DyNAmo color Flash SYBR Green master mix 10?μL、模板cDNA 0.5?μL，上下游引物各0.6?μL，ddH₂O補至20?μL。qRT-PCR反應程序為：95?℃ 5?min;95?℃ 10?s，58?℃ 20?s，72?℃ 25?s（real time 熒光采集），40個循環(huán);95?℃ 5?s，65?℃ 1?min，97?℃（熒光采集結(jié)束），40?℃ 30?s（冷卻）。每個樣品在同一板中重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差（SD）表示。

2 ?結(jié)果與分析

2.1? MaGA20ox4和MaGA20ox5 gDNA序列差異及保守結(jié)構(gòu)域分析

MaGA20ox4基因CDS區(qū)包含1077?bp，外顯子加內(nèi)含子的gDNA序列有1223?bp。同源克隆‘8118和‘8818-1中MaGA20ox4gDNA序列。序列比對發(fā)現(xiàn)（圖1），三者MaGA20ox4gDNA序列長度一致，其中‘8818和‘8818-1MaGA20ox4gDNA序列有13處堿基序列不一致，小果野蕉核苷酸序列與‘8818有27處，與‘8818-1有21處不一致，與‘8818和‘8818-1均不一致堿基序列有16處。

MaGA20ox5基因CDS區(qū)包含1057?bp，外顯子加內(nèi)含子的gDNA序列有1205?bp。同源克隆‘8818和‘8818-1中MaGA20ox5gDNA序列，序列比對發(fā)現(xiàn)（圖2），‘8818和‘8818-1MaGA20ox5序列有5處堿基序列不一致;小果野蕉核苷酸序列與‘8818有8處，與‘8818-1有8處不一致，與‘8818和‘8818-1均不一致序列有6處。

對MaGA20ox4和MaGA20ox5gDNA核苷酸序列進行比較，二者cDNA序列相似性93.41%，gDNA序列相似性93.82%。前期對香蕉赤霉素氧化酶基因家族進行進化分析發(fā)現(xiàn)，MaGA20ox4，

MaGA20ox5和水稻OsGA20ox5聚為一類，屬于GAox-A亞類^[5]。在NCBI上進行MaGA20ox4、MaGA20ox5和OsGA20ox5蛋白結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)三者均有3個結(jié)構(gòu)域（圖3），包括2-酮戊二酸作為輔因子的含非血紅素鐵的氧化酶超家族（2OG-Fe（II） oxygenase superfamily），PLN02750（oxidoreductase， 2OG-Fe（II） oxygenase family protein，2-酮戊二酸作為輔因子的含非血紅素鐵的氧化酶家族蛋白），次級代謝合成相關(guān)的PcbC（Isopenicillin N synthase and related dioxygenases）。像OsGA20ox5蛋白一樣，MaGA20ox4和MaGA20ox5均不具有典型赤霉素氧化酶基因與底物結(jié)合的的LPWKET基元，在分類上屬于GAox-A亞類^{[3， 5]}，而對于這類赤霉素氧化酶基因的功能尚需要明確。

2.2? MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動子序列和順式作用元件分析

根據(jù)小果野蕉GA20ox4基因啟動子序列同源克隆‘8818和‘8818-1MaGA20ox4啟動子1574?bp。序列比對發(fā)現(xiàn)‘8818和‘8818-1之間有1處堿基序列不一致;小果野蕉基因組測序序列與‘8818和‘8818-1有25處1～2個堿基不一致，4處超過6個堿基不一致，其中2處超過80個堿基不一致。小果野蕉與威廉斯品種GA20ox4啟動子堿基序列差異較大，而‘8818和‘8818-1間差異很?。▓D4）。同源克隆MaGA20ox5啟動子1585?bp，序列比對發(fā)現(xiàn)‘8818和‘8818-1啟動子序列有3處堿基不一致;小果野蕉基因組測序序列與‘8818有29處，與‘8818-1有30處堿基序列不一致;小果野蕉與‘8818‘8818-1均不一致堿基序列28處（圖5）。比較MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動子序列發(fā)現(xiàn)二者的啟動子序列相似性僅有40%。

經(jīng)植物啟動子元件分析軟件PlantCARE預測，MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動子均存在大量順式作用元件，結(jié)果見表2。MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動子序列都存在核心元件TATA-box和增強元件CAAT-box，符合真核生物基因啟動子的基本結(jié)構(gòu)特征。在小果野蕉和威廉斯2個品種中，MaGA20ox4和MaGA20ox5啟動子中的TATA-box和CAAT-box的數(shù)量并不完全一致，但是威廉斯‘8818和‘8818-1中TATA-box和CAAT-box數(shù)量一樣。MaGA20ox4中CAAT-box在‘8818和‘8818-1中比小果野蕉中多4個，MaGA20ox5中CAAT-box在‘8818和‘8818-1中比小果野蕉中多1個。

除基本的啟動子結(jié)構(gòu)元件外，MaGA20ox4和MaGA20ox5基因啟動子中還存光調(diào)控元件、激素響應元件、脅迫響應元件和其他響應元件。其他響應元件包括晝夜節(jié)律、MYB結(jié)合位點、MYC結(jié)合位點、胚乳表達順式作用元件等。在光調(diào)控元件中，2個品種中的MaGA20ox4啟動子中都含有Box 4、Box II、GATA-motif、TCT-motifG-box、GT1-motif元件。AE-box存在小果野蕉中，在威廉斯中不存在;ACE只存在威廉斯中，在小果野蕉中不存在。2個品種中的MaGA20ox5啟動子中都含有Box 4、I-box、G-box、GATA-motif、TCT-motif，小果野蕉中存在L-box，而威廉斯中不存在。在激素響應元件中，2個品種的MaGA20ox4啟動子都含有茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif、TGACG-motif;赤霉素響應元件GARE-motif;脫落酸響應元件ABRE、乙烯響應元件ERE;小果野蕉中存在生長素響應元件 TGA-element，威廉斯‘8818-1中存在水楊酸響應元件TCA-element。MaGA20ox5啟動子僅含有茉莉酸甲酯、脫落酸以及乙烯響應元件，其中威廉斯品種還含有水楊酸相應元件。在脅迫誘導元件中，2個品種的MaGA20ox4啟動子均存在厭氧誘導作用元件和響應干旱調(diào)控的MYB結(jié)合位點。MaGA20ox5啟動子存在厭氧誘導作用元件和抗病及脅迫誘導順式作用元件。除了基本啟動子元件外，不同品種間均有的元件數(shù)量一致。

綜上分析認為MaGA20ox4和MaGA20ox5基因啟動子具有誘導型啟動子特征，存著大量光響應元件和激素響應元件，推測其受光誘導及激素誘導的可能性較大。而二者啟動元件數(shù)量和種類的不同暗示可能存在不同的誘導響應模式。

2.3? MaGA20ox4和MaGA20ox5亞細胞定位分析

將構(gòu)建的植物融合表達載體pBWA（V）HS- MaGA20ox4-GLosgfp，pBWA（V）HS-MaGA20ox5- GLosgfp和空載體pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，注射煙草下表皮，弱光培養(yǎng)2?d，取標記的農(nóng)桿菌注射的煙草葉片制作成玻片，在激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號的分布。結(jié)果顯示：MaGA20ox4-GFP融合蛋白（圖6A～圖6D）及帶有GFP的空載（圖6E～圖6H）在煙草葉片細胞的細胞核中均有表達，另外在細胞質(zhì)或細胞膜中可能有表達，因煙草細胞質(zhì)緊挨細胞膜，如果明確區(qū)分2個蛋白的是否細胞膜和細胞質(zhì)定位，還需進一步進行細胞質(zhì)和細胞膜的共定位分析。與MaGA20ox4蛋白類似，蛋白MaGA20ox5- GFP和帶有GFP的空載在煙草葉片的細胞核中均有表達，在細胞質(zhì)或細胞膜中可能有表達（圖7）。表明MaGA20ox4和MaGA20ox5編碼的蛋白均確定定位在胞核上，是否定位在細胞質(zhì)或細胞膜需要進一步確定。

2.4? MaGA20ox4和MaGA20ox5在果實中的表達分析

除了‘8818和‘8818-1，選取具有A基因組的巴西香蕉（‘BX）及貢蕉（‘GJ），分析MaGA20ox4基因在果實發(fā)育的3個不同時期（圖 <！--[if gte vml 1]> <！[endif]--><！--[if ！vml]--><！--[endif]-->8A）的表達模式，4種香蕉果指長度比較為‘BX≥‘8818>‘8818-1>‘GJ，其中‘GJ以其果指短為主要特點，‘8818-1果指也明顯低于親本‘8818。

結(jié)果如8B所示，除了‘BX，MaGA20ox4在‘GJ‘8818和‘8818-1果實從小到大3個時期呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，MaGA20ox4在極幼果期表達量最高;而在‘BX中，在幼果和七分熟果中的表達量高于極幼果;整體而言，MaGA20ox4在‘GJ中的表達量最高，而在‘8818-1中的表達量最低。MaGA20ox5在‘BX‘GJ和‘8818中基本呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，同樣在極幼果期表達量最高。而在‘8818-1中呈現(xiàn)波動表達，表達量低于‘BX‘GJ和‘8818的極幼果時期。MaGA20ox5基因在4種香蕉果實中的整體表達量均高于MaGA20ox4。以上結(jié)果表明MaGA20ox4和MaGA20ox5的表達不僅存在品種差異，在果實不同發(fā)育時期也存在差異，暗示其可能與MaGA20ox4和MaGA20ox5基因家族其他成員一起協(xié)同調(diào)控果實不同發(fā)育時期的赤霉素含量，其中MaGA20ox5的調(diào)控作用可能強于MaGA20ox4。在‘GJ果實發(fā)育過程中MaGA20ox4、MaGA20ox5或許是起主要作用的MaGA20ox基因。

而對比MaGA20ox4和MaGA20ox5在‘8818和‘8818-1中的表達，MaGA20ox4在‘8818-1中整體表達低于‘8818，MaGA20ox5在‘8818-1中的表達低于‘8818的極幼果時期，結(jié)合前期研究，在威廉斯香蕉果實的幼果中MaGA20ox3表達量最高，MaGA20ox4、MaGA20ox9、MaGA20ox6表達量其次^[5]，表明MaGA20ox4、MaGA20ox5可能協(xié)同其他MaGA20ox一起發(fā)揮作用，或許不是威廉斯香蕉果實中主要MaGA20ox基因。而前期對MaGA20ox基因家族在假莖中的表達進行篩選，發(fā)現(xiàn)MaGA20ox4在威廉斯香蕉假莖中表達量最高，其中‘8818-1假莖中的表達也明顯低于‘8818^[5]，結(jié)合2個結(jié)果分析本研究認為MaGA20ox4在‘8818和‘8818-1果實和假莖表達中存在差異，其中MaGA20ox4是威廉斯香蕉假莖中起主要作用的MaGA20ox，可能是造成‘8818和‘8818-1假莖中赤霉素含量差異的原因;而在果實中MaGA20ox4可能參與了果實赤霉素含量的調(diào)控，但可能不是主要的基因。

3 ?討論

MaGA20ox 4和MaGA20ox 5基因在同源進化分析上與水稻OsGA20ox5基因聚為一類，屬于新劃分的GAox-A亞類，不同于傳統(tǒng)分類GA20ox、GA3ox、C19-GA2ox、C20-GA2ox均具有赤霉素氧化酶基因典型功能的特征，GAox-A亞類的功能尚未明確。本研究對威廉斯香蕉‘8818和‘8818-1中MaGA20ox 4和MaGA20ox 5的gDNA和啟動子序列進行了克隆，與香蕉基因組測序序列進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)威廉斯品種與測序品種小果野蕉的MaGA20ox 4和MaGA20ox 5 gDNA序列有16處和6處堿基位點不一致，說明這2個基因在品種間存在著多態(tài)性。相對于gDNA，2個基因的啟動子與基因組測序品種的啟動子差異更大，特別是MaGA20ox 4基因的啟動子，這種差異可能是基因組進化的結(jié)果，不同品種間赤霉素氧化酶基因家族成員在進化過程中功能逐漸進行了區(qū)分。而對于威廉斯‘8818和其突變體‘8818-1間MaGA20ox 4和MaGA20ox 5 gDNA序列分別有13個和5堿基與基因組測序序列不一致，2個基因的啟動子在‘8818和‘8818-1中基本一致，表明EMS誘變可能導致了這2個基因部分堿基在‘8818-1中發(fā)生了改變，這些改變有沒有影響其蛋白功能還未知，但是影響了其在‘8818和‘8818-1的表達量。其中MaGA20ox?4基因無論是品種間還是親本和突變體間變異最大，根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)MaGA20ox 4可能是造成‘8818和‘8818-1突變體中赤霉素含量差異的主要基因^[5]，推測其序列變異可能改變了其表達調(diào)控。啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，2個基因的光調(diào)控元件較多，許多實驗結(jié)果表明光質(zhì)和光周期可以調(diào)節(jié)GA的生物合成和代謝^[8-10]。在長日照下菠菜的GA20氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平高于短日照下的，當擬南芥從短日照轉(zhuǎn)到長日照后，其GA20氧化酶活性增加^[11-12]，說明這2個基因可能也受光的調(diào)控。

典型的赤霉素氧化酶，如GA20ox和GA3ox催化合成活性赤霉素，GA2ox降解活性赤霉素為無活性的形式，其與赤霉素含量密切相關(guān)，其中與調(diào)控株高最相關(guān)的赤霉素基因在這4類基因中都有研究，擬南芥5個AtGA20ox基因均屬于GA20ox，研究發(fā)現(xiàn)AtGA20ox1在對株高的影響上起主要作用^[13-14];水稻中，OsGA20ox2與株高密切相關(guān)^[15-16]。而對GAox-A、GAox-B、GAox-C、GAox-D這4個亞類的赤霉素氧化酶基因功能尚未明確。在香蕉中，通過前期篩選得到在假莖中起主要調(diào)節(jié)作用的赤霉素氧化酶基因為MaGA20ox基因家族的MaGA20ox4、MaGA20ox5，進一步對其在不同品種果實中的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，2個基因均存在品種表達差異，均在極幼果期表達量最高，這與幼果期果實生長發(fā)育快速的事實相符，而隨后的表達量變化與其在不同品種間發(fā)揮作用的模式相關(guān)。結(jié)合在不同品種間的表達量以及MaGA20ox基因家族在威廉斯香蕉果實中的表達分析^[5]，MaGA20ox4和MaGA20ox5可能不是果實中主要的MaGA20ox基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，MaGA2ox 12在‘8818和‘8818-1幼果中差異明顯，其可能是果指中調(diào)控赤霉素含量的主要基因^[5]。

在香蕉生產(chǎn)中，為了操作便利、防風等的需求，需要矮化香蕉品種，而矮化香蕉品種往往果指較短，影響了其商品性，因此得到假莖矮化而果指不變短的香蕉品種是生產(chǎn)上需求的，因此選取在假莖中起主要調(diào)控作用，而在果實中不起主要作用的赤霉素氧化酶基因是我們的目標，綜上分析MaGA20ox4和MaGA20ox5，特別是MaGA20ox4符合此特點，這為后續(xù)進行分子設計育種打下了基礎。

參考文獻

<！--[if ！supportLists]-->[1]?????? <！--[endif]-->Yang Y H， Zhang F M， Ge S. Evolutionary rate patterns of the gibberellin pathway genes[J]. BMC Evolutionary Biology， 2009， 9： 206.

<！--[if ！supportLists]-->[2]?????? <！--[endif]-->岳? 川， 曾建明， 曹紅利， 等. 高等植物赤霉素代謝及其信號轉(zhuǎn)導通路[J]. 植物生理學報， 2012， 48（2）： 118-128.

<！--[if ！supportLists]-->[3]?????? <！--[endif]-->Huang Y，Wang X，Ge S， et al. Divergence and adaptive evolution of the gibberellin oxidase genes in plants[J]. BMC Evolutionary Biology， 2015， 15： 207.

<！--[if ！supportLists]-->[4]?????? <！--[endif]-->Han F， Zhu B. Evolutionary analysis of three gibberellin oxidase genes in rice，Arabidopsis， and soybean[J]. Gene， 2011， 473（1）： 23-35.

<！--[if ！supportLists]-->[5]?????? <！--[endif]-->Chen J J， Xie J H， Duan Y J. Genome-wide identification and expression profiling reveal tissue-specific expression and differentially-regulated genes involved in gibberellin metabolism between Williams banana and its dwarf mutant[J]. BMC Plant Biology， 2016， 16（1）： 123.

<！--[if ！supportLists]-->[6]?????? <！--[endif]-->陳晶晶， 胡玉林， 龐振才， 等. 威廉斯香蕉矮化突變體矮化原因初探[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（11）： 2144-2150.

<！--[if ！supportLists]-->[7]?????? <！--[endif]-->DHont A， Denoeud F， Aury J M，et al. The banana （Musa acuminata） genome and the evolution of monocotyledonous plants[J]. Nature， 2012， 488： 213-217.

<！--[if ！supportLists]-->[8]?????? <！--[endif]-->Kamiya Y， Garcia-Martinez J. Regulation of gibberellin biosynthesis by light[J]. Current Opinion Plant Biology， 1999， 2（5）： 398-403.

<！--[if ！supportLists]-->[9]?????? <！--[endif]-->Olszewski N， Sun T P， Gubler F. Gibberellin signaling： biosynthesis， catabolism， and response pathways[J]. Plant Cell， 2002， 14（suppl）： S61-S80.

<！--[if ！supportLists]-->[10]??? <！--[endif]-->黃先忠， 蔣才富， 廖立力， 等. 赤霉素作用機理的分子基礎與調(diào)控模式研究進展[J]. 植物學通報， 2006， 23（5）： 499-510.

<！--[if ！supportLists]-->[11]??? <！--[endif]-->談? 心， 馬欣榮. 赤霉素生物合成途徑及其相關(guān)研究進展[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2008， 14（4）： 571-577.

<！--[if ！supportLists]-->[12]??? <！--[endif]-->Phillips A L， Ward D A， Uknes S，et al. Isolation and expression of three gibberellin 20-oxidase cDNA clones fromArabidopsis[J]. Plant Physiology， 1995， 108（3）： 1049-1057.

<！--[if ！supportLists]-->[13]??? <！--[endif]-->Rieu I， Ruiz-Rivero O， Fernandez-Carcia N，et al. The gibberellin biosynthetic genesAtGA20ox1andAtGA20ox2act， partially redundantly， to promote growth and development throughout theArabidopsislife cycle[J]. Plant Journal， 2008， 53（3）： 488-504.

<！--[if ！supportLists]-->[14]??? <！--[endif]-->吳建明， 陳榮發(fā)， 黃? 杏， 等. 高等植物赤霉素生物合成關(guān)鍵組分GA20-oxidase氧化酶基因的研究進展[J]. 生物技術(shù)通報， 2016， 32（7）： 1-12.

<！--[if ！supportLists]-->[15]??? <！--[endif]-->Qin X， Liu J H， Zhao W S，et al. Gibberellin 20-oxidase geneOsGA20ox3 regulates plant stature and disease development in rice[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2013， 26（2）： 227-239.

<！--[if ！supportLists]-->[16]??? <！--[endif]-->Qiao F， Chen Z. Alteration of rice growth and development via antisense expression ofOsGA20ox2gene[J]. African Journal of Biotechnology， 2013， 12（25）： 3898-3904.

責任編輯：黃東杰