三七PnAAE41基因的克隆、表達(dá)分析及原核表達(dá)

閆靜 向貴生 馮壘 楊梅 郭敏 張廣輝

摘? 要：草酰輔酶A合成酶參與了三七主要止血活性成分三七素的生物合成，研究三七草酰輔酶A合成酶基因（PnAAE41）的分子特征及表達(dá)特征，從而完善三七素生物合成途徑以及成分積累調(diào)控機(jī)制等方面的研究。以三七為實驗材料，在前期轉(zhuǎn)錄組研究基礎(chǔ)上，設(shè)計特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得1個三七AAE基因的cDNA全長。采用生物信息學(xué)方法分析其分子特性，通過qRT-PCR技術(shù)分析PnAAE41基因的時空表達(dá)特異性。通過異源表達(dá)探索進(jìn)行PnAAE41最佳蛋白最佳的誘導(dǎo)條件的探索，隨后以顏色反應(yīng)作為定性研究的基礎(chǔ)。序列分析結(jié)果表明，PnAAE41的開放閱讀框長度為1572 bp，編碼523個氨基酸，登錄號為MW242343。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，PnAAE41蛋白與擬南芥AtAAE蛋白親緣關(guān)系最近。預(yù)測PnAAE41蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，不含信號肽序列，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲占大部分比例。qRT-PCR分析表明，PnAAE41基因主要在根和莖中優(yōu)勢表達(dá)。異源表達(dá)最佳誘導(dǎo)條件為0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），16 ℃誘導(dǎo)9 h，該蛋白對草酸具有催化作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究AAE在三七素生物合成途徑中的功能提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：三七;草酰輔酶A合成酶;生物信息學(xué)分析;時空表達(dá);原核表達(dá)

中圖分類號：S567.23+6????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Clone and Prokaryotic Expression Analysis of Acyl-activating Enzyme Gene from Panax notoginseng

YAN Jing1，2，3， XIANG Guisheng1，2， FENG Lei1，2，3， YANG Mei3， GUO Min3， ZHANG Guanghui1，2*

1. National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasms Utilization & Innovation of Chinese Materials in Southwest/ ， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China; 2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Medicinal Plant Bio?logy， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China; 3. College of Agriculture and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract： Acyl-activating enzyme （PnAAE41） of Panax notoginseng is involved in the biosynthesis of dencichine，the main hemostatic active ingredient. The molecular characteristics and expression characteristics of Acyl-activating enzyme was explored to provide a basic theory for further research on the biosynthesis pathway of dencichine and the regulation mechanism of component accumulation. The full length of PnAAE41 gene was obtained by RT-PCR. The molecular properties was analyzed by bioinformatics methods. The spatio-temporal expression specificity of PnAAE41 gene was determined by real-time quantitative PCR. The heterologous expression was used to explore the optimal induction condition. The color reaction was used as the basis for qualitative research. The sequence analysis results showed that PnAAE41 was 1572 bp， encoding 523 amino acids， and the login number was MW242343. Phylogenetic analysis showed that PnAAE41 was most closely related to Arabidopsis AtAAE. PnAAE41 was predicted to be mainly located on the plasma membrane， which did not contain signal peptide sequence， and its secondary structure was mainly composed of alpha helix and random coil. The optimal induction condition was 0.5 mmol/L IPTG and 16 ℃ induction for 9 h. The protein had a catalytic effect on oxalic acid. The study would provide a theoretical basis for the further research on the role of AAE in the biosynthesis of dencichine.

Keywords： Panax notoginseng; acyl-activating enzyme; bioinformatics analysis; spatio-temporal expression; prokaryotic expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.008

三七[Panax notoginseng （Burk） F. H. Chen]為五加科人參屬多年生草本植物，以根及根莖入藥，是我國重要的中藥材大品種。三七具有散瘀止血、消腫定痛、防止腦缺血、止血、降脂和保護(hù)肝臟等功效，與人參共享“北參南七”的美譽(yù)。三七總皂苷廣泛用于治療冠心病、心絞痛、腦血管后遺癥和高血壓等。云南省一半以上的制藥企業(yè)需要三七為原料，其加工產(chǎn)品產(chǎn)值占云南醫(yī)藥產(chǎn)值的“半壁江山”，因此三七是云南乃至我國的中藥產(chǎn)業(yè)最重要的支柱品種。前期對于三七活性成分的研究主要集中于三萜皂苷，其他藥用成分則鮮有關(guān)注。三七素（dencichine）是一種非蛋白游離氨基酸，化學(xué)名稱為β-N-草酰-L-α，β-二氨基丙酸（β-N-oxalyl-L-α，β-diaminopropionic acid，β-ODAP），是云南白藥、三七止血片等藥品的有效成分，具有增加血小板數(shù)量、縮短凝血和出血時間的功效[1-2]。除三七外，三七素還存在于人參（Panax. Ginseng C. A. Meyer）、西洋參（Panax. Quinquefolius L.）等其他人參屬（Panax）植物以及山黧豆屬（Lathyrus）、豬屎豆屬（Crotalaria）等豆科植物中[3-6]。盡管三七素是三七的主要活性成分之一，但目前對其在三七中的生物合成機(jī)理、積累規(guī)律等研究未見相關(guān)報道。

Malathi等[7]在對家山黧豆（Lathyrus sativus L.）的研究中發(fā)現(xiàn)，草酰輔酶A（Oxalyl coenzyme A）與L-α，β-二氨基丙酸（L-α，β-diaminopropanoic acid， DAP）在ODAP合成酶作用下產(chǎn)生β-ODAP，這是三七素生物合成的最后一步，也是最為關(guān)鍵的一步反應(yīng)?，F(xiàn)已證實，家山黧豆ODAP合成酶屬于BAHD?；D(zhuǎn)移酶基因家族，能夠催化上述反應(yīng)，但其基因序列并未公布[8]。草酰輔酶A是由草酸和輔酶A在草酰輔酶A合成酶的作用下生成的，因此，草酰輔酶A合成酶也是三七素生物合成的關(guān)鍵酶之一。研究發(fā)現(xiàn)草酰輔酶A合成酶屬于酰基激活酶（Aacyl-activating enzyme，AAE）超家族，其中還包括長鏈?；o酶A合成酶（Llong-chain acyl-CoA synthetases， LACSs），4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligases，4CLs）和乙酰輔酶A合成酶（Aacetyl-CoA synthetase）[9-10]。

植物體內(nèi)合成草酰輔酶A是草酸分解代謝的一部分，能夠避免植物受到草酸鈣積累的傷害，并且在植物的非生物和生物脅迫反應(yīng)中都能發(fā)揮作用[11-12]。有研究從擬南芥（Arabidopsis thaliana L. Heynh.）[13]、蒺藜苜蓿（Medicago truncula L.）[14]、赤小豆（Vigna umbellate Thunb.）[15]與酵母（Saccharomyces cerevisiae）[16]中均克隆到1條草酰輔酶A合成酶基因，并對其功能進(jìn)行了驗證，但在三七中的研究及其在三七素合成中的功能則未見報道。本研究基于三七轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆到的1條草酰輔酶A合成酶基因PnAAE41，對其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步研究三七素的生物合成與積累調(diào)控機(jī)制等方面奠定基礎(chǔ)，為深入了解三七品質(zhì)形成機(jī)理提供了理論依據(jù)，也為在其他物種中三七素的生物合成提供數(shù)據(jù)線索。

1? 材料和方法材料與方法

1.1? 實驗材料與試劑

三七材料采自于云南省文山壯族苗族自治州硯山縣文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司（23°06′N，103°43′ E）。

二硫蘇糖醇（DTT）、磷酸烯醇丙酮酸（PEP）、肌激酶、還原型輔酶I（NADH）、1-甲氧基-5-甲基-吩嗪硫酸甲酯和四唑硝基藍(lán)購自麥克林公司;丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）購自索萊寶公司;輔酶A（CoA）為MedChemExpress公司產(chǎn)品;pET-28a載體、BL21（DE3）感受態(tài)購自上海唯地。

1.2? PnAAE41基因的鑒定與克隆

以33年生三七不同組織（根、莖、葉）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，從Pfam 33.1數(shù)據(jù)庫（http：//pfam. xfam.org/）下載AAE基因家族種子文件PF00501，利用HMMER v3.0軟件從三七轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取AAE同源序列，使用NCBI CDD（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具進(jìn)行手工校正，應(yīng)用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm. nih. gov/orffinder/）工具獲得基因的開放閱讀框，隨后同Pfam 33.1和SMART[17]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，獲得最終候選基因AAE。本研究中其他物種的氨基酸序列均來自于NCBI數(shù)據(jù)庫。

采集33年生三七的不同部位（根、莖、葉），參照難提植物總RNA小提試劑盒（MaGen）的操作說明提取三七總RNA，隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TakaraTaKaRa）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將獲得的cDNA于–80 ℃?zhèn)溆谩ＴO(shè)計特異性引物AAE41-F1和AAE41-R1對PnAAE41全長進(jìn)行擴(kuò)增（表1），反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL，上下游引物各1.6 μL，Q5 2×Master Mix 25.0 μL，加ddH2O補(bǔ)至總體積為50.0 μL;反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s（35個循環(huán)）;72 ℃ 2 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。將PnAAE41基因回收產(chǎn)物與pET-28a線性化載體進(jìn)行連接，熱激轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆菌株測序。

1.3? PnAAE41蛋白的生物信息學(xué)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Expasy Protparam（https：//web.expasy. org/ protparam）分析蛋白的理化性質(zhì);使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;通過PSORT（http：//psort1.hgc. jp/form.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測;利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP0）預(yù)測蛋白質(zhì)有無信號肽;使用GORIV（https：//npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/ secpred_ gor4.pl）預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu);利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/ interactive/Sbb BSU/ models）預(yù)測蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)模型。利用MAFFT v7.471軟件進(jìn)行氨基酸序列比對;IQ-TREE v2.1.1軟件用于構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹（模型：LG+F+R5），并使用EvolView 3（https：//www.evolgenius.info/ evolview/）進(jìn)行進(jìn)化樹編輯與美化。

1.4? PnAAE41基因的時空表達(dá)特異性分析

以Actin為內(nèi)參基因[18]，使用Primer 5.0工具設(shè)計qRT-PCR特異性引物AAE-F2和AAE-R2，Actin-F和Actin-R（表1）。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）試劑盒的反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR Mix 10.0 μL，加ddH2O補(bǔ)充至總體積為20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s（40個循環(huán)）;72 ℃ 30 s。采用2–△△CT法計算目的基因的相對表達(dá)量[19]。

1.5? PnAAE41重組蛋白的誘導(dǎo)及純化

將通過測序驗證的陽性菌株接種到含50 mg/L Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃ 200 r/min條件下過夜培養(yǎng)，按1∶100（V/V）的接種量接種后，同條件下培養(yǎng)至A600為0.6～0.8，隨后對不同誘導(dǎo)溫度（16、37、25 ℃）、不同誘導(dǎo)濃度（0.1、0.5、1.0 mmol/L）異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）與不同誘導(dǎo)時間（8、12、16 h）條件下蛋白誘導(dǎo)的最佳條件進(jìn)行了篩選。在最佳的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，4 ℃ 5000 ×g離心20 min收集菌體，用PBS（pH 8.0）重懸菌體;低溫高壓破碎細(xì)胞至菌液澄清透明，離心收集上清與沉淀。上清用0.45 μm濾膜過濾，然后按照天地人和Ni NTA Beads預(yù)裝柱純化說明書對其進(jìn)行純化;沉淀用PBS（pH 8.0）重懸;隨后對其進(jìn)行SDS-PAGE檢測，并分析蛋白表達(dá)情況。

1.6? PnAAE41蛋白催化活力檢測

反應(yīng)體系緩沖液中含有0.479 mg重組蛋白、NaPO4（pH 8.0）、DTT、MATP、MgCl2、CoA、NADH、PEP，以及肌激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶各10個單位，使用不同濃度（0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 μmol/L）的草酸溶液為底物進(jìn)行催化反應(yīng)，在室溫下孵育10 min后加入顯色劑1-甲氧基-5-甲基-吩嗪硫酸甲酯和四唑硝基藍(lán)。二硫化四唑鹽被用作NADH的顯色指示劑，如果PnAAE41蛋白能以測試的有機(jī)酸作為底物，那么隨著NADH的消耗其顏色會從紫色變?yōu)榈S色[20]，基于此，可以作為定性研究的基礎(chǔ)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? PnAAE41基因的鑒定與克隆

根據(jù)Pfam和SMART數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)域預(yù)測共獲得49條AAE同源基因，根據(jù)植物基因的命名方法將其命名為PnAAE1～PnAAE49，其中39條含有完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。以4條已驗證的具有草酰輔酶A合成酶功能的基因為參考序列[13-16]，利用IQ-TREE軟件將其與49條三七AAE同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示PnAAE41與已驗證有功能的基因聚為一支，其中PnAAE41與AtAAE親緣關(guān)系最近，與OsAAE親緣關(guān)系較遠(yuǎn);單子葉和雙子葉的AAE蛋白被分成兩個不同的分支蛋白被分成2個不同的分支（圖1）。為了進(jìn)一步揭示PnAAE41是否具有AAE型基因的典型結(jié)構(gòu)特征，將其與上述4條參考序列進(jìn)行了多序列比對，結(jié)果顯示，它們具有較高的序列相似性;其中PnAAE41具有典型的AMP結(jié)合域和乙酰輔酶A合成酶結(jié)構(gòu)域，并且在結(jié)構(gòu)域及其附近具有高度的保守性（圖2）。

以33年生葉的cDNA為模板，利用特異性引物AAE41-F1和AAE41-R1經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增與單克隆測序分析，序列結(jié)果顯示，其大小與預(yù)期結(jié)果一致，長1572 bp，編碼523個氨基酸。

2.2? PnAAE41的生物信息學(xué)分析

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，PnAAE41蛋白相對分子質(zhì)量56.32 kDa，等電點6.14，不穩(wěn)定指數(shù)33.51，平均親水性–0.024，屬于親水性蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，整個氨基酸肽鏈上沒有信號肽的存在，推測該蛋白屬于非分泌蛋白（圖3）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，PnAAE41蛋白具有多個亞細(xì)胞定位，其主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，在第50～100個氨基酸之間有2個跨膜螺旋區(qū)，推測該蛋白允許存在跨膜結(jié)構(gòu)域及其位點呈現(xiàn)（圖4）。

2.3? PnAAE41蛋白的二級與三級結(jié)構(gòu)分析

PnAAE41蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測結(jié)果顯示（圖5），PnAAE41蛋白主要以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主，其中無規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)類型所占比例最高，為47.99%;α螺旋的結(jié)構(gòu)類型比例為35.56%;延伸鏈所占比例最低，為16.44%。

通過SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測PnAAE41蛋白的三維結(jié)構(gòu)并構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型，以草酰輔酶A連接酶[5ie2.1.A]為參考模型，結(jié)果顯示（圖6），與模板蛋白序列的一致性為79.69 %，GMQE值為0.93，QMEAN為0.51。

2.4? PnAAE41基因的時空表達(dá)特異性

以Actin為內(nèi)參基因，對PnAAE41基因在三七不同生長年限、不同組織的相對表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示（圖7），PnAAE41基因在1年生三七葉中的相對水平最低，在根和莖中的相對表達(dá)水平較高，在22年生三七中，根中的表達(dá)水平較高，其次為莖，其中葉中表達(dá)水平最低。在33年生三七中，PnAAE41在莖中的表達(dá)水平高于根和葉。

2.5? 重組蛋白表達(dá)與催化活力分析

對測序驗證的陽性菌株進(jìn)行了表達(dá)條件的篩選，當(dāng)添加終濃度為0.5 mmol/L IPTG并在16 ℃、200 r/min下誘導(dǎo)9 h后，收集菌體并對其進(jìn)行破碎、純化、SDS-PAGE檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此條件下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量最多，其分子質(zhì)量約56 kDa，與預(yù)期的重組蛋白大小一致（56.32 kDa），其中上清中出現(xiàn)大小一致的蛋白特異條帶（圖8～圖9）。使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對濃縮后重組蛋白的濃度進(jìn)行了測定（479 μg/mL），并利用顏色可視化法來檢測其對草酸的催化性，結(jié)果顯示，PnAAE41蛋白催化草酸消耗了NADH，顏色從紫色變成淡黃色（圖10）。

3? 討論

三七素屬于非蛋白質(zhì)氨基酸，可通過增加體內(nèi)血小板數(shù)量并縮短凝血和出血的時間達(dá)到止血效果，被廣泛用于治療外傷出血，是云南白藥等

多種傳統(tǒng)藥方的有效成分。鄭鄧毅男等[21]對三種人參屬對3種人參屬（三七、人參、西洋參）植物都進(jìn)行了三七素含量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七素的含量以三七最高，人參次之，西洋參最低。三七素可能是人參屬植物特征性成分，該化合物容易被檢測到，因此可以作為人參屬植物化學(xué)分類的依據(jù)。前人對于三七素的研究僅涉及三七素液相質(zhì)譜檢測與提取方法，并且多集中在豆科植物家山黧豆中[22-26]。

關(guān)于草酰輔酶A合成酶在植物中代謝途徑的提出可以追溯到1961年[27]，但直到2012年這種酶才被發(fā)現(xiàn)。Foster等[22]描述了擬南芥?；せ蠲福ˋAE）基因，該基因編碼1種草酰輔酶A合成酶，能夠催化草酸分解代謝途徑的第一步，接著在蒺藜苜蓿、水稻、赤小豆與酵母中也發(fā)現(xiàn)了草酰輔酶A合成酶。在三七素合成途徑中，草酰輔酶A在最后一步中作為酰基供體進(jìn)行?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，與L-α，β-二氨基丙酸在BAHD?；D(zhuǎn)移酶作用下產(chǎn)生三七素，這是最為關(guān)鍵的一步反應(yīng)。我們基于三七轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到了1條草酰輔酶A合成酶基因PnAAE41并成功克隆，隨后對其理化性質(zhì)、表達(dá)特征進(jìn)行了分析。與已知的4種草酰輔酶A合成酶進(jìn)行氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)PnAAE41具有AAE型基因典型的AMP結(jié)合域和乙酰輔酶A合成酶結(jié)構(gòu)域，與擬南芥AtAAE具有86.05%的一致性。接著為了確定PnAAE41是否編碼草酰輔酶A合成酶，構(gòu)建了該蛋白的His標(biāo)記載體并在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，接著通過親和層析對獲得的蛋白進(jìn)行純化并利用顏色反應(yīng)檢測其催化功能。

AAE在草酸降解途徑中的作用是一個復(fù)雜的多信號互作過程，除了遺傳因素，還受到生長階段，組織部位等因素的影響。通過研究PnAAE41基因的組織時空特異性，發(fā)現(xiàn)該基因主要在三七根和莖中表達(dá)，與段紹鳳等[28]在研究三七素在三七植株的分布規(guī)律結(jié)果一致。本研究基于課題組前期對三七素的生物合成途徑做出的有根據(jù)的推測，成功克隆了候選基因PnAAE41，為深入研究三七素的生物合成提供了理論基礎(chǔ)。下一步將開展三七素合成途徑中所參與的BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶基因的異源表達(dá)及功能分析，繼續(xù)完善三七中三七素的生物合成途徑，為三七素生物合成途徑的闡明提供參考。

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責(zé)任編輯：黃東杰