張九國 袁智勇

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院放射治療科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心300060

0 引 言

目前，肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一。美國癌癥協(xié)會的數據顯示，2020年男性和女性肺癌患者的死亡人數均位列所有腫瘤的第一位[1]?？梢姡伟盒远群芨?。肺腺癌是發(fā)病率最高的肺癌類型之一，肺腺癌是肺小細胞癌的主要亞型，約占肺癌病例數的45%[2]。與肺鱗癌不同，肺腺癌起源于支氣管上皮，其發(fā)病率低于肺鱗癌[3]。近年來，肺腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，且多數患者確診患肺腺癌時即為晚期[4]。目前，肺腺癌的靶向治療主要是圍繞表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，GFR）突變和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合的基因畸變，針對這些基因畸變的個體化治療已成為標準治療方法[5]。但是，靶向治療后會產生耐藥性，導致病情急轉直下。因此，尋找新的生物標記物和潛在的治療靶點以提高肺腺癌的早期診斷率和治療效果迫在眉睫。

母胚亮氨酸拉鏈激酶 (maternal embryonic leucine zipper kinase，MELK)是一種蛋白質編碼基因，屬于磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）相關絲氨酸蘇氨酸激酶家族，該家族主要參與細胞周期調控、干細胞自我更新、凋亡和剪接調控等過程。它的初次鑒定可追溯到非洲爪蟾卵母細胞和胚胎[6]。MELK定位于染色體9p13.2，并且被證實在多種腫瘤組織中表達異常上調[7]。在部分腫瘤中,叉頭框盒白M1(forkhead box M1,FoxM1)，MYC原癌基因及其家族MYCN轉錄因子是導致MELK在癌癥中高表達的因素[7-10]。但MELK在肺腺癌中的具體機制仍不清楚。國內關于MELK在肺腺癌中的研究鮮有報道。值得一提的是，有文獻報道了MELK在肺腺癌中高表達，其中通過篩選尋找出了MELK[11]，其結果與本研究相似，但并未通過相關實驗驗證。本研究利用生物信息學方法分析MELK與肺腺癌的關系，并使用免疫組化法驗證其在組織中的表達情況，屬于獨立自主的研究。

本研究旨在探究MELK在肺腺癌組織中表達情況，以及MELK的表達對肺腺癌患者的臨床預后的影響，探求MELK作為肺腺癌潛在生物標記物和可能治療靶點的可能性，以期為肺腺癌早期診斷、靶向治療以及預后檢測等提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2014年7月至2019年7月，天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院收治的經手術治療的肺腺癌患者70例，年齡（52.70±6.87）歲。所有病例均經術后病理證，患者術前均未經化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤分化級別、原發(fā)灶-淋巴結-遠處轉移（tumor-node-metastasis，TNM）分期、淋巴結轉移情況。腫瘤分期根據2010年第7版國際抗癌聯(lián)盟和美國腫瘤聯(lián)合會聯(lián)合制定的TNM分期標準。本研究以1964年赫爾辛基宣言和隨后的所有修訂案中規(guī)定的道德標準為基礎，所有患者均已簽署知情同意書，本研究涉及的所有患者資料及標本采集工作均獲得了患者的知情同意。

1.2 主要材料與儀器

組化抗體Anti-MELK抗體、免疫組化生物素二抗（美國ThermoFisher公司），二氨聯(lián)苯胺（diamiobenzidine，DAB）顯色試劑盒（美國Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學檢測方法

收集的組織標本首先通過福爾馬林固定，再經石蠟包埋。石蠟標本在5℃下切片，在然后在65℃下烘烤40 min進行脫蠟。切片在磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中洗滌3次，每次2 min。將切片放入枸櫞酸緩沖液中，將抗原放入微波爐中還原（高火5 min，中火10 min）。然后除去多余的水，將H2O2滴在濕的盒子中15 min，用PBS緩沖液清洗2 min，重復3次。切片用4%的多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）溶液固定25 min，然后用2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液在PBS中室溫封閉20 min。切片用抗MELK抗體稀釋（1∶50~1∶500），4℃孵育過夜。切片在結合辣根過氧化物酶（h orseradish peroxidase，HR P）的生物素二抗中孵育，然后用DAB試劑盒進行染色反應。最后用中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。

每例患者的腫瘤組織及癌旁組織切片選取3個視野進行檢測，結果采用雙盲法判斷，組織切片中MELK的染色水平評定分為陽性細胞比例和染色強度兩項參數。陽性細胞比例評分標準：腫瘤細胞陽性百分數為0%時，記0分；1%~33%時，記1分；33%~66%時，記2分；＞66%時，記3分。陽性染色強度評分標準：陰性染色記0分；低度染色記1分；中度染色記2分；中高度染色記3分。以陽性細胞百分比評分和染色強度評分的乘積判斷表達情況，計分范圍為0~9分。結果＜1，記0分。1~3分為MELK低表達；4~9分為MELK高表達。

1.3.2 生物信息學分析

基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫的基因表達譜交互分析（gene expression profilinginteractive analysis，GEPIA）進行生物信息分析。差異基因的閾值為P＜0.05，log2FC＞1或＜-1，其中FC（fold change）為兩組間表達量的比值。同時，以中位數作為Kaplan-Meier生存分析的基礎，用虛線標記95%置信區(qū)間。

利用GEPIA（http://gepia.cancer pku.cn/detail.php?gene=melk/）分析MELK在肺腺癌和正常組織中的表達情況，以及肺腺癌組中MELK高表達、MELK低表達組與總體生存率和無病生存率之間的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 8.0軟件處理數據，定量數據以均值±標準差（Mean±SD）表示。兩組數據比較時，采用t檢驗分析；分析臨床病理特征與MELK表達之間的相關性時，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌中MELK的生物信息學分析結果

通過GEPIA數據庫，分析了483例肺腺癌組織和347名例癌旁正常組織，結果如圖1所示。結果表明，MELK的mRNA表達在肺腺癌組織中明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 肺腺癌組織和正常組織中母胚亮氨酸拉鏈激酶（MELK）的mRNA表達

此外，通過GEPIA數據庫進一步分析探討了MELK的表達與肺腺癌患者預后的潛在關聯(lián)，共分析了476例（總生存率）和240例（無病生存率）資料。結果表明，MELK高表達組的總生存率和無病生存率均明顯低于低表達組（均P＜0.05）（圖2）。上述結果提示，MELK的表達與患者的預后顯著相關。

圖2 MELK表達與肺腺癌患者生存率的相關性

2.2 MELK在肺腺癌組織中的表達

通過免疫組織化學染色方法檢測了70例經手術切除治療的肺腺癌患者的腫瘤組織及對應癌旁正常組織中MELK蛋白的表達情況。結果顯示，肺腺癌中的MELK的表達明顯高于癌旁正常組織。根據染色的強度，將肺腺癌患者分為高表達組和低表達組，發(fā)現(xiàn)MELK在癌旁正常肺組織中的表達量顯著降低（圖3）。以上結果均說明，MELK在肺腺癌的進展中發(fā)揮了重要的作用。

圖3 肺腺癌組織和癌旁正常組織中母胚亮氨酸拉鏈激酶（MELK）的免疫組化結果

2.3 MELK蛋白表達與肺腺癌患者的臨床病理特征相關性

為了進一步明確MELK在肺腺癌患者中的臨床意義，分析比較了MELK與肺腺癌的臨床病理特征之間的相關性。比較了MELK低表達組與高表達組肺腺癌患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結轉移。結果表明，MELK的表達水平與肺腺癌患者的腫瘤大?。≒=0.015）、腫瘤分期（P=0.006）顯著相關，而與年齡、性別、吸煙情況、腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況的相關性無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。（表1）

表1 母胚亮氨酸拉鏈激酶（MELK）蛋白表達與肺腺癌患者臨床病理特征的相關性分析

3 討論與結論

肺腺癌是肺癌中非小細胞型肺癌的主要亞型。目前基因表達譜分析已被廣泛用于鑒定和預測癌癥患者預后和生存的分子標志物。但遺憾的是，對與特定生存相關的關鍵基因的知識仍然非常有限[12]。尋找新的生物標記物進行早期診斷，并針對特定腫瘤找到潛在的治療靶點已成為當今一大研究熱點。1997年，研究者首次克隆了MELK cDNA，所克隆的激酶中還包含亮氨酸拉鏈基序，因此該激酶被稱為母胚胎亮氨酸拉鏈激酶（MELK）[13]。自此，針對MELK的研究拉開序幕。

目前，多項研究結果表明MELK在多種腫瘤中高度表達，包括腎癌、肝內膽管癌。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)MELK在Ⅳ期晚期透明細胞腎細胞癌組織標本中上調，并且MELK的上調與晚期疾病狀態(tài)顯著相關。Cigliano等[15]證實了MELK在肝癌腫瘤組織中的表達明顯高于相應的非腫瘤組織，且MELK的高水平與患者的短生存期有關。Maes等[16]發(fā)現(xiàn)MELK在彌漫性大B細胞淋巴瘤和套細胞淋巴瘤組織中高表達，且與彌漫性大B細胞淋巴瘤較差的臨床結果相關。本研究結果與上述結果一致，本研究結果顯示MELK與腫瘤大小、腫瘤分期都具有明顯的相關性，而免疫組化染色結果顯示MELK蛋白在肺腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。上述結果提示，MELK在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的進展和預后生存息息相關。

本研究結果初步證實了MELK與肺腺癌之間的關系，具體機制還有待進一步通過實驗來探究。研究者對MELK在其他腫瘤中的機制開展了大量研究。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA LINC02418在結直腸癌中顯著過表達，LINC02418通過吸收miR-1273g-3p充當ceRNA來上調MELK表達，LINC02418-miR-1273g-3p-MELK軸在結直腸癌的發(fā)生中起關鍵作用。對于MELK與肺腺癌的關系，Tang等[18]初步證實了MELK通過介導Slug、Twist1、基質金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）、N-catenin和E-catenin的表達介導肺腺癌細胞的轉移，通過PLK1-CDC25C-CDK1途徑調節(jié)G2/M期，參與抑制細胞凋亡。但是，在細胞凋亡方面，MELK與肺腺癌的機制目前仍尚不明晰。

綜上所述，本研究結果初步證實了MELK與肺腺癌之間的關系，為進一步探究MELK成為肺腺癌的潛在生物標志物和可能的治療靶點提供了一些思路。本研究采集的病理樣本共70例，樣本量不大，可能存在結果偏倚，下一步將構建生物模型并開展相關生物和細胞實驗，進一步探究MELK在肺腺癌中的作用，包括相關信號轉導通路、基因表達改變等，以期揭示MELK在肺腺癌中的具體機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突