二代測(cè)序技術(shù)在外源性眼內(nèi)炎患者病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用△

郝昕蕾 張依 李雪杰 金瑋 楊安懷

眼內(nèi)炎是一種嚴(yán)重威脅視力的眼部感染性疾病，及時(shí)準(zhǔn)確識(shí)別致病微生物對(duì)于疾病的臨床治療和管理具有重要意義，病原體培養(yǎng)仍是目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。近年來，宏基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)展迅速，理論上可以在一次測(cè)定中無差別地檢出臨床樣品中存在的所有病原體[1]，有助于疑難感染性眼病的早期診斷[3]。該技術(shù)不僅有望改善傳統(tǒng)微生物的檢測(cè)方法，還具有識(shí)別目前與眼內(nèi)炎無關(guān)的新型微生物的潛力。本研究著眼于二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于眼內(nèi)炎患者的可行性，并與傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)比，探討其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料對(duì)2018年11月至2019年11月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心就診的21例21眼外源性眼內(nèi)炎患者進(jìn)行回顧性病例分析。其中男17例，女4例，年齡7～87(52.24±21.97)歲。左眼13例，右眼8例。其中，眼外傷后14例(66.67%)，超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)后5例(23.81%)，后房型有晶狀體眼人工晶狀體植入術(shù)(ICL)后1例(4.76%)，經(jīng)睫狀體平坦部玻璃體切割術(shù)(PPV)后1例(4.76%)。所有患者入院時(shí)均已進(jìn)行視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、散瞳間接眼底鏡檢查，必要時(shí)行B超、眼前段照相、眼底照相等檢查和全身必要的輔助檢查等。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者近期有眼外傷史或內(nèi)眼手術(shù)史，確診為外源性眼內(nèi)炎；(2)眼內(nèi)膿性樣本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)和病原體培養(yǎng)兩種方法；(3)同意手術(shù)治療；(4)隨訪時(shí)間6個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者合并全身系統(tǒng)性疾病，診斷為內(nèi)源性眼內(nèi)炎；(2)眼內(nèi)膿性樣本僅進(jìn)行二代測(cè)序檢驗(yàn)或病原體培養(yǎng)任一種檢測(cè)方法；(3)拒絕手術(shù)治療；(4)隨訪時(shí)間不足6個(gè)月。本研究通過武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署手術(shù)知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法患者入院時(shí)使用廣譜抗生素進(jìn)行全身治療，根據(jù)病原學(xué)結(jié)果和藥敏試驗(yàn)調(diào)整用藥。局部用散瞳、抗感染滴眼液滴眼。入院后盡早手術(shù)，所有患者均進(jìn)行玻璃體內(nèi)注藥[10 g·L-1萬古霉素和(或)22.5 g·L-1頭孢他啶]。除2例患者無PPV必要外，其余患者均進(jìn)行PPV，術(shù)中盡可能清除前房及玻璃體內(nèi)膿性病灶及炎性滲出。根據(jù)眼內(nèi)感染及外傷情況決定異物取出方式、是否摘出白內(nèi)障、取出人工晶狀體、玻璃體內(nèi)填充硅油或視網(wǎng)膜激光光凝。

1.2.2 眼內(nèi)膿性樣本采集方法在23 G微創(chuàng)玻璃體手術(shù)中，確保灌注液未進(jìn)入玻璃體內(nèi)的情況下，旋開切割器的管道螺旋帽，連接注射器，踩動(dòng)腳踏板，抽取玻璃體內(nèi)膿液；或直接用1 mL注射器進(jìn)行前房穿刺抽取膿液[4]。前房標(biāo)本2份，玻璃體標(biāo)本19份，標(biāo)本低溫儲(chǔ)存于EP管中。

1.2.3 二代測(cè)序方法收集眼內(nèi)液樣本(房水或玻璃體液)≥200 μL，無菌密封，于-20 ℃儲(chǔ)存或干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行宏基因組二代測(cè)序檢測(cè)。取樣本200 μL參照天根DNA提取試劑盒(TIANGEN DNA Mini kit DP316，天根生化科技有限公司)說明書提取DNA并進(jìn)行純化。通過Qubit和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量。參照Qiagen的文庫構(gòu)建試劑盒(QIAseqTMUltralow Input Library Kit)操作手冊(cè)進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建。將帶有不同序列標(biāo)簽的合格DNA文庫匯集在一起，采用Illumina Nextseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后，通過過濾掉接頭、低質(zhì)量、低復(fù)雜度和較短的序列后生成高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。使用SNAP軟件去除匹配到人類參考基因組的人源序列，然后使用Burrow-Wheeler Alignment算法將剩余數(shù)據(jù)與微生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。最后得到樣品微生物組成。

1.2.4 視力評(píng)估方法利用Snellen或Feinbloom低視力表評(píng)估視力。將Snellen視力轉(zhuǎn)化為logMAR視力。非Snellen視力記錄如下：眼前數(shù)指規(guī)定為logMAR值為2.6，手動(dòng)的logMAR值為2.7，光感的logMAR值為2.8，無光感的logMAR值為2.9。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)描述與統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)入院視力和末次隨訪視力差異做配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon秩和檢驗(yàn))。對(duì)二代測(cè)序和病原體培養(yǎng)兩種方法檢出病原體陽性率的差異做卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征21例患者臨床特征見表1，均為單眼發(fā)病。18例有眼外傷史：金屬所致眼外傷10例，木棍撞擊傷2例，石頭撞擊傷1例,鉛筆傷1例。眼外傷伴眼球內(nèi)異物4例。7例有內(nèi)眼手術(shù)史：白內(nèi)障超聲乳化吸除術(shù)后5例，ICL植入術(shù)后1例，PPV術(shù)后1例?；颊呔驮\時(shí)間為0.1～30.0(4.84±6.81)d；除3例患者在10～30 d就診外，其余均在1周內(nèi)就診。所有內(nèi)眼手術(shù)后患者均以劇烈眼痛為主要癥狀就診。本研究納入的超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)后眼內(nèi)炎患者年齡均在65歲以上。

表1 眼內(nèi)炎患者的臨床特征及病原學(xué)結(jié)果

19例患者就診時(shí)屈光介質(zhì)混濁，間接眼底鏡無法獲取眼底特征，玻璃體內(nèi)表現(xiàn)以術(shù)中所見為準(zhǔn)。3例患者從眼外傷發(fā)生至我院就診在2～6 h之內(nèi)，其余患者前房和玻璃體內(nèi)均有積膿或滲出。所有患者均定期玻璃體內(nèi)注射萬古霉素和(或)頭孢他啶，19例患者行PPV，視病情決定具體手術(shù)方案。

2.2 眼內(nèi)感染控制情況與視力變化21例患者中，1例患者的眼內(nèi)感染未得到控制，行眼內(nèi)容物摘出術(shù)，其余20例患者眼內(nèi)感染均得到有效控制：眼痛等眼部刺激性癥狀消失，前房及玻璃體內(nèi)感染灶消除，眼底得以窺見。

患者入院視力與末次隨訪視力見表1。通過Snellen或Feinbloom低視力表評(píng)估視力，其中視力改善11例，視力不變8例，視力下降1例(眼內(nèi)容物摘出1例)。對(duì)患者入院視力和末次隨訪視力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(眼內(nèi)容物摘出患者除外)，末次隨訪視力有明顯提高(P=0.006)。

2.3 兩種病原學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果與陽性率術(shù)中留取眼內(nèi)膿性標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序和病原體培養(yǎng)兩種檢測(cè)方法，結(jié)果見表1。二代測(cè)序檢測(cè)病原體陽性率為95.24%(20/21)，病原體培養(yǎng)陽性率為42.86%(9/21)，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.480，P<0.001)。病原體培養(yǎng)陽性的9例標(biāo)本均培養(yǎng)出單種病原體；二代測(cè)序檢測(cè)病原體陽性測(cè)序的20例標(biāo)本中，13例標(biāo)本檢出單種病原體，7例標(biāo)本檢出兩種病原體。在培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中，其中8例(8/9,88.89%)與二代測(cè)序結(jié)果具有一致性，另一例利用二代測(cè)序檢出兩種病原體。

3 討論

眼內(nèi)炎是一種短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致視力不可逆性喪失的感染性眼病，包括外源性與內(nèi)源性兩大類，以前者多見，根據(jù)危險(xiǎn)因素不同，分為3類：內(nèi)眼手術(shù)后、眼外傷后、角膜感染相關(guān)眼病[2,5]。通過患者眼部表現(xiàn)及眼外傷或內(nèi)眼手術(shù)史，做出眼內(nèi)炎的臨床診斷，玻璃體液或房水培養(yǎng)結(jié)果支撐診斷，培養(yǎng)陰性不排除眼內(nèi)炎可能[2]。

外源性眼內(nèi)炎病情發(fā)展快，短時(shí)間內(nèi)迅速惡化，多可觀察到眼內(nèi)膿性病灶，本研究納入對(duì)象除3例眼外傷患者在6 h內(nèi)就診(見表1)，初診時(shí)前房清亮，其余患者均有前房炎癥反應(yīng)。相較于內(nèi)源性眼內(nèi)炎患者就診時(shí)間在數(shù)日至數(shù)個(gè)月不等，外源性眼內(nèi)炎患者多在1周內(nèi)就診。本研究中僅一例老年男性患者在右眼被鐵釘扎傷30 d后因眼部劇痛于我院就診，術(shù)后眼部及全身炎癥反應(yīng)重，在患者本人及家屬要求下，行眼內(nèi)容物摘出術(shù)。其余患者眼部感染均得到有效控制，保留眼球，提示及早就診，有利于控制眼部感染，挽救視力。

以往研究報(bào)道，病原體培養(yǎng)的陽性率為40%～70%[5-7]，部分眼內(nèi)感染無法明確病原微生物種類。二代測(cè)序技術(shù)具有無偏倚、覆蓋廣、快速等特點(diǎn)[7-8]。文獻(xiàn)指出，宏基因組測(cè)序與病原體培養(yǎng)、16S PCR在感染性眼內(nèi)炎病原體檢測(cè)中具有較高的一致性、敏感性和特異性，前者可在部分培養(yǎng)或PCR陰性的標(biāo)本中檢出病原體[5,9]。有學(xué)者在16例感染性角膜炎患者和4名對(duì)照組受檢者中發(fā)現(xiàn)18例樣本存在病原微生物感染[10]，測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)病原體的敏感性高[6]。本研究中，二代測(cè)序陽性率為95.24%，顯著高于病原體培養(yǎng)陽性率。

宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)范圍擴(kuò)大，可以檢出多種病原體，對(duì)多重感染的發(fā)現(xiàn)具有積極意義[5,9-11]；在明確少見病原體致病方面亦有重要價(jià)值，能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)手段無法鑒定的病原體[5,7,12]，有學(xué)者利用測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)2例豬皰疹病毒導(dǎo)致的人類眼部感染[13-14]。本研究中病原體培養(yǎng)均為單一病原微生物，二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)7例多重感染，均檢出兩種菌類。在測(cè)序覆蓋度足夠高的情況下，陰性結(jié)果有助于排除發(fā)生感染性疾病的可能[8,15]。本研究測(cè)序結(jié)果多為細(xì)菌單一或混合感染，病例16和18除外，結(jié)合臨床表現(xiàn)與檢出序列數(shù)，認(rèn)為前者為單一真菌感染，后者為細(xì)菌和真菌混合感染，加用玻璃體內(nèi)注射抗真菌藥物(迪爾達(dá)寧)治療。傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，尤其對(duì)真菌而言，大多數(shù)真菌生長(zhǎng)需要48～72 h，有時(shí)需2～4周產(chǎn)生孢子[16]。宏基因組測(cè)序周轉(zhuǎn)時(shí)間根據(jù)平臺(tái)而有所差異[16]，平均為48 h[8]，能較早得知病原微生物結(jié)果，及時(shí)調(diào)整用藥。

宏基因組測(cè)序技術(shù)局限性在于污染導(dǎo)致的假陽性，污染來源于試劑或環(huán)境中檢測(cè)到的背景微生物和人體正常菌群，生物信息分析或數(shù)據(jù)庫錯(cuò)誤等[15,17]。病例6為內(nèi)眼手術(shù)后患者，測(cè)序檢出戈登鏈球菌和伯克菌科兩類細(xì)菌，但后者致病性和流行病學(xué)尚未完全明確，暫不考慮其為真實(shí)致病菌。臨床醫(yī)生及微生物學(xué)者習(xí)慣了傳統(tǒng)培養(yǎng)簡(jiǎn)單輸出的二元結(jié)果，通常以檢出與未檢出進(jìn)行區(qū)分[7]，測(cè)序技術(shù)的假陽性要求醫(yī)生在采集樣本時(shí)遵守?zé)o菌原則，結(jié)合患者臨床特征和病原菌流行病學(xué)正確解讀報(bào)告，避免濫用抗微生物藥物。

宏基因組測(cè)序技術(shù)的另一缺陷是缺乏藥敏結(jié)果。盡管二代測(cè)序技術(shù)能較早檢出病原體，及時(shí)調(diào)整抗生素，但抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，缺乏藥敏結(jié)果仍無法實(shí)施精準(zhǔn)治療。目前已有文獻(xiàn)指出，宏基因組測(cè)序可以檢測(cè)毒力基因和耐藥基因，預(yù)測(cè)耐藥表型[7,9,15,17]。Doan等[9]對(duì)7例眼部感染巨細(xì)胞病毒的樣本進(jìn)行宏基因測(cè)序分析，并與斯坦福大學(xué)開發(fā)的抗巨細(xì)胞病毒藥物耐藥性數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)3例具有更昔洛韋和纈更昔洛韋耐藥性突變。

本研究也有其局限性:(1)研究對(duì)象具有選擇偏倚，部分患者如角膜潰瘍感染灶少，樣本量不足,無法同時(shí)進(jìn)行兩種檢測(cè)手段，或部分家庭無法承擔(dān)手術(shù)或檢測(cè)費(fèi)用等；(2)測(cè)序結(jié)果未經(jīng)熒光定量PCR驗(yàn)證；(3)部分測(cè)序數(shù)據(jù)缺失，未對(duì)序列數(shù)、覆蓋度等進(jìn)行定量分析，結(jié)果存在假陽性可能。

本研究證實(shí)，二代測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)臨床診斷為外源性眼內(nèi)炎但病原體培養(yǎng)為陰性的病原微生物。作為一種新興技術(shù)，可以與傳統(tǒng)的培養(yǎng)手段結(jié)合使用，共同指導(dǎo)臨床診治。臨床醫(yī)生應(yīng)合理使用該技術(shù)，避免濫用，正確解讀報(bào)告結(jié)果，在精準(zhǔn)醫(yī)療的道路上也需考慮經(jīng)濟(jì)醫(yī)療，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。