酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抗酸性、細(xì)胞膜 及膜蛋白的影響

李琳瓊，洪 靜，張麗君，高瑀瓏*

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

沙門氏菌屬是食品中常見的致病菌，在自然界分布廣泛，由其引起的食品中毒事件數(shù)量在食品中毒事件中常居首位[1]。食源沙門氏菌的爆發(fā)將對(duì)食品工業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的安全。在食品的生產(chǎn)、加工以及儲(chǔ)藏過程中，沙門氏菌常常會(huì)遭受酸、堿、溫度、滲透壓以及消毒劑等一系列不適環(huán)境的脅迫作用，誘發(fā)其產(chǎn)生脅迫應(yīng)激反應(yīng)來提高存活率[2]。食品工業(yè)中常采用各種滅菌方法來保證食品的微生物安全，其中利用有機(jī)酸來殺菌，因其溫和性、有效性及實(shí)用性等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足當(dāng)前消費(fèi)者對(duì)食品天然、新鮮、微加工及少添加劑等消費(fèi)需求，且由于其工業(yè)化應(yīng)用的易操作性和有效的滅菌效果，備受消費(fèi)者青睞，在食品工廠中已被廣泛應(yīng)用[3]。

微生物的耐酸性不僅受到遺傳因素的影響，還受到環(huán)境因素的影響[4]。微生物對(duì)不良環(huán)境因素產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制，一直是微生物研究熱點(diǎn)，然而，微生物對(duì)不適生存環(huán)境產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)制目前尚未研究清楚[5-6]，深入系統(tǒng)地研究食源性致病菌在食品加工環(huán)境中的酸脅迫響應(yīng)機(jī)制，以期為有機(jī)酸殺菌技術(shù)在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。Fernández等[7]研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌在經(jīng)有機(jī)酸調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，再置于70 ℃的高溫下處理，與對(duì)照菌株相比其D值明顯增加，說明酸適應(yīng)性菌株對(duì)高溫環(huán)境產(chǎn)生了抗性。Koutsoumanis等[8]將單增李斯特菌置于亞致死的弱酸中處理一段時(shí)間，發(fā)現(xiàn)其對(duì)強(qiáng)酸致死的抵抗作用提高。Yang Yishan等[9]認(rèn)為，微生物對(duì)不良環(huán)境產(chǎn)生的抗性與細(xì)胞膜流動(dòng)性之間具有一定的相關(guān)性，而微生物細(xì)胞膜脂質(zhì)的變化顯著影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性。細(xì)菌細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層與蛋白質(zhì)構(gòu)成的富有彈性的半透性薄膜。流動(dòng)的脂質(zhì)雙分子層是生物膜結(jié)構(gòu)的基本特征，適宜的流動(dòng)性是保證細(xì)胞進(jìn)行正常生理功能的重要條件[10]。 Liu Zhiwei等[11]研究表明，細(xì)胞膜的磷脂組成及其結(jié)構(gòu)一般會(huì)影響微生物細(xì)胞膜的流動(dòng)性。Chen Mingju等[12]研究發(fā)現(xiàn)，微生物處于高溫、低溫、酸和膽鹽等壓力環(huán)境下其蛋白的表達(dá)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，起到穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、維持細(xì)胞功能的作用。大多數(shù)微生物在不適生長的環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[13]。目前國內(nèi)外關(guān)于沙門氏菌抗酸性及其機(jī)制的研究不多見。李琳瓊等[14]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸、乳酸、醋酸和蘋果酸4 種有機(jī)酸脅迫均可誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190抗酸性增加，其中檸檬酸誘導(dǎo)能力最強(qiáng)。本研究以檸檬酸作為脅迫因素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190進(jìn)行多次脅迫處理，研究其抗酸性變化及其機(jī)制，然而迄今對(duì)微生物進(jìn)行多次酸環(huán)境條件脅迫研究其抗性及其適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚[15]。 本實(shí)驗(yàn)以食品生產(chǎn)加工中常見的鼠傷寒沙門氏菌為研究對(duì)象，研究酸脅迫作用下其抗酸性的變化及其與形態(tài)、細(xì)胞膜通透性、流動(dòng)性以及膜蛋白表達(dá)的關(guān)系，旨在綜合分析酸脅迫誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生抗酸性的變化及其機(jī)制，對(duì)優(yōu)化食品加工條件、加強(qiáng)食品安全預(yù)測(cè)及控制體系建立具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CGMCC 1.1190（簡(jiǎn)稱CGMCC 1.1190），購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

檸檬酸、氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鎂、鹽酸、氯仿、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、戊二醛、乙醇、冰乙酸、 甲醇，均為分析純；胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基 吳江康寧生命科學(xué)有限公司；LIVE/DEAD BacLightTM細(xì)菌活性試劑盒、400 目尼龍篩網(wǎng)、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、96 孔微量酶標(biāo)板、彩虹180廣譜蛋白Marker、TritionΧ-114、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%聚丙烯酰胺制膠液、5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R250 南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZΧ-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SF-CF-2A型超凈工作臺(tái) 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；PHS-3G型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所有限公司； EVO-LS10型掃描電子顯微鏡、A1正置熒光顯微鏡 德國ZEISS公司；K850型臨界點(diǎn)干燥儀 英國QUORUM公司；108AUTO鍍金儀 英國CRESSINGTON公司；FACSVerse型流式細(xì)胞儀 美國BD公司；DSC-8000差示掃描量熱儀 美國珀金埃爾默股份有限公司；ZF-258凝膠成像系統(tǒng) 上海金鵬分析儀器有限公司；JY-SCZ2+電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；ME55型塞多斯精密電子天平 北京塞多斯天平有限公司；SK-1型快速混勻器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)菌株CGMCC 1.1190經(jīng)活化后，接入pH 7.2的TSB培養(yǎng)基，于37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h后以1%（體積分?jǐn)?shù)，后同）的接種量轉(zhuǎn)接至150 mL新鮮的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期，菌體濃度約為1.0×108CFU/mL。

1.3.2 酸脅迫處理鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190

pH 3.0、2.7、2.5、2.0的TSB培養(yǎng)基的配制：以0.05 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基的pH值分別為3.0、2.7、2.5和2.0，滅菌備用。

CGMCC 1.1190的酸脅迫處理及其培養(yǎng)：分別取10 mL 1.3.1節(jié)活化后的CGMCC 1.1190培養(yǎng)液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄上清液，重懸于等體積的pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行酸脅迫處理，37 ℃處理30 min，分別按接種量1.5%、1.8%、2.0%將各個(gè)酸度脅迫處理后的CGMCC 1.1190菌種分別接種于100 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，再分別取10 mL培養(yǎng)液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于等體積的pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行酸脅迫處理，37 ℃下處理30 min；以此類推，重復(fù)上述搖床振蕩培養(yǎng)和酸脅迫處理共12 次后備用。

CGMCC 1.1190抗酸菌株的獲得：取上述pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中反復(fù)脅迫培養(yǎng)處理12 次的CGMCC 1.1190培養(yǎng)液100 mL，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水洗滌1 次，重懸于等體積的生理鹽水，調(diào)整菌懸液濃度為107CFU/mL，并將其分裝在于10 mL的無菌離心管備用。

1.3.3 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190抗酸性參數(shù)D值的測(cè)定

D值表示在一定的致死條件下殺死某種細(xì)菌數(shù)量的90%所需要的時(shí)間。D值越大，表明細(xì)菌對(duì)致死條件的抗性越強(qiáng)[16]。

分別測(cè)定1.3.2節(jié)中每次、每種pH值條件下酸處理5、10、15、20、25、30 min時(shí)的CGMCC 1.1190存活量，在TSA平板上按文獻(xiàn)方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[17]，共6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以酸處理的時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體存活量為縱坐標(biāo)，對(duì)此 6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行線性回歸分析，所得線性回歸方程的斜率的負(fù)倒數(shù)即為D值，分別測(cè)得CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5 TSB培養(yǎng)基中的D3.0、D2.7、D2.5，以線形回歸方程的決定系數(shù)R2來評(píng)價(jià)D值擬合優(yōu)度。不同pH值作用下，按照下式計(jì)算D值。

式中：D值表示在一定pH值作用下使CGMCC 1.1190的數(shù)量降低1 個(gè)對(duì)數(shù)單位所需的時(shí)間/min；t為酸處理時(shí)間/min；N0、Nt分別表示初始和酸處理t時(shí)間之后存活的CGMCC 1.1190菌的數(shù)量。

1.3.4 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190個(gè)體形態(tài)的觀察

對(duì)1.3.1節(jié)的原始對(duì)照菌株和1.3.2節(jié)得到的抗酸性CGMCC 1.1190菌株在TSA平板上培養(yǎng)48 h后，直接觀察CGMCC 1.1190的菌落形態(tài)；以無菌接種環(huán)挑取單菌落，用結(jié)晶紫和碘液進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察CGMCC 1.1190個(gè)體形態(tài)。

采用掃描電子顯微鏡對(duì)CGMCC 1.1190個(gè)體形態(tài)的觀察參照李小媚等[18]的方法，并做適當(dāng)修改。將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分?jǐn)?shù)1%分別接種于裝有100 mL TSB培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，離心（4 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，以生理鹽水洗滌2 次；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛浸沒菌體，振蕩3～5 min，使菌體與固定液充分接觸，室溫固定5 h，離心（4 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，加入緩沖液A（10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液， pH值7.2～7.4），振蕩5 min，離心（4 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，重復(fù)2 次；將離心管中的4 株菌株依次用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液離心（25 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，并重懸于無水乙醇中，靜置10 min；分別取10 μL上述樣品放置于蓋玻片上，采用臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥，將其固定在載物臺(tái)上，置于鍍金儀中真空噴金90 s，用掃描電子顯微鏡拍照。掃描電子顯微鏡使用的電壓為10 kV，在放大10 000 倍視野下進(jìn)行觀察。

1.3.5 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190 菌體細(xì)胞膜 通透性的測(cè)定

細(xì)菌細(xì)胞膜通透性測(cè)定原理參見文獻(xiàn)[19]。SYTO9是一種綠色熒光核酸染料，可以穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜與DNA結(jié)合；碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一種紅色熒光核酸染料，只能穿過不完整的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，兩種染料共同使用可以指示細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化。當(dāng)同時(shí)用SYTO9和PI進(jìn)行染色（SYTO9/PI雙染）的時(shí)候，PI染料會(huì)削弱SYTO9的熒光強(qiáng)度，在死亡細(xì)胞中，PI染料可以取代SYTO9染料與核酸結(jié)合。當(dāng)采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)菌懸液中經(jīng)SYTO9/PI雙染的CGMCC 1.1190細(xì)胞進(jìn)行掃描，會(huì)將不同的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的數(shù)據(jù)信號(hào)，經(jīng)計(jì)算處理形成雙參數(shù)的二維細(xì)胞流式散點(diǎn)圖。因此，將SYTO9/PI雙染法和流式細(xì)胞儀結(jié)合可用來判定菌體的活性狀態(tài)，得到細(xì)菌中活死細(xì)胞的比例，并指示細(xì)胞膜通透性的變化。

參照Wang Guangyu等[20]的方法測(cè)定CGMCC 1.1190菌體細(xì)胞膜通透性，并進(jìn)行適當(dāng)修改。具體方法如下：將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分?jǐn)?shù)1%分別接種于盛有10 mL新鮮滅菌TSB的試管中（20 mm×200 mm），37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于pH 2.0的TSB培養(yǎng)基中酸處理10 min，分別取1 mL的CGMCC 1.1190菌懸液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，用蒸餾水洗滌1 次，重懸于1 mL蒸餾水中，將500 μL的SYTO9與500 μL PI 染液混勻后加到上述4 種菌懸液中進(jìn)行染色。取1 mL未經(jīng)pH 2.0酸處理的原始對(duì)照菌株的CGMCC 1.1190菌懸液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于1 mL的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇反復(fù)振蕩處理1 h，離心（4 ℃、 5 000 r/min，10 min），棄去上清液，用蒸餾水洗滌1 次，重懸于1 mL蒸餾水，加入1 mL PI染液進(jìn)行染色。

將上述經(jīng)熒光染料染色的5 種菌懸液，在室溫暗處孵育30 min，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于2 mL蒸餾水，調(diào)整菌懸液的濃度為106～107CFU/mL，由400 目尼龍篩網(wǎng)過濾后，置于 流式細(xì)胞儀的進(jìn)樣針處，吸取單細(xì)胞進(jìn)入流動(dòng)室進(jìn)行檢測(cè)分析。流式細(xì)胞儀的激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長610 nm，以細(xì)胞流速為300粒子/s，計(jì)數(shù)10 000 個(gè)細(xì)胞。以未經(jīng)過染色的原始對(duì)照CGMCC 1.1190菌體細(xì)胞作為陰性對(duì)照組；以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液對(duì)原始對(duì)照組CGMCC 1.1190菌體細(xì)胞處理1 h后，再經(jīng)PI染色作為陽性對(duì)照組。

1.3.6 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190細(xì)胞膜磷脂相變溫度的測(cè)定

細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂相變溫度Tc的測(cè)定原理參見文獻(xiàn)[21]。采用差示掃描量熱儀測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂的相變溫度Tc，Tc指組成磷脂的?；溣晒虘B(tài)晶體向液體無定型態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)的臨界溫度，當(dāng)外界溫度超過Tc時(shí)，?；溁顒?dòng)性增強(qiáng)，細(xì)胞膜流動(dòng)性增大。

CGMCC 1.1190菌體細(xì)胞膜磷脂相變溫度的測(cè)定參照Casadei等[22]的方法，并作適當(dāng)修改。具體方法如下：分別配制無菌緩沖液A和無菌緩沖液B（10 mmol/L MgCl2與pH 7.5 250 mmol/L Tris）。將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分?jǐn)?shù)1%分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，分別各取1 000 mL的4 株菌株培養(yǎng)液，離心（4 ℃、3 000 r/min，15 min）、棄去上清液，用緩沖液B洗滌1 次，重懸于14 mL的緩沖液B中，加入20 mL氯仿和40 mL甲醇；37 ℃搖床振蕩30 min；再加入20 mL氯仿和20 mL緩沖液B，37 ℃搖床振蕩2 h。室溫靜置20 min，收集下層氯仿層，自然揮發(fā)12 h后，取10 mg樣品置于DSC-8000差示掃描量熱儀中，在-20 ℃條件下預(yù)冷35 min，以10 ℃/min梯度的程序升溫，測(cè)定CGMCC 1.1190在-10～60 ℃溫度范圍內(nèi)的細(xì)胞膜磷脂相變溫度。

1.3.7 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190菌體膜蛋白的測(cè)定

CGMCC 1.1190菌體膜蛋白的提?。篊GMCC 1.1190菌體膜蛋白的提取參照夏金蘭等[23]的方法，作適當(dāng)修改。方法如下：配制無菌緩沖液C（pH 7.4 50 mmol/L Tris-HCl），將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種于裝有10 mL新鮮滅菌的TSB試管（20 mm×200 mm）中，37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min）、收集菌體，用緩沖液C洗滌2 次，重懸于緩沖液C中；用超聲波處理5 min（超聲功率為300 W，15 s/次，間隔10 s），離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），取上清液再次離心（4 ℃、15 000 r/min，20 min）；加入8% TritionΧ-114浸沒沉淀，溶解30 min，離心（4 ℃、15 000 r/min，20 min），加入100 μL去離子水浸沒沉淀，溶解10 min，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分析CGMCC 1.1190菌體膜蛋白：采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上述CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株與3 株抗酸菌株膜蛋白質(zhì)量濃度，加入緩沖液A，將此4 株菌株膜蛋白溶液稀釋至5 μg/μL，將各菌株膜蛋白溶液與蛋白上樣緩沖液按照1∶1混勻，共100 μL，沸水浴10 min，各取10 μL分別加入電泳凝膠板的加樣孔中。使用5%濃縮膠和12%分離膠。濃縮膠的部分電壓設(shè)置80 V，電泳30 min，分離膠的部分電壓設(shè)置120 V，電泳90 min。采用考馬斯亮藍(lán)R250對(duì)凝膠染色2 h后，加入脫色液，脫色8 h，至各個(gè)電泳譜帶清晰可見后，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行掃描成像，并采用Image Lab 4.0.1軟件對(duì)所得SDS-PAGE圖譜進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0軟件處理，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸脅迫處理對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190 D值的影響

CGMCC 1.1190在檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中脅迫處理12 次后，D值的變化見表1。所有處理組D值的擬合度均較高（R2＞0.94）；CGMCC 1.1190在經(jīng)檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基反復(fù)酸脅迫后，隨處理次數(shù)的增加，D值增大，表明其對(duì)酸的抗性增加。在pH 2.5脅迫條件下，CGMCC 1.1190第1次酸處理后的D值為（5.15±0.31）min， 第12次熱處理后，D值增加到（196.08±0.45）min （P＜0.05），是第1次酸脅迫處理后的38.1 倍；在pH 2.7脅迫條件下，第12次酸脅迫后D值是第1次酸脅迫時(shí)D值的11.5 倍；在pH 3.0脅迫條件下，第12次酸脅迫后D值是第1次熱脅迫處理后的3.3 倍。在pH 2.5脅迫條件下，CGMCC 1.1190經(jīng)反復(fù)脅迫作用后抗酸性增加得最快。研究結(jié)果說明，CGMCC 1.1190經(jīng)酸脅迫后抗酸性增加，經(jīng)pH值為3.0、2.7、2.5反復(fù)酸脅迫處理12 次并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，D值隨酸脅迫次數(shù)的增加不斷增大，且脅迫pH值越低，D值越大，抗酸性越強(qiáng)。

表1 CGMCC 1.1190經(jīng)不同pH值的酸脅迫處理后D值的變化Table 1 Changes in D values of Salmonella typhimurium CGMCC 1.1190 under acid stress with different pHs

環(huán)境脅迫是指外界環(huán)境條件接近或超過生物體忍耐極限的脅迫作用[24]。酸對(duì)微生物的脅迫作用一直是微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，而微生物的抗酸性受種類、生長時(shí)期和環(huán)境因素的影響[25-26]。Cebrián等[27]通過對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行5、30、120 min的亞致死濃度的酸處理后，再置于強(qiáng)酸下，發(fā)現(xiàn)其對(duì)酸的抗性增強(qiáng)，這與本研究的結(jié)論一致。

2.2 酸脅迫處理對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190菌落形態(tài)的影響

CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中脅迫處理12 次后，其菌落形態(tài)的變化如圖1所示。在相同的稀釋倍數(shù)下，未經(jīng)酸脅迫處理的對(duì)照菌株CGMCC 1.1190培養(yǎng)48 h后，在TSA培養(yǎng)基上菌落較大、平坦、邊緣整齊、質(zhì)地均勻、呈乳白色，菌落正反面、邊緣與中央部位的顏色一致（圖1A）；經(jīng)過pH 3.0檸檬酸脅迫后，菌落形態(tài)與對(duì)照菌株差異明顯，部分菌落的直徑變小、，菌落隆起、表面濕潤、光滑、有光澤、菌落邊緣透明（圖1B）；經(jīng)pH 2.7、pH 2.5酸脅迫后，對(duì)照菌株相比，多數(shù)菌落直徑變得更小，菌落邊緣透明、與中央部位的顏色不一致（圖1C、D）。

圖1 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190經(jīng)酸脅迫前后的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of original strain and acid-resistant strains

2.3 酸脅迫處理對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190個(gè)體形態(tài)的影響

CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基脅迫處理12 次后，其在光學(xué)顯微鏡下個(gè)體形態(tài)的變化見圖2。未經(jīng)酸脅迫處理的對(duì)照菌株CGMCC 1.1190在顯微鏡下呈短桿狀或球狀（圖2A）；經(jīng)pH 3.0酸脅迫后的部分個(gè)體的形態(tài)明顯變長（圖2B）；而經(jīng)pH 2.7和pH 2.5酸脅迫后，大部分個(gè)體變?yōu)楦黠@的長桿狀，且酸脅迫的pH值越低，個(gè)體形態(tài)變化越明顯（圖2C、D）。

圖2 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190在光學(xué)顯微鏡下的個(gè)體形態(tài)（×1 000）Fig.2 Cellular morphology of S.typhimurium CGMCC 1.1190 under optical microscope (× 1 000)

CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中酸脅迫12 次后，其在掃描電子顯微鏡下個(gè)體形態(tài)的變化見圖3。與對(duì)照菌株CGMCC 1.1190相比，經(jīng)酸脅迫并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的菌株在掃描電子顯微鏡下個(gè)體形態(tài)變化明顯，對(duì)照菌株的個(gè)體形態(tài)呈典型的單短桿狀，外形飽滿，表面光滑，長度比較均勻一致（圖3A）；經(jīng)pH 3.0酸脅迫后，菌株長度差異變化明顯，部分菌株變?yōu)殚L桿狀（圖3B）；經(jīng)pH 2.7酸脅迫后的菌株個(gè)體變得更細(xì)長， 且在其表面產(chǎn)生了較多的黏液狀、膠質(zhì)狀的物質(zhì)，菌株聚集度增加（圖3C）；經(jīng)pH 2.5酸脅迫處理后細(xì)長的桿狀菌株，其表面粗糙，覆蓋膠質(zhì)狀物質(zhì)，多數(shù)菌聯(lián)結(jié)在一起（圖3D）。

圖3 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190在掃描電子顯微鏡下的個(gè)體形態(tài) （×10 000）Fig.3 Cellular morphology of S.typhimurium CGMCC 1.1190 under scanning electron microscope (× 10 000)

上述研究結(jié)果表明，CGMCC 1.1190酸脅迫株的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)與原始對(duì)照菌株相比差異顯著，這種形態(tài)的變化可能是其在酸脅迫環(huán)境下生存的一種自我保護(hù)方式。高璐等[28]以副溶血性弧菌為研究對(duì)象，對(duì)其在低鹽度、低pH值和高溫等條件下進(jìn)行適應(yīng)性傳代培養(yǎng)，通過掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)的變化，研究發(fā)現(xiàn)，低滲透壓可誘導(dǎo)其由短桿狀變成光滑的球體，低pH值影響了其表面的粗糙度。李忠新等[29]采用K-B法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，篩選出耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的菌株，抗藥菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比其個(gè)體形態(tài)變長。與對(duì)照菌株相比，本研究發(fā)現(xiàn)3 株抗酸性CGMCC 1.1190菌株的個(gè)體形態(tài)變長，菌落變?。浑S著脅迫pH值的降低，抗酸性菌株表面粗糙度增加，表面覆蓋膠質(zhì)狀物質(zhì)，表明酸脅迫環(huán)境對(duì)CGMCC 1.1190的個(gè)體形態(tài)產(chǎn)生較大影響，伴隨菌體形態(tài)的變化，同時(shí)生成一些保護(hù)性的分泌物，這有助于其在不適的酸性環(huán)境下增強(qiáng)生存能力。

2.4 酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190菌體細(xì)胞膜通透性的影響

CGMCC 1.1190在經(jīng)pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中反復(fù)脅迫的3 株抗酸性菌株重懸在pH值為2.0的TSB培養(yǎng)基中酸處理，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析的細(xì)胞流式散點(diǎn)圖如圖4所示。由圖4C～F中的Q3區(qū)可知，該區(qū)的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)占比均為0，表明在pH 2.0的強(qiáng)酸處理下對(duì)照菌株和3 株抗酸性菌株中所有細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性都發(fā)生變化。對(duì)照菌株和3 株抗酸性菌株置于pH值為2.0的強(qiáng)酸環(huán)境中處理10 min后，通過散點(diǎn)圖的4C～F的Q2區(qū)可知，在此區(qū)域內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性雖然發(fā)生一定程度的改變，經(jīng)過適應(yīng)期后仍能恢復(fù)活性而存活下來，存活細(xì)胞數(shù)的所占比例分別是62.6%、75.5%、87.4%和97.0%，說明隨著酸脅迫pH值的降低，能夠恢復(fù)活性的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)在明顯增加。由圖4C～F中的Q1區(qū)可知，將對(duì)照菌株和酸脅迫的3 株抗酸性菌株置于pH值為2.0的強(qiáng)酸環(huán)境中處理10 min后，對(duì)照菌株的死菌比例為33.8%；3 株抗酸性菌株死菌比例分別為23.2%、9.9%和2.9%，均明顯低于對(duì)照菌株的死菌比例，且隨酸脅迫pH值降低，死菌比例明顯降低，表明其抗酸性增強(qiáng)，抗H+的通透性增大。因PI只能穿過不完整的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，即PI染色區(qū)域的死菌比例越高，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性越大。

圖4 CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株及其分別經(jīng)不同pH值酸脅迫處理并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)12 次的抗酸性菌株的SYTO9/PI染色細(xì)胞流式散點(diǎn)圖Fig.4 Flow cytometric dot plots of unstained and SYTO9/PI stained cells of CGMCC 1.1190 and acid-resistant strains

在相同強(qiáng)酸致死環(huán)境下，經(jīng)過酸脅迫的3 株抗酸性菌株細(xì)胞膜的通透性顯著低于對(duì)照野生菌株細(xì)胞膜的通透性。因此推測(cè)，與對(duì)照野生菌株相比，經(jīng)過酸脅迫的3 株抗酸性菌株通過降低細(xì)胞膜通透性的方式限制了大量H+進(jìn)入菌體內(nèi)，減少了H+在菌體內(nèi)積累對(duì)細(xì)胞的毒害作用，從而降低了菌株細(xì)胞死亡比例。如圖4所示，隨著酸脅迫pH值降低，CGMCC 1.1190抗酸性菌株細(xì)胞偏離Q1區(qū)，死菌比例降低，進(jìn)入Q2區(qū)的抗酸性菌株細(xì)胞比例增加。本研究通過酸脅迫方式獲得的3 株抗酸性的菌株可能通過降低其細(xì)胞膜對(duì)H+、PI等的通透性，適應(yīng)強(qiáng)酸致死環(huán)境條件；通過提高其對(duì)更強(qiáng)的酸環(huán)境的耐受度，維持細(xì)胞正常的生理功能。

微生物在遭受不適應(yīng)生長的外界環(huán)境條件時(shí)，其細(xì)胞生理代謝活動(dòng)會(huì)發(fā)生改變。流式細(xì)胞技術(shù)是從細(xì)胞水平對(duì)將熒光染色的細(xì)胞個(gè)體進(jìn)行快速、多參數(shù)細(xì)胞定量分析技術(shù)，針對(duì)生物個(gè)體的細(xì)胞膜通透性、生理代謝活動(dòng)、凋亡周期等細(xì)胞特性，分選特定狀態(tài)的細(xì)胞群體[30]。 微生物在面臨不適生長的外界環(huán)境時(shí)其細(xì)胞膜通透性會(huì)發(fā)生改變，Nonv等[31]研究了抗生素處理的金黃色葡萄球菌和黃褐球菌細(xì)胞膜的通透性，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜通透性的增大是藥物處理細(xì)菌致死的機(jī)理之一。微生物細(xì)胞膜通透性的降低是細(xì)菌在脅迫條件下激活的一種生理保護(hù)性變化[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定的pH值范圍內(nèi)，CGMCC 1.1190抗酸性菌株的酸脅迫pH值越低，抗酸性越強(qiáng)，細(xì)胞膜通透性越低；酸脅迫后產(chǎn)生抗酸性菌株可能是通過降低細(xì)胞膜對(duì)H+的通透性，減少H+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，達(dá)到保護(hù)菌體的作用。

2.5 酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌 CGMCC 1.1190細(xì)胞膜磷脂相變溫度的影響

差示掃描量熱法可用于對(duì)微生物細(xì)胞膜磷脂相變的研究，測(cè)定其細(xì)胞膜磷脂的物理狀態(tài)變化時(shí)吸收或放出的熱量。CGMCC 1.1190在經(jīng)pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中反復(fù)酸脅迫12 次并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，獲得3 株抗酸性菌株的細(xì)胞膜脂類提取物的差示掃描量熱圖譜見圖5。圖5A～D中皆出現(xiàn)了一個(gè)峰，此峰值表示CGMCC 1.1190細(xì)胞膜磷脂的相變溫度（Tc），即磷脂的熔點(diǎn)（Tm）；未經(jīng)酸脅迫處理的對(duì)照菌株CGMCC 1.1190菌株的Tm為18.99 ℃，隨著CGMCC 1.1190抗酸性菌株的酸脅迫pH值從3.0降低至2.5，其磷脂的Tm從26.69 ℃增加到31.72 ℃，酸脅迫pH值越低，其磷脂的Tm越高。一定范圍內(nèi)，細(xì)胞膜磷脂的Tm越高，其流動(dòng)性越弱。與對(duì)照菌株相比，CGMCC 1.1190抗酸性菌株的細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，這種適應(yīng)酸性環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，阻礙環(huán)境中過多的H+進(jìn)入菌體內(nèi)，保證了細(xì)胞內(nèi)部正常的酸堿平衡，有利于其在酸脅迫環(huán)境中生存。

圖5 CGMCC 1.1190菌株細(xì)胞膜脂類提取物的差示掃描量熱圖譜Fig.5 Differential scanning calorimetry graphs for membrane lipids extracted from whole cells of CGMCC 1.1190 and acid-resistant strains

微生物為適應(yīng)外界生長環(huán)境條件的變化其細(xì)胞膜脂質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，磷脂的變化會(huì)影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)其細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響中起非常重要作用[33]。有研究表明，微生物細(xì)胞膜流動(dòng)性的降低有利于誘導(dǎo)其對(duì)熱、鹽或消毒劑等不適生存環(huán)境條件的抗性[34-35]。álvarez-Ordó?ez等[36]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可誘導(dǎo)微生物膜脂質(zhì)組成的變化，通過改變其細(xì)胞膜磷脂中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例來保證細(xì)胞膜正常的流動(dòng)性，維持正常的生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生菌株相比，3 株抗酸性CGMCC 1.1190菌株的磷脂相變溫度Tc皆升高，細(xì)胞膜流動(dòng)性降低；脅迫pH值越低，Tc也越高，膜流動(dòng)性越低，有利于菌株在強(qiáng)酸環(huán)境下調(diào)整細(xì)胞膜的流動(dòng)狀態(tài)而保持其正常生理功能。微生物膜脂質(zhì)雙分子層除了起到保護(hù)性屏障作用外，也是其與外界物質(zhì)、信息交流的過程中不可缺少的。因此，細(xì)胞膜在細(xì)菌的脅迫誘導(dǎo)抗性方面起到重要的作用，通過控制其流動(dòng)性來協(xié)調(diào)各種生命活動(dòng)的正常進(jìn)行，從而增強(qiáng)其生存能力。

2.6 酸脅迫對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190膜蛋白 表達(dá)的影響

膜蛋白是革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，以β桶狀結(jié)構(gòu)鑲嵌于細(xì)胞膜，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、各種物質(zhì)信息的交流以及致病性方面均起到非常重要的作用。本研究所分離的CGMCC 1.1190對(duì)照菌株及3 株抗酸性菌株的膜蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE分析得到圖6。這4 株CGMCC 1.1190菌株膜蛋白的分子質(zhì)量主要分布在25～180 kDa，但3 株抗酸性菌株與對(duì)照菌株在組成及其分子質(zhì)量分布上存在著較大差異。與對(duì)照菌株相比，隨著酸脅迫pH值的降低，對(duì)于3 株抗酸性菌株的膜蛋白，分子質(zhì)量在35～180 kDa的部分條帶顏色逐漸變深，說明此分子質(zhì)量范圍的膜蛋白表達(dá)量明顯提高；與對(duì)照菌株相比，抗酸性菌株在135 kDa 和180 kDa處增加了特異條帶，說明CGMCC 1.1190在酸脅迫下產(chǎn)生了某些抗酸性蛋白，這些蛋白可能是酸脅迫下與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的酸激蛋白。上述研究結(jié)果表明，pH 3.0、pH 2.7、pH 2.5酸脅迫可誘導(dǎo)CGMCC 1.1190一些膜蛋白表達(dá)量的增加或產(chǎn)生酸應(yīng)激蛋白。由此推測(cè)，這些相關(guān)蛋白表達(dá)可及時(shí)修復(fù)不適應(yīng)酸環(huán)境對(duì)其造成的分子損傷，導(dǎo)致酸脅迫菌株的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成得以正常進(jìn)行，最終使CGMCC 1.1190抗酸性菌株能夠在強(qiáng)酸環(huán)境中生存下來。

圖6 CGMCC 1.1190原對(duì)照菌株及其分別經(jīng)不同pH值酸脅迫并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的3 株菌株膜蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE patterns of outer membrane proteins in CGMCC 1.1190 and acid-resistant strains

酸性環(huán)境可以激活細(xì)菌的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列有利于細(xì)胞活性并參與調(diào)控的酸激蛋白，從而保護(hù)菌體并修復(fù)其損傷，維持細(xì)菌在脅迫條件下的存活。Shenoy等[37]對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在45 ℃下處理1 h后，該菌合成了特殊的膜蛋白，從而增強(qiáng)了對(duì)高溫的抵抗 能力。本研究發(fā)現(xiàn)，3 株抗酸性CGMCC 1.1190菌株一些膜蛋白表達(dá)量和組成也發(fā)生了變化，可能是酸脅迫下CGMCC 1.1190合成了與抗酸性相關(guān)的蛋白質(zhì)；這些膜蛋白是通過改變哪些代謝路徑來提高微生物對(duì)強(qiáng)酸環(huán)境產(chǎn)生的抗性，相關(guān)工作正在進(jìn)行。

3 結(jié) 論

CGMCC 1.1190經(jīng)pH 3.0、pH 2.7、pH 2.5反復(fù)酸脅迫處理12 次并轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后產(chǎn)生了抗酸性，與對(duì)照菌株相比，抗酸性菌株的個(gè)體形態(tài)、細(xì)胞膜通透性、流動(dòng)性和膜蛋白表達(dá)均發(fā)生了變化。在一定的pH值范圍內(nèi)，隨著酸脅迫pH值的降低，抗酸性菌株的個(gè)體形態(tài)變長，細(xì)胞膜的H+通透性降低，Tm升高，流動(dòng)性降低，分子質(zhì)量在35～180 kDa的部分膜蛋白表達(dá)量提高、表達(dá)種類增加，菌株抗酸性增強(qiáng)。綜上所述，CGMCC 1.1190在遭遇酸脅迫環(huán)境時(shí)會(huì)產(chǎn)生抗酸性，并通過改變自身個(gè)體形態(tài)、調(diào)整細(xì)胞膜通透性、流動(dòng)性及膜蛋白表達(dá)量來適應(yīng)酸脅迫環(huán)境，增強(qiáng)生存能力。