姜黃素調(diào)節(jié)Na/K-ATPase/Src信號通路保護LLC-PK1細胞缺氧復(fù)氧損傷

翟兵中，張麗婧，劉 臻，陳建國，胡志航，梅 松，胡文力，樓敏涵，王 茵，曲雪峰*

（杭州醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310013）

缺血性心臟病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的重要病因之一[1]。在圍手術(shù)期，心肌缺血和心肌梗死等心臟病并發(fā)癥是導(dǎo)致患者術(shù)后發(fā)病和死亡的主要原因。心臟早期再灌注是限制梗死面積的有效方法，但再灌注本身能夠誘導(dǎo)心肌凋亡，即心肌缺血再灌注損傷[2]。缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未完全闡明，之前的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷發(fā)生的最初幾分鐘內(nèi)，會產(chǎn)生一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過不同的機制最終導(dǎo)致心肌損傷和心肌細胞死亡。心肌缺血再灌注損傷在世界范圍內(nèi)都是一個有待解決的難題，目前尚無有效的治療方法[3]。

Na/K-ATPase是一種跨膜蛋白，通過偶聯(lián)腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水解運輸鈉離子和鉀離子進出細胞，從而建立并維持細胞膜內(nèi)外的離子濃度梯度。Na/K-ATPase除了發(fā)揮離子通道作用，以維持細胞內(nèi)外液滲透壓穩(wěn)定外，還具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[4-7]。 Na/K-ATPase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)具有放大活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的作用。強心苷類物質(zhì)與Na/K-ATPase結(jié)合[8-9]后，可以使Na/K-ATPase由E1構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)镋2構(gòu)型，從而增加類固醇受體輔助活化因子（steroid receptor coactivator，Src）活性，并激活Src下游信號通路細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk）1/2，產(chǎn)生大量ROS[10-11]。Cui Χiaoyu等[7]的研究證明，ROS可以使Na/K-ATPase轉(zhuǎn)變?yōu)镋2構(gòu)型，激活信號通路中的Src和Erk1/2，并觸發(fā)信號級聯(lián)產(chǎn)生大量ROS，增加的ROS進一步激活Na/K-ATPase/Src信號通路，形成Na/K-ATPase/Src/Erk1/2/ROS放大環(huán)路。這一過程可能與缺血再灌注等一些疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。

姜黃素是從植物姜黃的根莖中分離出來的一種重要的多酚類生物活性成分，具有抗炎、抗細胞凋亡、抗細胞增殖、抗氧化等作用。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，姜黃素對心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死、高血壓、糖尿病心肌病等具有保護作用[12]，但是在以往研究中，關(guān)于姜黃素對缺血再灌注損傷的保護作用機理主要集中于姜黃素的抗凋亡和抗炎作用，對其他作用機制尚不明確。本研究在細胞水平通過細胞缺氧復(fù)氧模型損傷模擬細胞氧化應(yīng)激損傷，利用富含Na/K-ATPase的豬腎上皮細胞LLCPK1細胞探索Na/K-ATPase/Src信號通路在缺氧復(fù)氧損傷中的作用，探究姜黃素減輕細胞缺氧復(fù)氧損傷的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬腎上皮LLC-PK1細胞由南京凱基生物發(fā)展有限 公司提供。

Na/K-ATPase、ATP、姜黃素、烏苯苷、上樣緩沖液 美國Sigma公司；胎牛血清 加拿大維森特公司；胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 杭州 吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；BIOMOL?Green Reagent磷酸鹽顯色試劑盒 日本關(guān)東化學(xué)株式會社；Erk抗體、p-Erk抗體 美國Cell Signaling公司； Src抗體 美國Santa公司；p-Src抗體 美國Invitrogen公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 杭州賢至生物科技有限公司；熒光二抗 美國Abcam公司； 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；M199培養(yǎng)液 美國Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1 FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；BB150 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific 公司；5417R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Spectra Max M4多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描儀 美國 Li-Cor公司。

1.3 方法

1.3.1 Na/K-ATPase活力測定

用比色法測定Na/K-ATPase活力。向EP管中加入20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、1 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L KCl、1 mmol/L EDTATris各50 μL混勻，再加入不同濃度（0、0.01、0.1、1、10 μmol/L）姜黃素50 μL，以加等體積1 mmol/L烏本苷作為陰性對照，每管加入Na/K-ATPase 2 μg，于37 ℃孵育10 min后，加入50 μL 20 mmol/L ATP開始反應(yīng)。37 ℃再次孵育10 min后加入1 mL預(yù)冷8%三氯乙酸溶液終止 反應(yīng)，并將其置于冰上，反應(yīng)生成的磷酸用磷酸鹽顯色試劑盒測定。用酶標(biāo)儀于620 nm波長處測定OD值，不同組別磷酸生成量利用各組測得OD值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出。以每小時每毫克Na/K-ATPase分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為一個酶活力單位。Na/K-ATPase活力按式（1）計算。

式中：1/6為反應(yīng)時間/h；0.002為Na/K-ATPase質(zhì)量/mg。

1.3.2 Na/K-ATPase構(gòu)型分析

向EP管中加入20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、1 mmol/L MgCl2、NaCl/KCl混合液（含100 mmol/L NaCl、20 mmol/L KCl）、1 mmol/L EDTA-Tris各50 μL混勻，每管加入2 μg Na/K-ATPase、10 μmol/L姜黃素50 μL、不同濃度（0.01、0.02、0.04、0.1、0.3、1、10 μmol/L）Na/K-ATPase活力抑制劑釩酸鈉50 μL，作為實驗組；以加入50 μL 1 mmol/L烏本苷為陰性對照組，僅添加釩酸鈉、不添加姜黃素為空白組。然后，加入50 μL 20 mmol/L ATP溶液于37 ℃反應(yīng)10 min，然后加入質(zhì)量分數(shù)8%三氯乙酸終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀于620 nm波長處測定OD值。烏本苷敏感Na/K-ATPase活力按式（2）計算，根據(jù)其分析姜黃素對Na/K-ATPase構(gòu)型的影響。

1.3.3 LLC-PK1細胞培養(yǎng)和缺氧復(fù)氧損傷處理

將LLC-PK1細胞用含10%胎牛血清和雙抗（青霉素和鏈霉素各100 U/mL）的M199培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長至70%～80%融合進行實驗[13]。細胞經(jīng)無血清M199培養(yǎng)基饑餓過夜，培養(yǎng)12 h后LLC-PK1細胞經(jīng)姜黃素+烏本苷或姜黃素預(yù)保護1 h后缺氧1 h復(fù)氧3 h不同處理。缺氧復(fù)氧模型為細胞置于5% CO2、95% N2的濕化環(huán)境中1 h，然后更換為含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，并置于5% CO2、95%空氣的環(huán)境中復(fù)氧3 h。

1.3.4 MTT法測定H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激LLC-PK1細胞活力

利用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒測定細胞活力。LLC-PK1細胞以1×104個/孔接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，經(jīng)10 μmol/L 姜黃素預(yù)保護1 h，然后分別加入50、100、200、400、500 μmol/L H2O2作用24 h后，每孔內(nèi)加入15 μL 5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃處理4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加200 μL二甲基亞砜，將96 孔板置于搖床上室溫慢搖10 min，使形成的深紫色晶體完全溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定OD值。以加姜黃素、無細胞的完全培養(yǎng)基為空白組，不加H2O2其余處理相同為陰性對照組，每組6 個復(fù)孔。細胞存活率按式（3）計算。

1.3.5 LDH活力測定

LLC-PK1細胞以1×104個/孔接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，經(jīng)10 μmol/L姜黃素預(yù)保護1 h后，缺氧1 h、復(fù)氧3 h處理，5 000 r/min離心10 min，收集細胞上清液。以未經(jīng)缺氧復(fù)氧處理的細胞為對照組，按試劑盒檢測上清液中LDH活力，以每升上清液于37 ℃與反應(yīng)基質(zhì)作用15 min反應(yīng)體系中產(chǎn)生 1 μmol丙酮酸為一個酶活力單位，單位為U/L。

1.3.6 蛋白免疫印記分析

細胞于10 μmol/L姜黃素溶液中分別暴露15、30 min和60 min。棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗2 次，靜置2 min，吸棄殘留液體，重復(fù)吸取2 次，盡可能將液體全部吸出（全程冰上操作）。配制細胞裂解液（V（RIPA裂解液）∶m（100×磷酸酶抑制劑）∶m（100×蛋白酶抑制劑）＝100∶1∶1）。每瓶細胞加入300 μL上述細胞裂解液，用細胞刮刀將培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞充分刮下至1.5 mL EP管中，用細胞超聲破碎儀超聲10 s，提取細胞中總蛋白。4 ℃、13 500 r/min離心15 min，取上清液用于后續(xù)實驗。利用BCA法測定蛋白濃度。上樣量80 μg，計算體積后將各組用RIPA裂解液補至相同體積，加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，將處理好的蛋白樣品100 ℃加熱5 min使蛋白變性。蛋白經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉，加入Src、p-Src、Erk、p-Erk以及GAPDH等抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜，含0.05% Tween-20的PBS清洗3 次，每次10 min，加入二抗（兔源性多克隆1∶10 000），室溫避光孵育1 h。掃描儀掃描薄膜，用Odyssey 4.0軟件分析條帶灰度，以GAPDH作內(nèi)參，計算各蛋白相對表達水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 26.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較用Student’s檢驗，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05認為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素對Na/K-ATPase活力的影響

已有研究表明姜黃素可調(diào)節(jié)跨膜P型ATPase活力[7]。 由圖1可知，與對照組（0 μmol/L）相比，0.1、1、10 μmol/L姜黃素可以顯著降低Na/K-ATPase活力 （P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），且呈劑量依賴性。姜黃素濃度為10 μmol/L時，Na/K-ATPase活力降低至對照組的69%。

圖1 姜黃素對Na/K-ATPase活力的影響Fig.1 Effect of curcumin concentration on Na/K-ATPase activity

2.2 姜黃素對Na/K-ATPase構(gòu)型的影響

研究表明，10 μmol/L姜黃素能夠有效抑制馬來酸誘導(dǎo)的LLC-PK1細胞氧化應(yīng)激損傷[14]，同時也可以通過調(diào)控Notch信號通路減輕心肌細胞缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷[15]。因此，本實驗選擇10 μmol/L的姜黃素進行后續(xù)研究。Na/K-ATPase存在E1和E2兩種構(gòu)型，可以通過E1和E2構(gòu)型間的轉(zhuǎn)換來調(diào)節(jié)Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路。釩酸鹽不能與E1構(gòu)型結(jié)合，但能與E2構(gòu)型結(jié)合，釩酸鈉與Na/K-ATPase結(jié)合使其穩(wěn)定在E2狀態(tài)并由此抑制Na/K-ATPase活性。由圖2可知，釩酸鈉呈劑量依賴性降低Na/K-ATPase活力。而釩酸鈉與姜黃素（10 μmol/L）共同處理可部分恢復(fù)Na/K-ATPase活力，表明Na/K-ATPase處于E2構(gòu)型過度累積的狀態(tài)時，姜黃素可使Na/K-ATPase從E2構(gòu)型向E1構(gòu)型轉(zhuǎn)換，因此，姜黃素具有一定的雙向調(diào)節(jié)功能。

圖2 Na/K-ATPase抑制劑存在時姜黃素對Na/K-ATPase活力的影響Fig.2 Effect of curcumin concentration on Na/K-ATPase activity in the presence of Na/K-ATPase inhibitors

2.3 姜黃素對Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路的調(diào)節(jié)作用

LLC-PK1細胞中Na/K-ATPase表達豐富，常被用于Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路研究。通過測定Src（Y418位點）和Erk1/2磷酸化水平，分析LLC-PK1細胞暴露于姜黃素后Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路中Src和Erk1/2活性變化，以未處理的正常細胞為對照組。由圖3A、B可知，與未經(jīng)姜黃素預(yù)處理的對照組（0 min）相比，LLC-PK1細胞于10 μmol/L姜黃素溶液中暴露15、30 min和60 min后，Src和Erk1/2磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05），且沒有明顯的時間效應(yīng)。有研究表明，烏本苷可誘導(dǎo)Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路激活[7]。由圖3C、D可知，姜黃素顯著抑制了烏本苷誘導(dǎo)的Src和Erk1/2磷酸化水平升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，姜黃素可能對Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路可能具有雙向調(diào)節(jié)作用，即姜黃素單獨存在時可激活Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路，而該通路被過度激活時，姜黃素抑制Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路活化。

圖3 姜黃素對Na/K-ATPase/Src/Erk1/2信號通路中Src和 Erk1/2磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用Fig.3 Curcumin regulated the phosphorylation of Src and Erk1/2 proteins in the Na/K-ATPase/Src/Erk1/2 signaling pathway

2.4 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激LLC-PK1細胞存活率的影響

在細胞缺氧復(fù)氧時將產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，本實驗利用H2O2模擬氧化應(yīng)激損傷。由圖4可知，不同濃度H2O2作用LLC-PK1細胞24 h后，H2O2以劑量依賴的方式降低細胞活力，而經(jīng)10 μmol/L姜黃素預(yù)保護1 h，可明顯提高H2O2誘導(dǎo)的細胞存活率降低，表明姜黃素對H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。

圖4 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激LLC-PK1細胞存活率的影響Fig.4 Effect of curcumin on cell viability of H2O2-induced LLC-PK1 cells

2.5 姜黃素對LLC-PK1細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用

LDH是存在于動植物細胞質(zhì)中的氧化還原酶，其在細胞中穩(wěn)定表達，是機體能量代謝中一種重要的酶。當(dāng)機體組織器官病變時，其組織內(nèi)源性LDH活力發(fā)生改變，因此，可作為細胞毒性指標(biāo)，常被用于評價組織和細胞的受損情況。由圖5可知，與對照組正常細胞相比，缺氧復(fù)氧組LLC-PK1細胞釋放LDH的量明顯增多，細胞上清液中LDH活力高度顯著增大（P＜0.001），而姜黃素預(yù)保護組缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的LDH釋放量增多明顯被抑制，與缺氧復(fù)氧組相比差異極顯著（P＜0.01）。表明姜黃素能夠保護缺氧復(fù)氧處理導(dǎo)致的細胞受損。

圖5 姜黃素對缺氧復(fù)氧損傷LLC-PK1細胞中LDH活力的影響Fig.5 Effect of curcumin on extracellular LDH activity of LLC-PK1 cells subjected to H/R

2.6 姜黃素保護LLC-PK1細胞氧化應(yīng)激損傷的可能機制

研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以激活Na/K-ATPase/Src/Erk信號通路，并進一步促進ROS產(chǎn)生，擴大氧化損傷[16-17]。在細胞缺氧復(fù)氧過程中會產(chǎn)生大量的ROS（包括H2O2）。Cui Χiaoyu等[7]研究發(fā)現(xiàn)H2O2具有類似烏苯苷的作用，通過結(jié)合Na/K-ATPase E2構(gòu)型抑制Na/K-ATPase活性并激活Src蛋白。由圖6A可知，與對照組（未經(jīng)缺氧復(fù)氧處理的細胞）相比，在細胞缺氧復(fù)氧過程中，Src蛋白磷酸化水平顯著增加，而姜黃素預(yù)保護能夠顯著降低缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的Src磷酸化水平升高（P＜0.05）。由圖6B可知，與對照組相比，缺氧復(fù)氧過程使磷酸化Erk1/2蛋白表達水平顯著增加，而姜黃素預(yù)處理抑制了缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的Erk磷酸化水平升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，姜黃素可能是通過影響Na/K-ATPase/Src/Erk信號通路的活化保護LLC-PK1細胞免受缺氧復(fù)氧損傷。

圖6 姜黃素對缺氧復(fù)氧損傷LLC-PK1細胞中Src（A）、 Erk1/2磷酸化（B）的影響Fig.6 Effect of curcumin on phosphorylation levels of Src (A) and Erk1/2 (B) in LLC-PK1 cells subjected to hypoxia/reoxygenation

3 討 論

臨床和營養(yǎng)流行病學(xué)研究表明，長期攝入多酚類物質(zhì)姜黃素可以預(yù)防心血管疾病并降低引發(fā)心血管疾病的病理因素[18]。自發(fā)性高血壓大鼠口服姜黃素12 周 能明顯降低心臟左室中結(jié)締組織生長因子、III型膠原蛋白、纖連蛋白的表達，并上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ活性，從而緩解高血壓引起的心肌纖維化[19]。心肌梗死過程中產(chǎn)生大量的氧自由基，誘導(dǎo)心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，損傷心臟組織[20-21]，姜黃素的抗氧化功效可以減少體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，產(chǎn)生抗凋亡作用，抵抗心肌梗死誘導(dǎo)的心臟功能失調(diào)[22]。對豬冠狀動脈血管內(nèi)皮功能障礙的研究顯示，姜黃素可以阻礙同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴血管舒張功能障礙，降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶水平，并減少超氧陰離子自由基的產(chǎn)生，從而緩解血管內(nèi)皮功能失調(diào)[23]。這些功效表明，以姜黃素作為日常膳食的主要成分有助于預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。

姜黃素的心臟保護作用可能在于其可以直接影響多種酶。已有研究表明，姜黃素可以調(diào)節(jié)P型ATPase活性。姜黃素通過抑制肌漿網(wǎng)上Ca2+-ATPase可以緩解膽囊纖維化[24-25]。Na/K-ATPase是維持心肌細胞內(nèi)外離子濃度和心臟功能的重要酶[26]，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以與Na/K-ATPase發(fā)生直接的相互作用，因此姜黃素可能作為Na/K-ATPase的重要受體之一而發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)在Na/K-ATPase活性篩選反應(yīng)體系中，姜黃素能明顯抑制Na/K-ATPase活性，且表現(xiàn)出劑量依賴性。而當(dāng)有Na/K-ATPase活性抑制劑釩酸鈉存在時，姜黃素能促使Na/K-ATPase由E2構(gòu)型向E1構(gòu)型轉(zhuǎn)變。表明姜黃素對Na/K-ATPase活性具有雙向調(diào)節(jié)作用，是Na/K-ATPase的不完全促進劑。

心臟缺氧復(fù)氧過程中會產(chǎn)生大量ROS，其中的H2O2具有與烏本苷類似的作用，可抑制Na/K-ATPase活性，激活Na/K-ATPase/Src信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步作用線粒體產(chǎn)生ROS[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素作為Na/K-ATPase不完全促進劑，對缺氧復(fù)氧過程導(dǎo)致的Na/K-ATPase/Src受體復(fù)合物的過度激活具有保護作用，即缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)Na/K-ATPase/Src/Erk信號通路活化，使Src和Erk1/2磷酸化水平升高，而在該受體復(fù)合物被過度激活時，姜黃素則可以抑制其激活，從而發(fā)揮保護細胞損傷的作用[30]。

因此，本研究通過分析姜黃素對缺血再灌注引起的細胞損傷的保護作用以及姜黃素對細胞中Na/K-ATPase/Src信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，闡明姜黃素作為不完全促進劑，通過調(diào)節(jié)Na/K-ATPase/Src/受體復(fù)合物活性保護細胞免受損傷。為評估姜黃素在治療心血管疾病相關(guān)的營養(yǎng)膳食中的潛在效用、開發(fā)姜黃粗提物及其他姜黃中的有效化合物成分作為營養(yǎng)膳食提供了依據(jù)。