羧甲基普魯蘭多糖螯合鈣的制備及其功效評(píng)價(jià)

李海鷹，楊祥禾，魏珍珍，賈 蓓，楊文智*

（河北大學(xué)藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

鈣是人體所含最豐富的營養(yǎng)素，且參與了一系列生理過程，如骨骼發(fā)育、血管收縮、血管擴(kuò)張、肌肉功能、神經(jīng)傳遞、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和激素分泌[1]。人生長、發(fā)育及衰老過程中，鈣攝入后得到良好的吸收是增強(qiáng)或穩(wěn)定骨量的關(guān)鍵。有報(bào)道顯示，青少年攝取鈣量與骨密度關(guān)系密切[2]， 發(fā)育期缺鈣，則成熟骨骼的骨峰值低，會(huì)增加骨質(zhì)疏松的患病風(fēng)險(xiǎn)。一般男性和女性分別在21 周歲和19 周歲時(shí)骨量達(dá)到峰值，此后骨量增長停滯[3]，中年后骨量明顯損失，每年損失總骨量的0.5%～1%[4]。研究表明增加鈣攝入量可使骨折風(fēng)險(xiǎn)降低12%[5]。為了保證較高的骨密度，老年人日攝入800 mg鈣可有效預(yù)防骨流失[6-7]。根據(jù)年齡和性別不同，成人每日鈣攝入量應(yīng)在500～1 200 mg之間[8]。 雖然鈣可從膳食中攝取，但日常飲食難以達(dá)到推薦攝入量[9]，調(diào)查發(fā)現(xiàn)大多數(shù)東南亞國家人群的平均膳食鈣攝入量低于400 mg/d[10]。2017年《中國家庭健康大數(shù)據(jù)報(bào)告》發(fā)布，“補(bǔ)鈣”一詞榜上有名，中國人鈣元素缺失排名第一[11]。因此，補(bǔ)鈣制劑也是人群關(guān)注的熱點(diǎn)。

市場(chǎng)上的補(bǔ)鈣制劑可分為無機(jī)鈣、有機(jī)酸鈣、有機(jī)鈣和天然生物活性鈣，這些補(bǔ)鈣制劑各有優(yōu)缺點(diǎn)，生物利用度也不盡相同[12-14]。無機(jī)鈣（如碳酸鈣），鈣含量高且價(jià)格低，但體內(nèi)吸收率低，易引發(fā)結(jié)石，從而影響服用者正常的胃腸道功能，此外胃酸分泌差的人群存在嚴(yán)重的吸收問題。有機(jī)酸鈣可改善無機(jī)鈣的上述缺點(diǎn)，但葡萄糖酸鈣中鈣含量相對(duì)較低，且高糖成分不適合糖尿病患者；乳酸鈣進(jìn)入消化道產(chǎn)生乳酸根離子，能引起機(jī)體酸痛或疲勞；醋酸鈣會(huì)抑制小腸對(duì)鋅等微量元素吸收，提升高鈣血癥的風(fēng)險(xiǎn)[12]。有機(jī)鈣主要是氨基酸或復(fù)合氨基酸螯合鈣，鈣離子與酸根結(jié)合穩(wěn)定，此類補(bǔ)鈣制劑具有左旋結(jié)構(gòu)和較好的脂溶性，顯示出良好的生物活性，但其制備工藝相對(duì)復(fù)雜且價(jià)格貴[15]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)天然生物活性多糖鈣溶解性好，對(duì)胃腸道刺激小，不良反應(yīng)低，能克服傳統(tǒng)鈣鹽的缺點(diǎn)，是一類值得研究與開發(fā)的補(bǔ)鈣劑[16]。為了更好地獲得多糖螯合鈣制劑，有研究者將多糖分子的羥基衍生化，引入強(qiáng)親核原子或基團(tuán)，常見含氮、磷或羧酸衍生物，從而在多糖分子鏈上引入強(qiáng)配體基團(tuán)與鈣離子產(chǎn)生穩(wěn)定螯合[17]。

普魯蘭多糖是一種非離子鏈狀多糖，其來源廣泛，具有天然多糖的生物相容性和可生物降解性，同時(shí)具有良好的水溶性、黏性和成膜性特點(diǎn)[18]。此外，其分子鏈上的大量羥基可用于化學(xué)修飾，制備衍生物，引入功能基團(tuán)，拓寬其應(yīng)用范圍。目前，將普魯蘭多糖及其衍生物應(yīng)用于食品、保健品和藥品等領(lǐng)域已獲得研究者的 廣泛關(guān)注[19]。本實(shí)驗(yàn)以天然普魯蘭多糖為原料合成羧甲基 普魯蘭多糖鰲合鈣，用于治療骨質(zhì)疏松小鼠，為新型鈣補(bǔ)充劑的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

15～20 g清潔級(jí)Balb/C小鼠24 只，雌雄各半，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCΧK（冀）2018-004）。

普魯蘭多糖（2 000 kDa） 日本林原化學(xué)株式會(huì)社；羧甲基普魯蘭多糖（carboxymethyl pullulan，CMP）由實(shí)驗(yàn)室自制；氯化鈣 北京惠寶聯(lián)化科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FTIR-8400s傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津儀器公司；T6紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；LGJ-18冷凍干燥機(jī) 寧波新芝儀器有限公司；TM3000掃描電子顯微鏡 日本日立儀器公司；AU680全自動(dòng)生化分析儀 美國Beckman公司；YD-20KZ 硬度儀 天津天大天發(fā)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CMP-Ca（II）的制備及表征

參考文獻(xiàn)[20]合成CMP，經(jīng)絡(luò)合滴定法測(cè)得制備的CMP羧甲基取代度為40%。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的CMP水溶液，50 ℃水浴條件下滴加CaCl2溶液，使Ca2+與CMP質(zhì)量比為2∶1，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至10。反應(yīng)一定時(shí)間后，反應(yīng)液以4 000 r/min離心5 min除去沉淀（直至無沉淀產(chǎn)生），取上清液，加入過量的2 mol/L Na2CO3溶液除去游離鈣離子，4 000 r/min離心5 min。上清液減壓濃縮后，加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置24 h后抽濾獲得CMP-Ca（II）粗品，適量去離子水溶解，裝入透析袋（截留分子質(zhì)量8～12 kDa）中用蒸餾水透析后，將透析液凍干，得CMP-Ca（II）純品。CMP和 CMP-Ca（II）樣品用紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜和掃描電子顯微鏡進(jìn)行表征。

1.3.2 紫外光譜分析

將CMP與CMP-Ca（II）分別溶于蒸餾水中，以蒸餾水為對(duì)照，采用紫外-可見分光光度計(jì)，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分析兩者掃描圖譜的差異。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

分別取干燥的CaCl2、CMP和CMP-Ca（II）樣品，與KBr混合，研磨均勻后壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，測(cè)定樣品的紅外吸收光譜。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

采用掃描電子顯微鏡在真空條件下掃描CMP與 CMP-Ca（II）樣品，電壓為15 kV，放大倍數(shù)為100，觀察樣品的微觀形貌特征。

1.3.5 CMP-Ca（II）配合物中鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

精密稱定CMP-Ca（II）35 mg，置于燒杯中，加6 mol/L HCl 5 mL和蒸餾水30 mL溶解，煮沸5 min，冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容，搖勻。精確量取5.0 mL樣品溶液至錐形瓶中，用NaOH溶液調(diào)pH值至13～14，加1 滴鈣紫紅素指示劑，用0.05 mol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液滴定至溶液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色，即達(dá)到滴定終點(diǎn)。記錄消耗EDTA溶液體積，按下式計(jì)算鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平行測(cè)定3 次。

式中：cEDTA為EDTA滴定液濃度/（mol/L）；VEDTA為消耗EDTA溶液體積/mL；MCa為Ca的原子質(zhì) 量/（g/mol）；m為待測(cè)溶液中CMP-Ca（II）的質(zhì)量/mg。

1.3.6 CMP-Ca（II）配合物制備工藝優(yōu)化

選取反應(yīng)pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反應(yīng)溫度（X3）為考察因素，以鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察3 個(gè)因素的影響，每個(gè)單因素試驗(yàn)平行操作3 次[21]。固定m（Ca2+）∶m（CMP） 為1∶1和溫度為50 ℃，考察反應(yīng)pH值分別為7、8、9、10、11和12時(shí)對(duì)CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響；固定反應(yīng)pH值為9和溫度為50 ℃，考察m（Ca2+）∶m（CMP）為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3時(shí)對(duì)CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響；固定m（Ca2+）∶m（CMP）為1∶1和反應(yīng)pH值為9，考察反應(yīng)溫度為30、40、50、60 ℃和70 ℃時(shí)對(duì)CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)[22]，按照表1優(yōu)化反應(yīng)條件。其中用1、0、-1代表自變量的高、中、低3 個(gè)編碼水平，響應(yīng)值Y為鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)行17 次試驗(yàn)。用Design Expert 8.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得 CMP-Ca（II）最佳制備的工藝條件并驗(yàn)證。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面法因素水平表Table 1 Factors and levels used for Box-Benhnken design

1.3.7 骨質(zhì)疏松Balb/C小鼠造模及CMP-Ca（II）體內(nèi)評(píng)價(jià)

將15～20 g清潔級(jí)Balb/C小鼠隨機(jī)分為3 組，每組8 只，雌雄各半，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和CMPCa（II）組。在第1～14天，模型對(duì)照組和CMP-Ca（II） 給藥組灌胃維甲酸70 mg/（kgmb·d），建立小鼠骨質(zhì)疏松模型[23]，第15～42天，模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，CMP-Ca（II）給藥組灌胃100 mg/（kgmb·d） CMP-Ca（II），空白對(duì)照組在1～42 d均灌胃生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠分籠飼養(yǎng)，飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，每天記錄體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)完畢后，小鼠斷頭取血，血液室溫靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，分離血清置于4 ℃冰箱貯存。血清樣本采用AU680全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase protein，ALP）活力，通過偶氮砷III法測(cè)定血鈣濃度。小鼠取血后，剝離其雙側(cè)股骨，剔除骨上附著組織，60 ℃烘至恒質(zhì)量并稱量，以股骨干質(zhì)量/體質(zhì)量來計(jì)算骨質(zhì)量指數(shù)，游標(biāo)卡尺測(cè)量其左側(cè)股骨長度、寬度和厚度。通過排水法測(cè)定股骨體積，以股骨干質(zhì)量/股骨體積計(jì)算骨密度。采用硬度儀測(cè)定股骨的骨硬度，記錄最大承載力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP-Ca（II）制備工藝優(yōu)化結(jié)果

采用單因素試驗(yàn)考察反應(yīng)pH值、m（Ca2+）∶m（CMP） 和反應(yīng)溫度對(duì)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。由圖1A可知，CMP-Ca（II）的鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著pH值的增大先升后降。低pH值時(shí)，CMP分子中羧基解離度低，不利于與鈣離子發(fā)生配合；pH 10時(shí)CMP-Ca（II）配合物中鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；pH＞10時(shí)，配合物中鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著pH值的增大而降低，pH值增大可使溶液產(chǎn)生氫氧化鈣沉淀，不利于CMP-Ca（II）配合物的合成。因此，選擇pH 10為制備CMP-Ca（II）的最佳條件。 Ca2+與CMP二者的質(zhì)量比也影響CMP-Ca（II）的鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由圖1B可知，在選定的比例下，隨著m（Ca2+）∶m（CMP）減小，CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后降低，適宜的m（Ca2+）∶m（CMP）為2∶1。適當(dāng)升高反應(yīng)溫度可提升反應(yīng)物CMP與Ca2+之間的碰撞頻率，促使產(chǎn)物生成。50 ℃時(shí)， CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（圖1C），若再提高反應(yīng)溫度，則CMP分子和Ca2+運(yùn)動(dòng)速度過快，限制了CMP分子上的配位基團(tuán)與Ca2+的結(jié)合。

圖1 pH值（A）、m（Ca2＋）∶m（CMP）（B）和反應(yīng)溫度（C） 對(duì)CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of pH (A), m (Ca2＋)∶m (CMP) ratio (B) and temperature (C) on Ca2+ content of CMP-Ca(II)

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平的 Box-Benhnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)考察pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反應(yīng)溫度（X3）對(duì)CMP-Ca（II）配合物制備工藝的影響，以鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見表2。各因素交互作用對(duì)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的等高線和響應(yīng)面圖見圖2。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化CMP-Ca（II）配合物制備工藝參數(shù)結(jié)果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

圖2 各因素交互作用對(duì)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.2 Contour plots and three-dimensional response surface plots describing the interactive effects of different factors on calcium content of CMP-Ca(II)

利用Design-Expert軟件，得到回歸方程：Y＝-166.179 5+31.145X1+4.329X2+0.614 75X3-0.01X1X2-0.006 5X1X3-0.005X2X3-1.531X12-0.981X22-0.005 36，其決定系數(shù)R2為0.999 3，模型方程擬合度良好；變異系數(shù)為0.46%，實(shí)驗(yàn)誤差小，能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)際情況?；貧w方程失擬性檢驗(yàn)P＝0.896 9＞0.05，符合模型要求，可利用該模型分析預(yù)測(cè)。經(jīng)方差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，模型的一次項(xiàng)X1、X2、X3，交互項(xiàng)X1X3、X2X3和二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)CMP-Ca（II）復(fù)合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Y）影響顯著（P＜0.05），其中X1、X12、X22和X32影響高度顯著（P＜0.000 1）。

為探討各因素對(duì)制備CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，采用Design Expert軟件繪制CMP-Ca（II） 中鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Y）與反應(yīng)pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反應(yīng)溫度（X3）之間的等高線圖和三維響應(yīng)面圖，考察X1、X2和X3對(duì)Y的影響。 圖2A1和圖2A2為反應(yīng)pH值與m（Ca2+）∶m（CMP）交互作用對(duì)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，圖2B1和圖2B2為反應(yīng)pH值與反應(yīng)溫度的交互作用對(duì)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，橢圓形等高線表示反應(yīng)pH值與m（Ca2+）∶m（CMP）和反應(yīng)pH值與反應(yīng)溫度對(duì)CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響。圖2C1和圖2C2為m（Ca2+）∶m（CMP）與反應(yīng)溫度的交互作用對(duì)鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，等高線稀疏且呈圓形，說明m（Ca2+）∶m（CMP）與溫度對(duì)CMP-Ca（II）配合物鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不顯著。采用Design Expert軟件優(yōu)選CMPCa（II）配合物的最佳制備條件為50 ℃、pH 10和m（Ca2+）∶m（CMP）＝2∶1。為驗(yàn)證模型可靠性，采用優(yōu)化條件制備3 批CMP-Ca（II）配合物，獲得的最高鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.3%，與模型方程預(yù)測(cè)值相一致。

2.2 CMP-Ca（II）的結(jié)構(gòu)表征

CMP-Ca（II）配合物紫外光譜圖如圖3所示，CMP溶液在255 nm波長處顯示出較強(qiáng)吸收峰，但CMP-Ca（II） 在200～400 nm波長處未見明顯的紫外吸收，CMP在255 nm波長處的最大紫外吸收峰消失，表明CMP中的 —COOH與Ca2+發(fā)生絡(luò)合，使得CMP-Ca（II）未見明顯的羰基基團(tuán)紫外吸收峰。

圖3 CMP及CMP-Ca（II）配合物的紫外光譜Fig.3 UV spectra of CMP and CMP-Ca(II) complex

CMP-Ca（II）配合物傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果見圖4。CMP與CaCl2發(fā)生配合反應(yīng)生成CMP-Ca（II），其紅外光譜與CMP相比，—OH特征吸收峰由3 420 cm-1處 移至3 391 cm-1處，CMP-Ca（II）紅外光譜曲線中CMP在1 732 cm-1處的羰基吸收峰消失，于1 600 cm-1處出現(xiàn)新的強(qiáng)吸收峰，證明成功合成CMP-Ca（II）配合物。CMP-Ca（II） 配合物合成過程中CMP的—OH和—COOH與Ca2+形成強(qiáng)配位鍵，導(dǎo)致CMP的羰基吸收峰消失。此外， CMP-Ca（II）的紅外光譜圖與CaCl2鈣供體的紅外光譜圖存在顯著不同，這與文獻(xiàn)[21,24]報(bào)道的結(jié)果類似。

圖4 CMP-Ca（II）傅里葉變換紅外光譜圖 Fig.4 FTIR spectra of CMP-Ca (II)

由圖5可看出，CMP呈較為致密的層狀結(jié)構(gòu)，表明多糖分子間作用可形成重疊結(jié)構(gòu)。而CMP與鈣離子配合后，CMP-Ca（II）的結(jié)構(gòu)發(fā)生根本改變，表面變?yōu)椴灰?guī)則的顆粒狀，說明CMP與金屬離子配合時(shí)其糖鏈發(fā)生不同程度的卷曲，配位鍵的形成極大改變了多糖結(jié)構(gòu)，配位前后表面形貌發(fā)生了顯著的變化[25]。

圖5 CMP（A）和CMP-Ca（II）（B）掃描電子顯微鏡圖 Fig.5 SEM images of CMP (A) and CMP-Ca(II) (B)

2.3 CMP-Ca（II）治療小鼠骨質(zhì)疏松效果的初步評(píng)價(jià)

體質(zhì)量是反映生物體健康狀況的重要指標(biāo)，經(jīng)維甲酸及CMP-Ca（II）制劑干預(yù)后小鼠體質(zhì)量的變化如圖6所示。模型對(duì)照組小鼠4 d后體質(zhì)量持續(xù)下降，而生理鹽水灌胃的空白對(duì)照組小鼠體質(zhì)量正常增長（圖6A），說明維甲酸對(duì)小鼠的生長影響顯著。維甲酸灌胃3 d后，小鼠攝食量、活動(dòng)量均明顯減少，反應(yīng)遲鈍，蜷縮成團(tuán)，可見被毛枯槁乍起、眼鼻部及耳部黏膜紅腫發(fā)炎、后腿站立不起等變化。14 d后處死小鼠，比較發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組小鼠股骨光滑，骨骼關(guān)節(jié)發(fā)白發(fā)亮，未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性骨折，而維甲酸模型對(duì)照組股骨表面略顯粗糙，有肉眼可見骨質(zhì)缺失，骨骼關(guān)節(jié)發(fā)黑發(fā)暗（圖7A）。摘取空白 對(duì)照組與模型對(duì)照組小鼠的心、肝、脾、肺和腎，肉眼觀察未見兩組小鼠臟器的大小、形態(tài)的異常改變，表明給予70 mg/（kgmb·d）維甲酸建立小鼠骨質(zhì)疏松模型成功。圖6B是CMP-Ca（II）組和空白對(duì)照組小鼠在28 d內(nèi)體質(zhì)量的變化情況。初始時(shí)，空白對(duì)照組小鼠體質(zhì)量明顯高于模型組，基本維持在25 g左右。隨著補(bǔ)充 CMP-Ca（II），CMP-Ca（II）組小鼠的體質(zhì)量呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)。表明灌胃一定劑量的CMP-Ca（II）在小鼠自身生長過程中可參與營養(yǎng)骨骼并促進(jìn)小鼠生長。

圖6 不同組別的Balb/C小鼠體質(zhì)量變化Fig.6 Body mass variation of Balb/C mice in different experimental groups

圖7 空白對(duì)照組（A）與模型對(duì)照組（B）小鼠股骨形態(tài)圖Fig.7 Appearance of femur in normal (A) and model (B) mice

骨質(zhì)疏松早期無明顯癥狀，通常以測(cè)定骨密度來初步判斷是否骨質(zhì)疏松[26-27]，但僅憑骨密度不能反映骨強(qiáng)度，如患有石骨病時(shí)患者骨密度雖正常，但該病引起的骨折發(fā)生率卻很高，故除骨密度外，骨硬度也是反映骨是否正常的重要指標(biāo)[28]。另外，骨質(zhì)量與骨結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，股骨干質(zhì)量、股骨鈣含量變化等也被作為評(píng)價(jià)補(bǔ)鈣制劑效果的指標(biāo)[29]。為全面反映骨骼生長情況，對(duì)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和CMP-Ca（II）給藥組小鼠股骨指標(biāo)、骨密度、骨硬度、血鈣濃度、ALP活力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表3所示。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組 小鼠的股骨長度、寬度、厚度、干質(zhì)量和骨質(zhì)量指數(shù)均顯著降低，骨密度和骨硬度均顯著減?。≒＜0.05），說明維甲酸灌胃對(duì)小鼠的骨骼發(fā)育產(chǎn)生了明顯影響。動(dòng)物體內(nèi)99%以上的鈣沉積于骨骼與牙齒中，正常生物體血鈣含量低，且與骨鈣含量維持動(dòng)態(tài)平衡，但骨質(zhì)疏松可促使骨鈣溶出，導(dǎo)致血鈣含量升高。此外，骨質(zhì)疏松時(shí)，血液中ALP活力會(huì)明顯升高。故測(cè)定骨代謝的血鈣濃度和ALP活力對(duì)骨質(zhì)疏松癥等代謝性骨病的診斷具有重要意義[30]。由表3可知，維甲酸使得模型對(duì)照組ALP活力顯著升高，表明模型小鼠破骨細(xì)胞的活性依舊較強(qiáng)。但血鈣濃度與空白對(duì)照組無顯著差異，這可能與長期停用維甲酸后小鼠自身穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)。上述結(jié)果表明，模型對(duì)照組小鼠骨骼處于負(fù)鈣平衡狀態(tài)，骨質(zhì)疏松傾向明顯，說明造模成功。與模型對(duì)照組相比，CMP-Ca（II）組小鼠股骨長度并未增加，表明成年小鼠鈣質(zhì)的補(bǔ)充并不能增加骨長，但小鼠股骨的寬度、厚度、干質(zhì)量和骨質(zhì)量指數(shù)均有不同程度的增加，說明CMP-Ca（II）對(duì)提高骨質(zhì)量有明顯效果，主要是通過增加骨橫徑及骨質(zhì)量實(shí)現(xiàn)；此外，CMP-Ca（II）組小鼠股骨的骨密度、骨硬度較模型對(duì)照組均有不同程度的改善，ALP活力下降，說明 CMP-Ca（II）可抑制骨破壞并調(diào)節(jié)骨重建，具有一定改善維甲酸導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松作用。

表3 不同小鼠不同指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 3 Measured bone indexes of mice in different groups

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件，制備了鈣離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.3%的 CMP-Ca（II）。CMP-Ca（II）與CMP相比，紫外光譜和傅里葉變換紅外光譜圖差異明顯，CMP-Ca（II）的紫外光譜中255 nm波長處最大吸收峰消失，而在紅外光譜中于1 600 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，證明CMP-Ca（II） 配合物成功合成。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示， CMP-Ca（II）產(chǎn)物為粒狀結(jié)構(gòu)。采用維甲酸構(gòu)建骨質(zhì)疏松小鼠模型，以CMP-Ca（II）配合物為補(bǔ)鈣劑，驗(yàn)證其對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠補(bǔ)鈣效果。經(jīng)過28 d干預(yù)，CMP-Ca（II）可提高骨質(zhì)量，其中，以增加骨橫徑及骨質(zhì)量為主，此外CMP-Ca（II）還可改善骨密度、骨硬度，具有一定改善維甲酸導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松作用。