增鮮劑5’-肌苷酸二鈉惡化老齡db/db小鼠 脂質(zhì)代謝紊亂的分子機制

姜允嘉，劉金艷，許賽君，王 洋，張 彬，成 鐘，許 揚，謝 勇*

（中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193）

5’-肌苷酸（inosine 5’-monphosphate，IMP）是讓人體感知鮮味特性的主要物質(zhì)之一，具有呈味作用穩(wěn)定持久的優(yōu)點，容易分離提取，pH 7.5環(huán)境結(jié)晶的IMP為二鈉鹽。GB 2760—1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》規(guī)定，IMP二鈉鹽可在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用。添加5%～12% IMP二鈉鹽并與谷氨酸鈉混合使用，其呈味作用較單獨使用谷氨酸鈉高約8 倍，IMP二鈉鹽有“強力味精”之稱，是日常生活中所用豆瓣醬、醬油、雞精等調(diào)味品的主要成分之一。在生物體內(nèi)，IMP是嘌呤核苷酸從頭合成途徑中最先合成的化合物，是合成腺苷酸基琥珀酸（S-AMP）、鳥苷酸等的前體[1]， 這些化合物具有調(diào)節(jié)細胞代謝、能量遷移、增殖、死亡和DNA、RNA合成等功能[2]。S-AMP是嘌呤核苷酸從頭合成途徑中IMP的下一個產(chǎn)物，也是一種天然胰島素分泌促進劑[3]。王楠等[4]基于酶促動力學，以IMP為原料實現(xiàn)了S-AMP大量合成；王洋等[5]研究發(fā)現(xiàn)S-AMP和一磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）形成復合體后促進AMPK活化，降低飲食誘導的高血脂癥小鼠肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和血脂濃度，可作為治療非酒精性脂肪肝的先導化合物開展成藥性研究。IMP和S-AMP均為AMP的分子結(jié)構(gòu)類似物，由此推測IMP可能也具有活化AMPK提高糖脂代謝效率而改善糖脂代謝紊亂疾病的功能，且IMP與AMP的分子結(jié)構(gòu)相似度高于S-AMP，因此，IMP可能較S-AMP更具有藥物或功能性食品的開發(fā)前景。然而，目前鮮有相關研究成果報道。C57/KsJ-db/db（簡稱db/db）小鼠是一種長期罹患嚴重糖尿病和高血脂癥的模式動物。為深入了解IMP活化AMPK后引起小鼠等模式動物的代謝變化規(guī)律并探討IMP是否具有保健功能或食品安全隱患，本研究對6 月齡自發(fā)性糖尿病db/db小鼠灌胃IMP 8 周，分析小鼠生理學指標變化和作用機制，為全面理解IMP等嘌呤核苷酸的生物學功能提供基礎生物學領域研究證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

HepG2細胞由國家實驗細胞資源共享服務平臺提供；大腸桿菌質(zhì)粒pET-21a由本實驗室保存。

SPF級db/db小鼠和C57/BL/6j（簡稱C57）小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCΧK（京）2019-0001），在中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所SPF動物房內(nèi)按照實驗動物飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)和給藥（使用許可證號：SYXK（京）2017-0020，有效期2017年 6月16日至2022年6月16日）。

IMP（食品級） 希杰（聊城）生物技術(shù)有限公司；尿酸（uric acid，UA）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒 美國Abcam公司；乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、磷酸化ACC1（phospho-ACC1，p-ACC1）、p-ACC2、甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、AMPK、p-AMPK等一抗 美國Cell-Signal Technology公司；二抗辣根過氧化物酶-山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）、 青霉素-鏈霉素 北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)電泳分離膠（聚丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)4%～12%遞增） 南京金瑞斯生物科技有限公司；PrimeScrip RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒 日本Takara公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶（25 g胰蛋白酶溶于0.975 L的PBS） 美國HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibio Life Technologies公司；油酸、洛伐他汀等試劑 美國Sigma-Aldrich公司；bodipy 493/503中性脂質(zhì)染色劑 美國Thermo Fisher公司；乙酰輔酶A含量測定試劑盒 上海索橋生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）紅色熒光染料MitoSOΧ Red 美國Molecular Probes公司；血糖儀及配套血糖試紙 美國Roche公司。

1.2 儀器與設備

FortéBio型表面等離子共振（surface plasma resonance，SPR）儀 美國Pioneer公司；AU480型全自動生化儀 美國Beckman公司；M1000型多功能連續(xù) 波長分光光度計 瑞士Tecan公司；IΧ51型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；LightCycler? 96 SW 1.1型qPCR儀 美國Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗小鼠的藥物處理及分組

稱取一定量IMP，配制為pH 7.5的飽和水溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)12 h重結(jié)晶，回收晶體，于70 ℃恒溫箱中干燥48 h，準確稱量，配制成50 mg/mL水溶液。

挑選6 月齡、空腹血糖濃度約15 mmol/L、體質(zhì)量52～64 g的雄性db/db小鼠，分為兩組，每組10 只。設定未給藥小鼠為模型組，另一組為給藥組，按劑量 50 mg/（kgmb·d）灌胃IMP溶液，連續(xù)給藥8 周。以月齡相同的雄性C57小鼠5 只作為正常對照組，全部小鼠均使用正常飼料喂養(yǎng)。給藥開始后每隔7 d用電子天平稱量小鼠體質(zhì)量，并測定小鼠空腹血糖濃度，每次測定前小鼠禁食12 h，剪尾法取血，將血糖試紙安裝在血糖儀中，添加約20 μL血液到血糖試紙的進樣口內(nèi)，記錄血糖儀上顯示的血糖濃度。

1.3.2 小鼠生理學指標測定

給藥8 周后，小鼠禁食16 h后進行取樣。收集小鼠尿液，按照UA檢測試劑盒說明書步驟測定UA濃度。采集小鼠血清，用相應檢測試劑盒分別測定血清ALP、AST、ALT、LDH活力；用全自動生化儀測定血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）濃度。

采集血樣后立即處死小鼠，取心臟、肝臟和腎臟，收集的小鼠器官用10%福爾馬林溶液固定后石蠟包埋，切片。肝組織切片用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后用油紅O復染，心肌切片分別用天狼猩紅和油紅O染色，腎臟組織切片分別用HE染色和過碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色后用顯微鏡觀察并拍照保存。剩余小鼠器官樣品于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3.3 IMP與AMPKγ1亞基的分子互作分析

根據(jù)文獻[6]報道的蛋白質(zhì)表達和純化方法利用大腸桿菌質(zhì)粒pET-21a表達人源AMPKγ1亞基（NCBI參考序號：NP_002724.1）。室溫下利用SPR儀按照王洋等[5]的方法進行IMP和AMPKγ1亞基相互作用分析。用分子對接方法預測IMP-AMPKγ1亞基復合體的三維結(jié)構(gòu)，以AMPK-AMP復合體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號：4EAI）[6]為受體分子，利用Pymol軟件（http://www.pymol.org）確定AMPK結(jié)合部位中與小分子形成氫鍵的氨基酸。分別將AMPK結(jié)構(gòu)和小分子IMP導入Autodock分子對接軟件中，利用Autodock Tools計算Gasteiger電荷，添加原子類型得到其坐標文件，對配體小分子IMP加極性氫、計算電荷、確定扭矩中心、選擇可旋轉(zhuǎn)的鍵得到其坐標文件。設定對接的格點參數(shù)文件，格點間距設置為0.375 ?，結(jié)合空間大小為40 ?×40 ?×40 ?，以保證配體完全處在酶活性中心范圍內(nèi)，然后設定對接參數(shù)文件，利用半柔性對接方法進行分子動力學穩(wěn)定性計算，使用拉馬克遺傳算法，算法對接輪數(shù)設置為50，其他參數(shù)取默認值，利用Autodock 4軟件計算出IMP-AMPK復合體的空間結(jié)構(gòu)。

1.3.4 肝臟蛋白免疫印跡分析

小鼠肝組織加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，用手術(shù)剪盡量剪碎后用超聲波破碎細胞，離心取上清，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品。按照Wu Chongming等[7]所述條件進行蛋白免疫印跡分析。

1.3.5 qPCR分析脂質(zhì)代謝通路中蛋白mRNA相對表達量

提取各組小鼠肝組織的總RNA并測定其濃度，隨即使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫。采用qPCR法測定脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）、固醇酰輔酶A脫氫酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase 1，SCD1）的mRNA相對表達量。反應體系：SYBR Premix ExTaqqPCR試劑盒中的Supermix試劑6.25 μL，正向引物、反向引物溶液（10 μmol/L）各0.25 μL，cDNA 200 ng，添加ddH2O至總體積12.5 μL。反應條件：95 ℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸30 s，擴增40 個循環(huán)。選擇18S rRNA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。擴增基因引物由上海捷瑞生物技術(shù)公司合成，引物序列如表1所示。

表1 IMP與AMPKγ1亞基相互作用參數(shù)Table 1 Parameters of interaction between IMP and AMPKγ1 subunit

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time polymerase chain reaction used in this study

1.3.6 IMP的體外降脂活性實驗

5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中用含有1%青霉素-鏈霉素和10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)HepG2細胞，鋪96 孔板，細胞數(shù)約為1×104個/孔，分為對照組、模型組、陽性對照組和給藥組。IMP、洛伐他汀和油酸溶液均用上述培養(yǎng)HepG2細胞的培養(yǎng)基溶液配制。以100 μmol/L油酸100 μL誘導形成脂質(zhì)蓄積細胞，作為模型組。油酸造模同時給藥，加入100 μL的10 μmol/L IMP為給藥組，以加入100 μL的10 μmol/L洛伐他汀為陽性對照組，于含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后用100 μL的4%多聚甲醛固定細胞，加入100 μL 2 μmol/L bodipy 493/503染色，用熒光倒置顯微鏡觀察并記錄細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。

HepG2細胞按上述方法分組并給藥處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含5 μmol/L MitoSOΧ Red的DMEM基礎培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃避光培養(yǎng)30 min，用PBS清洗3 次，再加入DMEM基礎培養(yǎng)基，用熒光倒置顯微鏡觀察細胞ROS蓄積情況。

1.3.7 乙酰輔酶A含量測定

準確稱取小鼠心、肝組織，按照0.1 g組織加入1 mL RIPA裂解液，于冰浴下勻漿破碎細胞，4 ℃、16 000×g離心20 min，取上清液，待測。按照試劑盒所述方法配制工作液，取工作液92 μL和樣品溶液10 μL混勻后開始計時，于混勻后20 s和80 s時測定反應體系340 nm波長處吸光度。乙酰輔酶A的總量按如下公式計算。

式中：A1、A2分別為混勻后20 s和80 s時反應體系340 nm波長處吸光度；m為組織樣品質(zhì)量/mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析、Tukey’s檢驗或Newman-Kueuls檢驗分析組間差異，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 IMP處理db/db小鼠的生理學指標

由圖1可知，給藥期間模型組db/db小鼠體質(zhì)量高度顯著高于正常對照組C57小鼠（P＜0.001），且各組小鼠體質(zhì)量均無明顯變化（圖1A）。給藥前模型組db/db小鼠空腹血糖濃度（＞15 mmol/L）約為C57小鼠的3 倍，表明其患有嚴重的糖尿病，IMP給藥期間給藥組小鼠空腹血糖濃度較模型組小鼠顯著降低（P＜0.05），但依然為高血糖水平（＞10 mmol/L），可以認為IMP降糖活性較弱（圖1B）。給藥結(jié)束后，正常對照組小鼠尿液中UA濃度最高，模型組小鼠次之，IMP給藥后db/db小鼠尿液UA濃度最低，但與模型組差異性不顯著（圖1C）。與模型組相比，給藥組小鼠血清TC濃度顯著升高（P＜0.05），HDL濃度極顯著升高（P＜0.01），TG和LDL濃度雖有所升高，但兩組間差異不顯著（圖1D）。由圖1E～H可知，與模型組相比，給藥組小鼠ALP、AST、ALT和LDH活力均顯著上升（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。AST/ALT活力比值大于1，表明肝臟受到實質(zhì)損害[8]，ALP、LDH活力顯著升高，表明發(fā)生了肝硬化[9]。

圖1 IMP給藥結(jié)束后各組小鼠的生理學指標Fig.1 Physiological indicators of mice in each group after IMP administration

Manne等[10]通過觀察小鼠肝組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)，即使是C57小鼠，隨著年齡增長肝組織也會出現(xiàn)脂質(zhì)蓄積，可能患有輕度非酒精性脂肪肝。由圖2可知，本實驗中，與正常對照組C57小鼠相比，模型組db/db小鼠肝組織中呈現(xiàn)大量脂肪顆粒，表明微泡脂肪變性并發(fā)脂質(zhì)蓄積，脂肪肝程度明顯加重，而給藥組小鼠肝組織脂肪顆粒較模型組更多，此現(xiàn)象和小鼠血清脂質(zhì)含量的變化趨勢 （圖1D）一致，表明IMP給藥后反而加重了db/db小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)蓄積。對比各組小鼠心肌組織形態(tài)，天狼猩紅染色結(jié)果表明IMP未對心肌造成明顯損傷，油紅O染色結(jié)果表明模型組和給藥組小鼠心肌組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積較正常對照組嚴重，IMP給藥后沒有發(fā)生明顯變化。腎臟組織HE染色結(jié)果表明，各組小鼠腎臟組織沒有發(fā)生明顯改變，而PAS染色結(jié)果顯示，IMP給藥后db/db小鼠腎小球內(nèi)有糖含量降低的現(xiàn)象，這與IMP有一定降糖效果一致。這些結(jié)果證明，IMP給藥后反而加重了db/db小鼠脂質(zhì)代謝紊亂癥狀，并造成了更嚴重的肝損傷，但對心臟和腎臟沒有造成損傷，血糖與UA濃度的降低表明對腎臟有保護作用[11]。以上研究結(jié)果顯示IMP損傷的靶器官為肝臟。

圖2 IMP給藥后各組小鼠肝臟、心臟和腎臟組織形態(tài)Fig.2 Histological morphology of liver, heart, and kidney in each group of mice after IMP administration

2.2 IMP-AMPK相互作用結(jié)果

SPR分析可顯示小分子和靶標蛋白相互作用過程中靶蛋白分子質(zhì)量隨時間的變化，響應值的變化趨勢可直觀顯示分子間結(jié)合和解離[7]。如圖3A所示，IMP和AMPKγ1亞基瞬間結(jié)合，在SPR整個測試周期（300 s）內(nèi)沒有顯示解離，這與S-AMP與AMPKγ1亞基相互作用時產(chǎn)生的SPR信號相似，但與AMP和AMPKγ1亞基相互作用產(chǎn)生的SPR信號[5]不同。由 表1可知，AMP與AMPKγ1亞基形成復合體的KD值為 （174±3）μmol/L，S-AMP與AMPKγ1亞基形成復合體的KD值為（12.0±0.2）μmol/L[5]，而IMP-AMPKγ1亞基復合體KD值為（211±4）μmol/L，明顯高于AMP和S-AMP，但IMP與AMPKγ1亞基結(jié)合后形成的復合體穩(wěn)定性仍較弱，但由于AMPKγ1亞基具有4 個結(jié)合位點[12]， 每個位點都能與IMP實現(xiàn)瞬間結(jié)合和解離，因此宏觀來看，IMP和AMPKγ1亞基在一定時間內(nèi)能夠形成穩(wěn)定復合體，因此監(jiān)測到的響應值與IMP濃度呈正相關。此外，分子對接計算結(jié)果顯示IMP結(jié)合在AMPKγ1亞基中AMP結(jié)合位點時的最佳結(jié)合能為-28.368 kJ/mol，得到的 IMP-AMPKγ1亞基復合體結(jié)構(gòu)中IMP的構(gòu)型與AMP-AMPKγ1復合體結(jié)構(gòu)中AMP構(gòu)型相同，且可能形成更多氫鍵 （圖3B），這些結(jié)果證明IMP和AMPK可以形成復合體。

圖3 IMP和AMPK的分子互作結(jié)果Fig.3 IMP interacted with AMPK

2.3 脂質(zhì)代謝通路中蛋白相對表達量

人體細胞內(nèi)AMPK是糖脂代謝通路中的關鍵蛋白，AMP或AMP結(jié)構(gòu)類似物與AMPKγ亞基結(jié)合后，其α亞基Thr172位點被磷酸化，磷酸化的AMPK誘導活化糖、脂質(zhì)等代謝通路，AMPK的磷酸化水平反映了其活性的高低[13]。由圖4A～C可知，與模型組相比，IMP和AMPKγ亞基形成復合體可提高db/db小鼠肝臟細胞內(nèi)AMPK磷酸化水平，給藥組小鼠在AMPK活化的下游脂質(zhì)代謝通路中ATGL相對表達量與模型組相比也無顯著變化，表明肝臟細胞內(nèi)蓄積脂肪的分解沒有被促進[14]，因此IMP不能促進脂肪分解為脂肪酸。ACC包含ACC1和ACC2兩種亞型[15]， ACC1分布于胞質(zhì)中，可催化長鏈脂肪酸的合成[16]，ACC2分布于線粒體膜上，其磷酸化水平上升表明細胞內(nèi)脂肪酸氧化被促進[17]。與模型組相比，IMP使小鼠肝臟總ACC表達量極顯著升高（P＜0.01），ACC1和ACC2的磷酸化水平提高，由此可見，IMP和AMPK形成復合體后顯著提高小鼠肝臟內(nèi)脂肪酸氧化。

圖4 各組小鼠肝臟內(nèi)脂肪分解相關蛋白相對表達量Fig.4 Relative expression levels of proteins related to lipolysis in mice

FASN、LPL、CPT1A和SCD1是脂質(zhì)代謝通路中的限速酶[18]。由圖4D～G可知，與模型組相比，IMP可顯著提高db/db小鼠CPT1A和SCD1mRNA表達量 （P＜0.05），CPT1A催化長鏈脂肪酸由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體氧化[19]，SCD1催化飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸，促進脂肪酸分解[20]，這兩種基因表達水平的增加表明IMP促進了線粒體內(nèi)脂肪酸氧化。與正常對照組相比，模型組小鼠FASN和LPLmRNA表達量均顯著升高（P＜0.05），IMP給藥后db/db小鼠FASN和LPLmRNA表達量較模型組降低，但組間無顯著性差異。FASN催化乙酰輔酶A從頭合成棕櫚酸酯的全過程，是造成脂質(zhì)蓄積的重要蛋 白質(zhì)[21]，LPL催化TG水解[22]，二者mRNA表達量降低表明肝內(nèi)脂肪蓄積和分解被干擾，發(fā)生了更嚴重的脂質(zhì)代謝紊亂，這與IMP給藥后db/db血清中HDL和LDL濃度均高于模型組的結(jié)果一致。

2.4 IMP對脂質(zhì)蓄積HepG2細胞的降脂活性

通過熒光顯微鏡可以觀察10 μmol/L IMP和10 μmol/L 洛伐他汀給藥24 h后各組HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)和ROS蓄積情況。由圖5可知，bodipy 493/503染色結(jié)果表明，IMP組細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積量明顯低于相同濃度的洛伐他汀。IMP能加速脂肪酸氧化，導致HepG2細胞內(nèi)脂肪加速分解為甘油和脂肪酸，脂肪酸用于滿足氧化代謝需求，因而體外細胞實驗觀察到IMP的降脂活性明顯高于洛伐他汀。MitoSOΧ Red染色結(jié)果顯示，對照組和模型組細胞紅色熒光無明顯差異，洛伐他汀作用后依稀可見微弱的紅色熒光，而IMP組可見明顯的紅色熒光，表明IMP增加了肝細胞ROS的生成。ROS產(chǎn)生的主要部位是線粒體[23]，由于IMP促進脂肪酸加速氧化，細胞在應激條件下產(chǎn)生過多的ROS以完成相應氧化反應，還原型輔酶II氧化酶和過氧化物酶被活化，進一步增加了肝細胞的氧化應激[24]，線粒體穩(wěn)態(tài)降低并導致DNA損傷[25]，從而導致小鼠肝損傷。

圖5 IMP對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)和ROS蓄積的影響Fig.5 Fluorescence micrographs describing lipid and ROS accumulation in HepG2 cells treated by IMP

2.5 小鼠肝臟和心臟乙酰輔酶A含量

如圖6所示，正常對照組C57小鼠肝臟和心臟組織中乙酰輔酶A含量分別約為3 nmol/mg和6 nmol/mg，而模型組db/db小鼠肝臟和心臟內(nèi)乙酰輔酶A含量急劇降低，為無檢出狀態(tài)；與正常對照組相比，IMP處理后db/db小鼠肝臟乙酰輔酶A含量高度顯著升高（P＜0.001），約為其6 倍，心臟乙酰輔酶A含量較模型組明顯升高，但低于正常對照組，約為其50%。乙酰輔酶A是動物體內(nèi)一種重要的代謝中間產(chǎn)物[26]。蛋白質(zhì)、糖、脂肪三大營養(yǎng)物質(zhì)分解代謝都會生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A除進入三羧酸循環(huán)最終代謝為CO2和H2O之外[27]，也是肝臟內(nèi)合成新的 脂肪、膽固醇和酮體的原料[28]。由于脂肪酸氧化分解的主要途徑是β-氧化，而β-氧化會產(chǎn)生乙酰輔酶A[29]，當長期罹患代謝綜合征小鼠肝臟內(nèi)三羧酸循環(huán)不足以消耗脂肪酸過度氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A時，過剩的乙酰輔酶A被合成為TC和TG，表明小鼠脂代謝紊亂癥狀加劇惡化，同時引發(fā)血清HDL和LDL濃度升高，表明這種模式動物肝臟內(nèi)的三羧酸循環(huán)效益顯著低下。此外，心臟自動收縮的過程需要消耗大量能量，心肌細胞的三羧酸循環(huán)活性高于肝細胞，相對而言，心肌細胞內(nèi)IMP刺激產(chǎn)生的過剩乙酰輔酶A容易被徹底代謝為H2O和CO2，為心臟自主運動供給能量，不易發(fā)生氧化應激損傷，因此未觀察到小鼠心臟損傷。

圖6 給藥結(jié)束后各組小鼠的肝臟和心臟內(nèi)乙酰輔酶A含量Fig.6 Acetyl-CoA contents in liver and heart of mice in each group after IMP administration

3 討 論

AMPK是調(diào)控脂質(zhì)代謝的一種關鍵蛋白，能與其形成復合體提高其磷酸化水平的化合物都潛在具有提高脂質(zhì)代謝效益的功能，前期研究已發(fā)現(xiàn)S-AMP具有這一功能[5]，提示IMP可能也具有這樣的功能。IMP作為廣泛使用的食品添加劑，毒理學研究證明IMP滿足食品安全要求[30]，因此，本研究探索其作為新藥或保健食品的可行性。一般認為AMPK的激動劑能促進脂質(zhì)代謝，降低受試動物血清TG等水平，抵抗肝臟脂肪蓄積[2,5-6]，但本實驗結(jié)果表明IMP長期作用于老齡db/db小鼠后，小鼠脂質(zhì)代謝紊亂癥狀更加惡化，血清TC濃度較模型組顯著升高（P＜0.05），可引發(fā)血管硬化，同時通過體外細胞實驗還觀察到IMP促進HepG2細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。原因可能是老齡db/db小鼠體內(nèi)，尤其是骨骼肌內(nèi)三羧酸循環(huán)活性低下，IMP促進脂肪酸氧化生成的乙酰輔酶A不能被徹底代謝為CO2和H2O，導致肝臟內(nèi)乙酰輔酶A含量較高。為抵抗乙酰輔酶A蓄積，肝臟產(chǎn)生氧化應激，產(chǎn)生大量ROS以氧化分解乙酰輔酶A，造成了肝氧化應激損傷；另一方面，乙酰輔酶A是合成TC、TG的原料，可導致體內(nèi)TC、TG過量合成，因而導致老齡db/db小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂更加惡化。因此可推測，用IMP治療飲食誘導產(chǎn)生高血脂癥的青壯年小鼠，小鼠的高血脂癥可能得到改善，與S-AMP給藥后的效果[5]相似。今后應開展不同生長周期的高血脂癥模型動物體內(nèi)乙酰輔酶A代謝機制研究，從中發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝發(fā)病的新機制，并確定新的藥物作用靶標，為篩選治療非酒精性脂肪肝的新藥奠定基礎。在實現(xiàn)AMPK活化的同時促進乙酰輔酶A代謝，可能是研發(fā)治療非酒精性脂肪肝等脂質(zhì)代謝紊亂疾病藥物的新思路。

鑒于高齡db/db小鼠代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展機制和長期罹患糖尿病、高血脂癥等代謝綜合征的老年人相似，飲食中過多攝入IMP可能加重病情，由此建議對于患有代謝綜合征的老年人群應減少從食物中過度攝取IMP，同時盡快研究建立IMP的食品安全新標準，規(guī)定IMP食用范圍。加強運動能提高三羧酸循環(huán)，有助于降低乙酰輔酶A在肝臟內(nèi)的蓄積，可能降低IMP促進體內(nèi)脂肪酸過度氧化對身體產(chǎn)生的損傷，綜上所述，本研究結(jié)果為清淡飲食和適當運動有利于身體健康提供了新的科學依據(jù)。

綜上，IMP和AMPK形成復合體后可提高AMPK磷酸化水平，可顯著活化肝臟內(nèi)脂肪酸氧化通路。動物體內(nèi)三羧酸循環(huán)活性低下時，在肝臟部位容易形成乙酰輔酶A蓄積，為抵抗乙酰輔酶A蓄積引發(fā)的應激反應，肝臟產(chǎn)生ROS將其氧化分解和將其用于合成TG、TC等，在衰老動物體內(nèi)造成肝氧化應激損傷，并進一步加劇脂質(zhì)代謝紊亂。