柴桂感寒口服液對靶動物的安全性試驗

朱經(jīng)國，劉明研，于美玲，肖 蕊，施 君，胡庭俊*，韋英益*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004; 2.廣西百色農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣西百色 533099)

柴桂感寒口服液為河南牧翔動物藥業(yè)有限公司研發(fā)的中獸藥復(fù)方制劑，該藥組方源自《傷寒論》[1]，系“小柴胡湯”加減方，是由柴胡、桂枝、干姜、黃芩4味主藥及天花粉、牡蠣、栝樓根和炙甘草等輔藥組成；該方兼 “小柴胡湯”的清利膽熱之功及桂枝、干姜之溫陽散寒，栝樓根、牡蠣之清熱生津、化痰散結(jié)之功于一體[2]。柴桂感寒口服液主要針對因冷熱交替、氣溫驟降等因素導(dǎo)致雞群打噴嚏、流鼻涕、輕度發(fā)熱等風(fēng)寒感冒之癥狀而研發(fā)，根據(jù)我國獸藥審評中心發(fā)布的《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]，在新獸藥臨床前藥效學(xué)研究中，應(yīng)提供藥物推薦劑量和過量的安全性資料。本試驗對柴桂感寒口服液進行靶動物(雞)的安全性試驗，觀測其對靶動物(雞)的臨床體征、飲食欲、血常規(guī)、血液生化指標(biāo)等的影響，以評價其安全性，為臨床用藥方案的制定和新獸藥的申報及生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和藥物 1日齡健康三黃雞150只，雌雄各半，購自廣西金陵農(nóng)牧集團有限公司，飼喂未添加任何抗生素的常規(guī)飼料，自由采食，自由飲水，飼喂至15日齡備用。柴桂感寒口服液，河南牧翔動物藥業(yè)有限公司研制，規(guī)格為1.44 g/mL，即每1 mL柴桂感寒口服液相當(dāng)于原生藥1.44 g，100 mL/瓶，批號20170301，經(jīng)河南省獸藥監(jiān)察所檢驗符合規(guī)定。

1.1.2 主要試劑 普康血細胞分析儀應(yīng)用試劑，深圳普康公司產(chǎn)品；血清生化指標(biāo)測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、血糖、總膽紅素、總膽固醇等試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要儀器 普康PE-6100全自動血球計數(shù)儀，深圳普康公司產(chǎn)品；全自動生化分析儀(日立-7180)，日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 選取15日齡的健康三黃雞150只，隨機分為5組，每組30只，設(shè)置空白對照組、4個藥物劑量組即柴桂感口服液臨床推薦劑量(每1 L水，雞，1 mL)的1、3、5、10倍量，各試驗組雞分別給予不同劑量的柴桂感口服液，空白對照組給予飲用水，連續(xù)用藥5 d，停藥后繼續(xù)觀察至第14天，記錄雞的臨床表現(xiàn)，具體見表1。

表1 試驗動物分組和處理

1.2.2 臨床體征觀察 試驗期間觀察試驗雞是否出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，如呼吸、行為異常、精神狀態(tài)和排便等變化情況；記錄試驗雞的異常表現(xiàn)，如過敏反應(yīng)、流涎等出現(xiàn)的時間、程度、持續(xù)時間。

1.2.3 體重測定 分別于用藥前、試驗結(jié)束時對試驗雞進行逐只空腹稱重，計算各組試驗雞的平均增重和增重率。

平均增重(g)=試驗結(jié)束時組平均體重-用藥前組平均體重；

增重率(%)=(平均增重(g)/用藥前組平均體重)×100%

1.2.4 樣品采集及前處理 分別在給藥后第7天、給藥后第14天對試驗雞進行采血。每組分別隨機抽取15只雞，于翼靜脈采血2 mL，分兩管放置(其中一管加抗凝劑)，分別用于血常規(guī)分析及血液生化指標(biāo)分析。

1.2.5 血常規(guī)分析 取抗凝全血用普康PE-6100全自動血球計數(shù)儀進行白細胞、紅細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、中間細胞和血紅蛋白等指標(biāo)計數(shù)分析。

1.2.6 血液生化指標(biāo)分析 取血清分別用試劑盒進行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、血糖、總膽紅素、總膽固醇等指標(biāo)分析。

1.2.7 臟器指數(shù)和病理學(xué)檢查 試驗結(jié)束時，每組抽取15只試驗雞進行稱重，放血處死，進行病理解剖學(xué)檢查，重點觀察肺、肝、腎等有無肉眼可見的病理變化；摘取肝、腎、脾、肺和法氏囊等臟器進行稱重，計算臟器指數(shù)；根據(jù)解剖學(xué)檢查決定是否對其進行進一步組織病理學(xué)檢查。

臟器指數(shù)(mg/g)=臟器重量/體重

1.2.8 數(shù)據(jù)處理分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床體征變化

按不同劑量給藥后，各試驗劑量組雛雞進食均正常，運動、呼吸和排泄均未見異常，未見不良反應(yīng)，無死亡情況。

2.2 體重變化

由表2可知，各試驗劑量組雞的平均增重均高于空白對照組。與空白對照組相比，1倍劑量組平均增重顯著高于空白對照組(P<0.05)，3倍劑量組、5倍劑量組、10倍劑量組平均增重均極顯著高于空白對照組(P<0.01)；各劑量組與空白對照組相比增重率均明顯上升，其中5倍劑量組的增重率高達189.85%。

表2 不同劑量的柴桂感寒口服液對雞體重變化的影響

2.3 血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果

由表 3和表4可知，給藥后第7天，1、3、5、10倍劑量組的血常規(guī)各項指標(biāo)數(shù)值與空白對照組相比，差異均不顯著(P>0.05)。給藥后第14天，5倍劑量組的白細胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)；3、5、10倍劑量試驗組淋巴細胞數(shù)極顯著高于空白對照組(P<0.01)；10倍劑量試驗組紅細胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)；3和5倍劑量試驗組血紅蛋白含量顯著高于空白對照組(P<0.05)，10倍劑量試驗組血紅蛋白含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)。

表3 不同劑量的柴桂感寒口服液對雞血常規(guī)指標(biāo)的影響(第7天)

表4 不同劑量的柴桂感寒口服液對血常規(guī)指標(biāo)的影響(第14天)

2.4 血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果

由表5可知，給藥后7 d，各試驗劑量組與空白對照組相比，血液生化指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。由表6可知，給藥后14 d，5倍劑量組的堿性磷酸酶含量顯著低于空白對照組(P<0.05)，3倍劑量組的白蛋白的含量顯著高于空白對照組(P<0.05)，5倍劑量組和10倍劑量組的白蛋白含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，10倍劑量組的尿素氮含量顯著高于空白對照組(P<0.05)；5倍劑量組和10倍劑量組的總膽固醇含量顯著高于空白對照組(P<0.05)。

表5 不同劑量的柴桂感寒口服液對雞血液生化指標(biāo)的影響(第7天)

表6 不同劑量的柴桂感寒口服液對雞血液生化指標(biāo)的影響(第14天)

2.5 臟器指數(shù)

由表7可知，與空白對照組相比，各劑量組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肺臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，且5、10倍劑量組的法氏囊指數(shù)高于空白對照組。

表7 不同劑量的柴桂感寒口服液對雞臟器指數(shù)的影響

2.6 剖檢及其病理變化

試驗至14 d，對各試驗組雞進行剖檢及病理組織血檢查。結(jié)果顯示，各臟器表面光滑有彈性，按壓有彈性，未見出血及其他異常變化。病理組織學(xué)觀察見心臟組織結(jié)構(gòu)完整，心肌細胞輪廓清晰，核質(zhì)分明纖維走向正常；肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉清晰可辨；脾小葉清晰可辨，周圍淋巴細胞密集；肺結(jié)構(gòu)完整，肺泡清晰可見，肺泡壁未見增寬。腎單位結(jié)構(gòu)清晰，腎小管輪廓正常；法氏囊基本結(jié)構(gòu)清晰可辨，淋巴細胞均勻密集分布；胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)明顯，其間淋巴細胞分布均勻，細胞輪廓清晰(圖1)。

3 討論

在靶動物安全性試驗中，臨床體征觀察是判斷藥物對靶動物影響的一種手段，血常規(guī)和生化指標(biāo)分析是檢測藥物對機體是否有損傷，代謝及重要器官功能是否正常的重要手段[4]。本試驗于基礎(chǔ)飲水中添加不同劑量的柴桂感口服液對靶動物(雞)進行安全性試驗，觀察該藥物對試驗雞體征及臟器、血液生理學(xué)和生化指標(biāo)的影響。在為期14 d的試驗過程中，各劑量試驗組與空白對照組相比較，試驗組雞的體重均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的增高，這可能與該制劑組方藥中具有清利膽熱、清熱生津等藥效作用有關(guān)[2]，從而提高采食量和消化能力并促進雛雞生長。試驗結(jié)果說明，柴桂感口服液在推薦劑量10倍以下通過飲水給藥，對雞生長性能無不良影響，且能具有提高試驗雛雞增重率的作用。

血常規(guī)的指標(biāo)是衡量機體狀況的重要依據(jù)，也是疾病診斷和檢測的指標(biāo)之一[5]，而白細胞及淋巴細胞是主要參與機體免疫反應(yīng)的兩類細胞[6-7]，血紅蛋白含量在一定程度上可反映機體攜帶氧氣及是否貧血的指標(biāo)之一[8]。本試驗中，各試驗組雞通過飲水給藥后第7天，其血常規(guī)的各項指標(biāo)數(shù)值與空白對照組相比，差異均不顯著(P>0.05)；給藥后第14天，5倍劑量試驗組的白細胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)，3、5和10倍劑量試驗組的淋巴細胞數(shù)極顯著高于空白對照組(P<0.01)；10倍劑量試驗組的紅細胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)，3、5和10倍劑量試驗組的血紅蛋白含量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于空白對照組，但上述指標(biāo)均在正常生理值范圍。結(jié)果表明，柴桂感口服液在推薦劑量10倍以下通過飲水給藥不影響動物機體的正常機能狀態(tài)。而紅細胞及其血紅蛋白是運輸O2和CO2的載體，也參與機體的免疫調(diào)節(jié)作用，在本實驗中，白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、紅細胞和血紅蛋白值等指標(biāo)升高反映了柴桂感口服液可能具有增強試驗雛雞免疫調(diào)節(jié)的作用。

A～G.空白對照組的心、肝、脾、肺、腎、法氏囊及胸腺；A′～G′.10倍劑量組的心、肝、脾、肺、腎、法氏囊及胸腺

血液生化指標(biāo)主要檢驗機體的生理及代謝狀況和重要器官的功能狀態(tài)[9]，白蛋白是主要參與運輸、合成等功能的一類蛋白質(zhì)[10]。給藥后7 d，各試驗劑量組與空白對照組相比，血液生化指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)，試驗第14天，5倍和10倍劑量試驗組的白蛋白含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，3倍劑量組顯著高于空白對照組(P<0.05)，說明柴桂感寒口服液不影響機體代謝狀態(tài)，而給藥一定時間后，還具有促進代謝合成的作用。因此，柴桂感寒口服液可能具有增強雛雞機體代謝而促進生長的作用。5倍劑量組的堿性磷酸酶含量顯著低于空白對照組(P<0.05)，據(jù)文獻所述堿性磷酸酶[11]升高預(yù)示有肝損傷發(fā)生，那么降低則意味著有保肝作用；尿素氮是評價腎臟功能狀況的指標(biāo)之一[12]。試驗第14天，10倍劑量組的尿素氮水平極顯著高于空白對照組(P<0.01)，但在正常生理值范圍，而尿素氮水平的升高可能預(yù)示著腎功能活躍；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和總膽固醇是指示肝功能狀態(tài)的指標(biāo)[13]，其中主要以丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶為主。本試驗中，各劑量試驗組雞的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與空白對照組比較均差異不顯著， 10倍劑量組的總膽固醇顯著高于空白對照組(P<0.05)，但仍在正常范圍內(nèi)。結(jié)果表明，柴桂感寒口服液對試驗雞的腎臟和肝臟的功能無不良影響。

柴桂感寒口服液在臨床推薦劑量的1倍～10倍劑量范圍內(nèi)對靶動物(雞)飲水給藥，未表現(xiàn)毒性反應(yīng)，臨床用藥是安全的，無毒副作用。