煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的敏感性及抗性初探

錢忠海，李 濤，段亞冰

（1.江蘇省農(nóng)藥總站，南京 210013；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095）

煙草猝倒病是煙草生產(chǎn)中一類重要的土傳病害，主要危害葉片、莖部、根等。該病害是煙草苗期的重要病害，常導(dǎo)致幼苗感病后導(dǎo)致莖部呈褐色水漬狀腐爛，嚴(yán)重時(shí)引起病苗成片萎蔫、倒伏和腐爛，給我國煙草產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失。煙草猝倒病主要由腐霉屬真菌引起，其中以瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）為優(yōu)勢致病種群，對(duì)煙草具有較強(qiáng)的致病性。除了侵染煙草引起猝倒病外，瓜果腐霉還能夠侵染南瓜、黃瓜、番茄、大豆等多種作物[1-10]，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)上防治由瓜果腐霉病引起的植物病害主要以化學(xué)殺菌劑為主，同時(shí)也有一些生防菌株或植物提取物對(duì)該菌表現(xiàn)出一定的活性[11-17]。

辛菌胺是一種烷基多胺類殺菌劑，主要成分是二正辛基二乙烯三胺（圖1），具有廣譜殺菌活性，對(duì)病原細(xì)菌、真菌和病毒都具有一定活性[18-20]。殺菌機(jī)理是辛菌胺在水溶液中發(fā)生電離，利用其親水基部分的強(qiáng)烈正電性，吸附通常帶負(fù)電的細(xì)菌、病毒等病原微生物，抑制其繁殖，同時(shí)能夠使病菌蛋白凝固，使病菌酶系統(tǒng)變性，而聚合物形成的薄膜會(huì)堵塞微生物的離子通道，使其窒息死亡，從而達(dá)到最佳殺菌效果。在我國，辛菌胺目前已經(jīng)在番茄、辣椒、棉花、水稻和蘋果上獲得登記，用于防治番茄和辣椒病毒病、水稻細(xì)菌性條斑病、稻瘟病及病毒病等生產(chǎn)的重要病害，但是目前還沒有登記用于防治卵菌引起的植物病害。

為了進(jìn)一步明確辛菌胺用于防治卵菌病害的應(yīng)用潛力，筆者以煙草猝倒病病原瓜果腐霉為研究對(duì)象，分析辛菌胺對(duì)瓜果腐霉菌的抑菌活性，同時(shí)建立瓜果腐霉對(duì)辛菌胺的敏感性基線，并評(píng)估瓜果腐霉對(duì)辛菌胺的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，力求挖掘辛菌胺用于卵菌病害防治的潛力，為生產(chǎn)中更好地防治煙草猝倒病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基和藥劑

試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），主要用于煙草猝倒病菌的分離、培養(yǎng)、病原菌對(duì)藥劑敏感性的測定以及抗藥性菌株的誘導(dǎo)。具體配制方法為：稱取商品化的PDA粉劑39 g于1 000 mL水中，煮沸至粉劑完全溶解，再分裝于三角瓶中，121℃條件下高溫濕熱滅菌25 min后備用。

藥劑敏感性測定所用藥劑為40%辛菌胺，由山東濰坊萬勝生物農(nóng)藥有限公司提供，使用時(shí)用無菌蒸餾水溶解并配制成1×104μg/mL母液，并儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

1.2 煙草猝倒病樣品的采集及病原菌的分離培養(yǎng)

采用五點(diǎn)取樣法，在未施用過辛菌胺的煙草田塊中采集發(fā)生煙草猝倒病的煙草病苗。采集地點(diǎn)為云南省玉溪市和貴州省遵義市等地區(qū)，采集時(shí)間為2018年6月。

煙草猝倒病病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法。首先用解剖剪在病苗莖基部的病健交界處剪取大小為5 mm×5 mm的組織塊，將剪下的組織塊在75%的酒精中浸3～5 s，用無菌的鑷子將組織塊從酒精中取出并轉(zhuǎn)移至2%的次氯酸鈉溶液中浸泡3～5 min，然后將其在無菌蒸餾水中連續(xù)漂洗3次以去除表面殘留的次氯酸鈉，并用無菌的濾紙吸去組織表面多余的水分。將表面消毒后的組織塊轉(zhuǎn)移至含有50 μg/mL青霉素的PDA培養(yǎng)基平板上，用鑷子輕輕按壓，每皿放3～5塊。將培養(yǎng)皿密封好，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～5 d，然后將長出的病原菌進(jìn)行純化和鑒定，確定為瓜果腐霉菌（P.aphanidermatum），隨后在PDA平板上擴(kuò)繁培養(yǎng)并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定所采集的煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的敏感性。首先用融化的PDA培養(yǎng)基和辛菌胺母液配制含辛菌胺濃度為16.00、8.00、4.00、2.00、1.00μg/mL的PDA平板，用滅菌的打孔器在培養(yǎng)2 d的菌落邊緣制取直徑5 mm的菌碟，并將其轉(zhuǎn)移至含藥平板的中央，以不含藥的PDA平板作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿封口后在25℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)2 d，測量各處理的菌落直徑。各處理下菌絲生長抑制率按式（1）計(jì)算。

1.4 煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的敏感性測定結(jié)果，選取對(duì)辛菌胺敏感的煙草猝倒病菌FM10作為出發(fā)菌株，進(jìn)行抗性菌株的誘導(dǎo)，同時(shí)選取甲霜靈作為抗性誘導(dǎo)的對(duì)照藥劑。首先在PDA平板上將FM10菌株進(jìn)行活化2代，第2代菌株培養(yǎng)2 d后，用滅菌打孔器在菌落邊緣制取直徑為5 mm的菌碟2 000個(gè)，接種于含有亞致死濃度辛菌胺的PDA培養(yǎng)基平板上，菌絲面朝下，倒置培養(yǎng)于25℃黑暗恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)觀察生長情況。待菌碟邊緣出現(xiàn)扇形角突變狀的菌絲長出，將角突變區(qū)的菌絲轉(zhuǎn)移到含有最小抑制濃度（MIC）藥劑的PDA培養(yǎng)基平板上，于25℃黑暗條件下繼續(xù)倒置培養(yǎng)，能生長的視為抗藥性突變體。對(duì)照藥劑為甲霜靈，接種1 000個(gè)菌碟于含亞致死濃度甲霜靈的PDA培養(yǎng)基平板上。最后統(tǒng)計(jì)抗藥性突變體的數(shù)量并計(jì)算抗性突變頻率，突變頻率按式（2）計(jì)算。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算及分析

在Excel中計(jì)算各藥劑處理濃度下的抑制率，使用SPSS計(jì)算辛菌胺對(duì)各菌株的毒力回歸方程y=a＋bx、有效抑制中濃度EC50值以及95%置信限，同時(shí)也用SPSS20進(jìn)行敏感性分布情況的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FM-10對(duì)甲霜靈的敏感性測定

瓜果腐霉病菌FM-10對(duì)辛菌胺、甲霜靈的敏感性測定結(jié)果見表1。其EC50值分別為4.67、0.085μg/mL，說明該菌株對(duì)這幾種藥劑均表現(xiàn)敏感。此外，研究表明辛菌胺對(duì)瓜果腐霉病菌的MIC值均小于50 μg/mL，對(duì)甲霜靈的MIC值小于50μg/mL。

表1 瓜果腐霉病菌FM-10對(duì)辛菌胺、甲霜靈的敏感性

2.2 煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的敏感性

經(jīng)過組織分離和病原菌的鑒定，共分離到煙草猝倒病的病原瓜果腐霉菌株64株，其中有30株分離自云南省煙草病苗，34株分離自貴州省煙草病苗。通過菌絲生長速率法測定64株瓜果腐霉對(duì)辛菌胺的敏感性。結(jié)果表明，辛菌胺對(duì)64株瓜果腐霉的菌絲生長的最小抑制濃度（MIC）都小于50μg/mL，抑制效果比較好；辛菌胺對(duì)64株瓜果腐霉的EC50值分布為2.59～8.66μg/mL，平均EC50值為4.56±1.12 μg/mL，最大差異倍數(shù)為3.34倍；辛菌胺對(duì)64株瓜果腐霉菌的EC50值呈連續(xù)的單峰分布，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)P=0.20，該分布符合正態(tài)分布（圖2）。由此可見，64株煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺均表現(xiàn)為敏感，且64株煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的敏感性分布呈現(xiàn)正態(tài)分布曲線。

2.3 煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

從敏感型菌株FM10的菌落邊緣共打取了2 000個(gè)菌碟并接種在含亞致死濃度辛菌胺的PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。經(jīng)過對(duì)含藥板上菌絲生長的持續(xù)觀察，在任一菌碟周圍都沒有出現(xiàn)扇形突變區(qū)域，即沒有誘導(dǎo)到對(duì)辛菌胺產(chǎn)生抗性的菌株，抗性突變頻率為0%，而作為對(duì)照藥劑的甲霜靈，在接種于亞致死濃度PDA培養(yǎng)基平板上的1 000個(gè)菌碟中，共獲得了136株對(duì)甲霜靈表現(xiàn)抗性菌株，抗性頻率為13.6%（圖3）。這一結(jié)果說明，煙草猝倒病菌對(duì)甲霜靈具有高抗性風(fēng)險(xiǎn)，而其對(duì)辛菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)較低。

3 結(jié)果與討論

本研究表明，辛菌胺對(duì)煙草猝倒病的病原菌，即瓜果腐霉具有較好的抑制活性，而且通過測定64株瓜果腐霉菌對(duì)辛菌胺的敏感性發(fā)現(xiàn)，64個(gè)菌株對(duì)辛菌胺都表現(xiàn)為敏感，且敏感性分布符合正態(tài)分布，說明本研究測定的64株瓜果腐霉對(duì)辛菌胺的敏感性分布情況可以作為敏感性基線使用。鑒于辛菌胺對(duì)煙草猝倒病菌的良好活性，EC50值為4.67μg/mL，說明辛菌胺在對(duì)煙草猝倒病的防治上具有較好的應(yīng)用前景，可以將辛菌胺引入煙草病害的防控中，提高煙草病害尤其是煙草猝倒病的防控效率，同時(shí)該敏感性基線的建立也為日后田間煙草猝倒病菌對(duì)辛菌胺的敏感性監(jiān)測提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

甲霜靈是一種苯基酰胺類殺菌劑，在生產(chǎn)上常用來防治卵菌病害，目前已被國際殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC）列為高抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑[21-27]。筆者通過將引起煙草猝倒病的瓜果腐霉菌在含有亞致死濃度的甲霜靈PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，獲得了突變頻率為13.6%的抗性突變菌株，說明煙草猝倒病菌對(duì)甲霜靈具有較高的抗性風(fēng)險(xiǎn)。用同樣的方法沒有篩選到對(duì)辛菌胺有抗性的瓜果腐霉菌，說明其對(duì)辛菌胺具有很低的抗性風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)于已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性尤其是對(duì)苯基酰胺類產(chǎn)生抗藥性的植物病原物的防治，具有很大的應(yīng)用潛力。同時(shí)辛菌胺與其他類型藥劑混用對(duì)于延緩田間抗藥性的產(chǎn)生也有重要的意義。