轉(zhuǎn)錄因子NRF3結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)調(diào)控的研究進展*

吳宇財， 錢金欽， 何宇輝， 李學(xué)松， 鞏艷青

［北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所，國家泌尿男生殖系腫瘤研究中心，泌尿生殖系疾?。校┓肿釉\治北京市重點實驗室，北京100034］

“ 帽 領(lǐng) ”（Cap'n'collar，CNC）家 族 包 括 果 蠅CNC1，線蟲Skn-1，脊椎動物核因子E2樣蛋白1（nu?clear factor E2-like protein 1，NFE2L1）/核因子E2相關(guān)因子1（nuclear factor E2-related factor 1，NRF1）、NFE2L2/NRF2和NFE2L3/NRF3，以及相似性較低的BACH1和BACH2蛋白［1］。在信號傳遞過程中，CNC因子與小Maf家族蛋白形成異源二聚體，以進一步識別并結(jié)合多種反應(yīng)元件如NFE2、Maf識別元件（Maf recognition element，MARE）、抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）、應(yīng)激反應(yīng)元件（stress response element，STRE）和親電子反應(yīng)元件（electrophile response element，EpRE），進而調(diào)控靶基因的表達(dá)［2］。其中研究最為廣泛的是NRF2，其在細(xì)胞氧化應(yīng)激、合成代謝以及腫瘤預(yù)防與治療等方面發(fā)揮重要作用［3-4］。NRF3作為NRF2的同源基因，其蛋白的功能和調(diào)控目前還未得到深入的闡明；明確NRF3表達(dá)的調(diào)控因子及其調(diào)控的靶基因，尋找調(diào)控其轉(zhuǎn)錄因子活性的通路分子，對于全面了解它的功能和調(diào)節(jié)機制至關(guān)重要。

1 NRF3蛋白結(jié)構(gòu)和表達(dá)

脊椎動物NRF轉(zhuǎn)錄因子家族由3個密切相關(guān)的因子NRF1、NRF2和NRF3組成，三者的結(jié)構(gòu)見圖1。它們在C端區(qū)域都具有CNC結(jié)構(gòu)域和堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）結(jié)構(gòu)域，中間含有1~2個調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活的酸性區(qū)域（AD1、AD2或AD2L）；NRF1和NRF3的N末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）帶有跨膜區(qū)域，可以將蛋白錨定到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，此外兩者還都包含一個富含Asn/Ser/Thr（NST）的可發(fā)生N-糖基化的結(jié)構(gòu)域［5］。不同物種之間的生物信息學(xué)分析表明，NRF3結(jié)構(gòu)中的NTD、CNC和bZIP等重要結(jié)構(gòu)域在進化上具有高度保守性。人類NRF3基因位于染色體7p14~15，編碼的蛋白質(zhì)分子量為73 kD，包含7個結(jié)構(gòu)域，即NTD、PEST、TAD、Neh6L、CNC、bZIP和Neh3L，其中NTD區(qū)可進一步細(xì)分為N末端同源盒1（N-terminal homology box 1，NHB1）和NHB2，兩者對NRF3的翻譯后修飾起重要作用［1，6］。NRF3通過NHB1信號序列靶向輸送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行糖基化修飾，NHB2可能參與控制NRF3活性以及其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的翻譯后加工過程［7］。分子生物學(xué)研究表明，NRF3有A、B、C三種形式：B形式主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，可被靶向運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)并進行N-糖基化修飾而轉(zhuǎn)化為A形式；而C形式主要存在于細(xì)胞核中，與sMaf蛋白形成異二聚體，通過與特異性DNA結(jié)合位點結(jié)合而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［1］。Nouhi等［8］的研究表明，C形式可能是NRF3的截短形式，因其N端缺乏NHB1結(jié)構(gòu)域。

Figure 1.Schematic structures of NRF1，NRF2 and NRF3.These proteins share Cap'n'collar（CNC）and a basic leucine zipper（bZIP）domains in their C-terminus region.They contain one or two acidic domains（AD1，AD2 or AD2L）that regulate the transcriptional activation.The N-terminal domain（NTD）of NRF1 and NRF3 has a transmembrane region that can an?chor proteins to the endoplasmic reticulum membrane.In addition，both of them contain an Asn/Ser/Thr-rich（NST）do?main，which isa target for N-glycosylation.圖1 NRF1、NRF2和NRF3的結(jié)構(gòu)示意圖

NRF3在組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平已有研究。人類NRF3轉(zhuǎn)錄本從妊娠第12周至足月期間存在于胎盤絨毛中，特別是在滋養(yǎng)層細(xì)胞中高度表達(dá)，但在成纖維細(xì)胞中不表達(dá)。與組織中一致，NRF3轉(zhuǎn)錄本和蛋白在來源于人胎盤滋養(yǎng)層腫瘤的BeWo和JAR細(xì)胞系中高表達(dá)。細(xì)胞因子TNF-α能促進胎盤細(xì)胞中NRF3的mRNA和蛋白表達(dá)，提示NRF3可能參與TNF-α介導(dǎo)的信號通路［9］。NRF3在人其他組織中的表達(dá)程度不同，如在心臟、腦、肺、腎臟、胰腺、結(jié)腸、胸腺和脾臟有表達(dá)，而在睪丸、前列腺、骨骼肌和卵巢內(nèi)幾乎不表達(dá)。

2 NRF3的表達(dá)調(diào)節(jié)機制

2.1 NRF3的翻譯后修飾 在生理條件下NRF3表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，其在細(xì)胞內(nèi)主要是通過泛素-蛋白酶體途徑降解，以維持穩(wěn)定的水平，此過程可能涉及多個信號分子參與［8］。Kannan等［10］的研究首次提出含F(xiàn)框/WD重復(fù)域蛋白7（F-box/WD repeat-con?taining protein 7，F(xiàn)BW7）和糖原合成酶激酶3（glyco?gen synthase kinase 3，GSK3）共同介導(dǎo)NRF3的降解。FBW7基因編碼的蛋白屬于F-box蛋白家族的一員，為SCF型泛素連接酶識別目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵組分，可介導(dǎo)包括癌蛋白在內(nèi)的許多重要蛋白質(zhì)的泛素化，如cyclin E、c-Myc、Mcl-1、mTOR等，進而經(jīng)26S蛋白酶體降解［10］。GSK3是一種絲氨酸蛋白激酶，可通過磷酸化FBW7的結(jié)合位點而增加FBW7與其底物之間的親和力。此外，有學(xué)者提出NRF3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中通過不同的途徑降解［11］。生理條件下NRF3在胞質(zhì)內(nèi)是通過羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase degra?dation protein 1，HRD1；定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的泛素連接酶，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中底物的跨膜轉(zhuǎn)位［12］）和含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP；也稱為p97，是一種高度保守的ATP酶，通過水解ATP將多肽從膜上分離出來）進行降解，在細(xì)胞核中則通過含β-轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白重復(fù)域蛋白（β-transducin repeat-containing pro?tein，β-TrCP；F-box蛋白家族的成員，是SCF泛素連接酶E3的關(guān)鍵組分［13］）促進其泛素化降解［11］。

2.2 NRF3的核轉(zhuǎn)位 研究表明，NRF2對于機體抵抗氧化應(yīng)激具有重要作用，生理情況下細(xì)胞質(zhì)中的NRF2不斷被Cul3-Keap1泛素連接酶復(fù)合體泛素化，并經(jīng)蛋白酶體途徑迅速降解，氧化應(yīng)激會抑制NRF2在胞質(zhì)中的降解，促使未降解的NRF2轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核結(jié)合ARE而調(diào)控靶基因的表達(dá)［14-15］。當(dāng)抑制NRF3胞質(zhì)降解關(guān)鍵基因HRD1和VCP的表達(dá)時，NRF3在細(xì)胞質(zhì)積聚，但細(xì)胞核內(nèi)NRF3的含量卻未見增加，顯示NRF3入核與其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)泛素化降解無關(guān)，其核轉(zhuǎn)位機制不同于NRF2［11］。有研究表明，天冬氨酰蛋白酶DDI2（DNA-damage inducible 1 homolog 2）的N末端含有泛素樣（ubiquitin-like，UBL）結(jié)構(gòu)域，能以較弱的親和力結(jié)合泛素，已知人體內(nèi)DDI2的UBL結(jié)構(gòu)域參與NRF1核轉(zhuǎn)位前的加工，DDI2的表達(dá)下調(diào)抑制了NRF1的核轉(zhuǎn)位，并伴有胞質(zhì)內(nèi)NRF1的增加［5，16-17］。Chowdhury等［11］證實NRF3進入細(xì)胞核內(nèi)的過程與此相似，DDI2識別多聚泛素化的NRF3并對其N末端NHB2結(jié)構(gòu)域中的AWLVH基序進行切割，從而促進NRF3的核轉(zhuǎn)位；而對于NRF3哪些位點的泛素化介導(dǎo)了DDI2的識別切割，目前未有報道。

2.3 NRF3調(diào)控的靶基因 鑒定NRF3調(diào)控的靶基因有助于深入了解其在生物體內(nèi)所發(fā)揮的功能。在氧化應(yīng)激環(huán)境下，NRF2進入細(xì)胞核內(nèi)與ARE相互作用，啟動下游編碼抗氧化蛋白和II相解毒酶的基因表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護功能［18］。盡管NRF3的生物學(xué)特征在很多方面與NRF2類似，但研究發(fā)現(xiàn)其調(diào)控作用與NRF2相反：體外細(xì)胞實驗的結(jié)果表明，在氧化劑叔丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，t-BHQ）的誘導(dǎo)下，NRF3負(fù)性調(diào)控其下游基因NQO1的表達(dá)，使細(xì)胞難以抵抗氧化應(yīng)激損傷［19］。此外，NRF3還可通過結(jié)合Prdx6啟動子區(qū)域內(nèi)的ARE，進而實現(xiàn)對Prdx6基因的負(fù)性調(diào)控［20］。有學(xué)者初步分析了NRF1、NRF2和NRF3所調(diào)控基因的異同，發(fā)現(xiàn)了31個共同調(diào)控的基因，其中27個基因的調(diào)控機制相似；同時也發(fā)現(xiàn)了22個僅由NRF3調(diào)控的基因［21］。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1；由SLC2A1基因編碼）受NRF3的正向調(diào)控，這可能與癌細(xì)胞的代謝重編程過程相關(guān)［22］。盡管有報道稱UHMK1（U2AF homology motif kinase 1）是NRF3的靶基因［11］，但是UHMK1上不含有功能的ARE位點，故其可能是被NRF3間接調(diào)節(jié)［23］。

近來在干細(xì)胞分化研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)，NRF3可通過直接結(jié)合到平滑肌細(xì)胞特異性基因啟動子區(qū)域內(nèi)的CArG盒，來調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞特異性基因SMαA（smooth muscleα-actin）和SM22α（smooth muscle pro?tein 22α）的表達(dá)［24］。體外實驗研究表明，NRF3還可以直接與Pla2g7（phospholipase A2group VII）基因啟動子結(jié)合，激活Pla2g7基因表達(dá)，進而促進干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化［25］。

此外，有學(xué)者認(rèn)為NRF3可以負(fù)調(diào)控NRF2的表達(dá)，NRF2啟動子的近端區(qū)域有一個近似于ARE的功能序列，NRF3通過結(jié)合此序列來調(diào)控NRF2基因的表達(dá)［26-27］。目前對于NRF3調(diào)控的靶基因尚不十分明確，這也是NRF3的功能復(fù)雜、多樣，且不同于NRF2的原因之一。

3 NRF3的生物學(xué)功能

3.1 NRF3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用 人類癌癥基因組計劃已經(jīng)將NRF3歸入127個顯著突變基因譜中，認(rèn)為NRF3其能顯著誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生［28］?；蛐酒瑪?shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)NRF3在霍奇金淋巴瘤和套細(xì)胞淋巴瘤等多種淋巴腫瘤中高表達(dá)［29-30］。除血液系統(tǒng)惡性腫瘤外，NRF3在結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肝癌和睪丸癌等腫瘤組織中均有報道出現(xiàn)高表達(dá)［31-36］。NRF3的表達(dá)量可能與某些腫瘤的預(yù)后相關(guān)。Wang等［37］的一項回顧性研究表明，與癌旁組織相比，胰腺癌組織中NRF3的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增加，NRF3表達(dá)量高的患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且腫瘤TNM分期更高，預(yù)后更差；多變量分析表明NRF3和腫瘤病理分級可作為胰腺癌患者總體生存率的獨立預(yù)測因子。近來有研究顯示NRF2可通過結(jié)合ARE誘導(dǎo)多種抗氧化蛋白和II相解毒酶的合成，從而增強尿路上皮癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性［38］。ARE也是NRF3的結(jié)合位點，關(guān)于NRF3是否在腫瘤患者發(fā)生化療耐藥過程中起作用目前則尚未有相關(guān)報道。

NRF3在不同腫瘤發(fā)生中的作用有所差別。例如，NRF3表達(dá)與肝癌的腫瘤分級和病理T分期呈顯著正相關(guān)，敲減NRF3可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［36］。然而Chevillard等［39］的動物實驗通過管飼法讓小鼠暴露在化學(xué)致癌物苯并芘下，與野生型小鼠相比，NRF3缺失型小鼠對苯并芘更加敏感，30周后死亡率顯著增加（死亡率分別是6%和32%），組織病理學(xué)分析顯示NRF3缺失型小鼠更易患T淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤（67%），這個結(jié)果表明NRF3能抑制某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生。Sun等［33］觀察到NRF3的表達(dá)在乳腺癌中被顯著抑制，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移與分期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；過表達(dá)NRF3能顯著抑制腫瘤惡性增殖能力并延緩上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Zhou等［40］發(fā)現(xiàn)NRF3在結(jié)直腸癌中處于低表達(dá)狀態(tài)，且NRF3的低表達(dá)與更差的預(yù)后顯著相關(guān)；過表達(dá)NRF3后結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力均顯著降低。因此，NRF3對腫瘤發(fā)生（促進或抑制）的作用可能與腫瘤的類型及腫瘤所處的微環(huán)境有關(guān)。

目前NRF3在腫瘤發(fā)生過程中的確切機制尚未完全闡明，此過程可能涉及多種信號通路參與。UHMK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在有絲分裂原的激活下其表達(dá)上調(diào)并使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27Kip1磷酸化，磷酸化的p27Kip1從核內(nèi)遷移到細(xì)胞質(zhì)中，使細(xì)胞周期正常進行，UHMK1活性異常增高能促進腫瘤的發(fā)展［41］。Chowdhury等［11］通過敲減NRF3后觀察到UHMK1的mRNA和蛋白表達(dá)降低，證實了NRF3通過誘導(dǎo)UHMK1的表達(dá)來促進結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。此外，NRF3可降低下游抗氧化基因的表達(dá)，使細(xì)胞代謝過程產(chǎn)生的活性氧增加，繼而改變和破壞細(xì)胞內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)，從而促進腫瘤發(fā)生［42］。NRF3還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA；腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子）的水平來促進腫瘤進展［37］。Aono等［22］則提出了β-catenin/T細(xì)胞因子（T-cell factor，TCF）-NRF3軸促進腫瘤生成，其中APC（adenomatous polyposis coli）基因缺失是重要的第一步，其缺失導(dǎo)致β-catenin及TCF4介導(dǎo)的相關(guān)基因的激活及表達(dá)，如NRF3，進而上調(diào)GLUT1基因表達(dá)水平和促進腫瘤細(xì)胞增殖。Sun等［33］探究了NRF3抗乳腺癌的潛在機制，結(jié)果表明NRF3通過抑制AKT的磷酸化繼而影響ID3（inhibitor of DNA binding 3，HLH protein）的表達(dá)，從而發(fā)揮抗癌作用。Zhou等［40］在結(jié)直腸癌中觀察到NRF3的缺失促進表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和p38的磷酸化激活及表達(dá)增加，同時促進EGFR和p38下游分子（AKT、ATF2、CHOP等）的表達(dá)，進而增強細(xì)胞的增殖能力，促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。Waku等［43］觀察到腫瘤對NRF3的依賴性，并提出了NRF3-蛋白酶體成熟蛋白（proteasome maturation protein，POMP）-20S蛋白酶體軸介導(dǎo)的非泛素依賴蛋白質(zhì)降解；NRF3通過誘導(dǎo)POMP分子伴侶的表達(dá)，激活非泛素依賴的20S蛋白酶體裝配，降解腫瘤抑制因子p53和Rb，從而促進腫瘤的生長及惡性進展。

3.2 NRF3抑制炎癥的發(fā)生 已有研究表明NRF3可能與炎癥發(fā)生有關(guān)。Kitaya等［44］在研究人子宮微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）調(diào)節(jié)的靶基因時發(fā)現(xiàn)IFN-γ處理能上調(diào)NRF3基因的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用；動物實驗研究也表明NRF3能抑制炎癥的發(fā)生。有研究用酚類抗氧化劑丁羥甲苯處理野生型和NRF3缺陷型小鼠，可引起小鼠廣泛肺泡損傷和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，主要表現(xiàn)為呼吸困難和體重下降；與野生型小鼠相比，NRF3缺陷型小鼠體重下降更加顯著，且處理后的野生型小鼠肺組織中NRF3的表達(dá)量降低［45］。Braun等［46］研究了NRF2敲除小鼠的創(chuàng)傷修復(fù)過程，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷修復(fù)早期，參與創(chuàng)面愈合的各種關(guān)鍵分子的表達(dá)明顯減少，修復(fù)后期炎癥持續(xù)時間延長，然而NRF2敲除小鼠并沒有表現(xiàn)出明顯的組織學(xué)異常；與野生型小鼠相比，NRF2敲除小鼠在受傷前及傷后1 d的皮膚中NRF3的mRNA表達(dá)上調(diào)，其可能是NRF2無表達(dá)的代償機制，且NRF2和NRF3均可在角質(zhì)細(xì)胞生長因子（ke?ratinocyte growth factor，KGF）的作用下表達(dá)上調(diào)。

3.3 NRF3促進干細(xì)胞分化 近年來的研究還發(fā)現(xiàn)NRF3在胚胎干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化過程中起重要作用［24］。在平滑肌細(xì)胞分化過程中NRF3的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，到分化第4天時達(dá)到高峰，在干細(xì)胞分化過程中NRF3易位到細(xì)胞核內(nèi)，通過募集SRF/心肌素復(fù)合物，或直接結(jié)合平滑肌特異性基因的啟動子區(qū)域，啟動α-SMA和SM22α基因的表達(dá)［24］。此外，NRF3通過增加NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）、下調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，使超氧化物的產(chǎn)生增加，促進平滑肌分化［24］。因此，NRF3是干細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)器。Xiao等［25］在探索Pla2g7與干細(xì)胞分化的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)NRF3是Pla2g7的上游調(diào)控基因，NRF3被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后，通過轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)Pla2g7基因表達(dá)，使Pla2g7表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生超氧化物，進而介導(dǎo)血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）與平滑肌特異性基因啟動子的結(jié)合，促進平滑肌特異性基因表達(dá)。目前，NRF3在干細(xì)胞分化中的調(diào)控機制尚未完全明確，現(xiàn)有的研究大多來自體外實驗，需要后續(xù)更多的體內(nèi)研究進行驗證。

4 結(jié)語與展望

NRF3是一種受嚴(yán)格調(diào)控和轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾的轉(zhuǎn)錄因子。糖基化修飾是其重要的修飾方式，但NRF3蛋白是否存在其他轉(zhuǎn)錄后修飾對其功能的調(diào)節(jié)，如磷酸化、類泛素化和棕櫚?；揎椀壬写芯俊RF3作為干性標(biāo)志基因在干細(xì)胞分化早期上調(diào)，但是其具體作用尚未明確。雖然有研究報道了NRF3可能調(diào)控的靶基因，如Prdx6、Nqo1、α-SMA、SM22α、NOX4等，但仍缺乏它們體內(nèi)相關(guān)性的足夠證據(jù)?；虮磉_(dá)譜芯片研究顯示NRF3轉(zhuǎn)錄本在人類多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，但僅反映了其mRNA表達(dá)水平；對這些組織中誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本是編碼有功能還是突變的轉(zhuǎn)錄因子，以及亞細(xì)胞內(nèi)調(diào)控和在腫瘤發(fā)生中的具體作用機制尚未十分明確；NRF3及其相關(guān)通路將可能成為癌癥患者治療的新的潛在靶點。作為一直被忽視的CNC家族轉(zhuǎn)錄因子，NRF3的研究正逐步進入公眾視野，因此明確NRF3表達(dá)的調(diào)控因子及其調(diào)控的靶基因，以及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄因子活性的相關(guān)通路和機制，對于全面了解其在人類生理活動或疾病中的功能和調(diào)節(jié)具有重要研究意義。