睪丸附件雄激素受體表達與睪丸下降及隱睪發(fā)育情況的相關性分析

朱偉文 孫 杰

睪丸附件為胚胎時期苗勒氏管退化殘基，既往研究顯示由于苗勒氏管退化不全，苗勒管永存綜合征患者通常合并隱睪［1］。同時，近些年有部分研究發(fā)現(xiàn)隱睪患者的睪丸附件發(fā)生率較正常兒童顯著降低［2－4］。這些研究提示睪丸附件與隱睪的發(fā)生之間存在聯(lián)系。雄激素作為睪丸下降過程中重要的激素之一，對睪丸的發(fā)育也有著重要影響，在一些雄激素受體（androgen receptor，AR）缺陷的動物中，睪丸的下降以及發(fā)育都會受到顯著影響［5，6］。既往研究發(fā)現(xiàn)睪丸附件上皮表達雄激素受體，且在先天性隱睪患者中，AR呈陰性表達，而對照組和獲得性隱睪患者的睪丸附件上皮AR呈陽性表達［7］。睪丸附件AR的差異性表達或許能在一定程度上反應隱睪患者AR的表達缺陷，故其與睪丸下降之間存在潛在聯(lián)系。本研究擬對不同位置的睪丸，以及單側(cè)和雙側(cè)隱睪患者的睪丸附件上AR的表達進行分析，運用圖像分析方法對AR的表達進行半定量測定，結(jié)合術(shù)前睪丸超聲檢查結(jié)果，進一步探究睪丸附件與睪丸下降及睪丸發(fā)育之間的聯(lián)系。

材料與方法

一、研究對象

收集2019年11月至2020年5月由上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心收治的39例先天性隱睪及獲得性隱睪患者作為研究對象。排除隱睪合并鞘膜積液或腹股溝斜疝；隱睪合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病或染色體畸形。將隱睪患者分為先天性隱睪（n＝28）和獲得性隱睪（n＝11），并按照隱睪患者的睪丸位置分為腹腔型隱睪（n＝7）、腹股溝上段型隱睪（n＝25）和腹股溝下段型隱睪（n＝7）。本研究中，睪丸位置均根據(jù)術(shù)中實際情況確定。

二、研究內(nèi)容及相關定義

收集患者的年齡、術(shù)前睪丸超聲檢查結(jié)果、睪丸附件大小、隱睪患者的睪丸位置、單側(cè)或雙側(cè)隱睪。先天性隱睪為出生后即發(fā)現(xiàn)睪丸未下降至陰囊內(nèi)；獲得性隱睪為出生時已下降至陰囊內(nèi)的睪丸，自發(fā)上升至陰囊上方、腹股溝，甚至內(nèi)環(huán)水平，并長久停留于睪丸下降不全的位置。本研究中，術(shù)前超聲檢查均于術(shù)前2周內(nèi)完成。睪丸容積計算采用Lambert經(jīng)驗公式：睪丸容積＝睪丸長徑×寬徑×高徑×0.71。所有隱睪患者經(jīng)術(shù)中探查，若發(fā)現(xiàn)存在睪丸附件則均予切除后送病理學檢查，對于睪丸附件上皮大部分脫落或未見明顯上皮的標本不納入統(tǒng)計，經(jīng)免疫組化標記AR后。運用Imagine pro plus軟件對AR的表達進行半定量分析，并進行統(tǒng)計學分析。

二、研究方法

本研究中睪丸附件標本經(jīng)過常規(guī)石蠟包埋水化后，采用體積分數(shù)為3%的過氧化氫溶液在室溫下處理組織樣本10 min，以阻斷病理組織中過氧化氫酶的活性，隨后采用EDTA（pH＝9）溶液高溫水浴，持續(xù)10 min修復抗原。本研究的一抗為兔抗單克隆抗體，購自邁新公司（RMA-0807）。

所有染色切片經(jīng)過免疫組化染色后采用多頭顯微鏡進行觀察，隨機選擇每例切片下的3個高倍鏡（×200）視野，并利用Imagine pro plus軟件選擇每個視野下的睪丸附件上皮或上皮樣細胞作為光密度測量區(qū)域（area of interest，AOI），利用軟件測定所選定區(qū)域陽性細胞的平均光密度值，并以3個視野下測得的平均光密度值的平均值作為該樣本最終的平均光密度值。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)加減標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。對于不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)和四分位間距M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用Pearson相關性分析及線性回歸進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

本研究共納入39例隱睪患者，共收集47個睪丸附件。其中單側(cè)隱睪患者19例，共19個睪丸附件，雙側(cè)隱睪患者20例，共28個睪丸附件。先天性隱睪共28例，共29個睪丸附件，其中單側(cè)隱睪16例，共16個睪丸附件，雙側(cè)隱睪12例，共13個睪丸附件；獲得性隱睪11例，共18個睪丸附件，其中單側(cè)隱睪3例，共3個睪丸附件，雙側(cè)隱睪8例，共15個睪丸附件。單側(cè)隱睪患者中位年齡為12（12，32）個月，雙側(cè)隱睪患者中位年齡為36.5（12，60）個月。在根據(jù)睪丸位置進行分組后，腹腔型隱睪患者7例，共7個睪丸附件，腹股溝上段型隱睪25例，共28個睪丸附件，腹股溝下段型隱睪患者7例，共12個睪丸附件，具體見表1。

表1 睪丸及睪丸附件數(shù)量分組Table 1 Number of testis and testis appendix

在28例先天性隱睪患者中，13例雙側(cè)隱睪附件僅有4例AR陽性表達，陽性率為30.7%（4／13），單側(cè)隱睪患者的睪丸附件AR均陽性表達，陽性率為100%（16／16），差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝16.062，P＜0.001）。11例獲得性隱睪患者的18個睪丸附件中AR均陽性表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.05）。經(jīng)軟件對睪丸附件AR的表達進行半定量分析，結(jié)果顯示，腹腔型隱睪中，AR平均光密度的中位數(shù)為22×10－4（2×10－4，154×10－4），腹股溝上段型隱睪為115×10－4（46×10－4，315×10－4），腹股溝下段型隱睪為220×10－4（120×10－4，480×10－4），差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.057）。僅腹腔型與腹股溝上段型隱睪的附件AR的平均光密度差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.045），見圖1。

圖1 不同睪丸位置下睪丸附件AR平均光密度Fig.1 The mean optical density of AR in appendix testis in different testis location

隱睪患者術(shù)前超聲檢查結(jié)果提示，雙側(cè)隱睪患者中，左側(cè)睪丸平均容積為（564.98±224.56）mm3，右側(cè)睪丸平均容積為（576.91±291.42）mm3，差異無統(tǒng)計學意義（t＝－0.134，P＝0.894）。在單側(cè)隱睪患者中，患側(cè)睪丸容積的中位數(shù)為437.36（370.26，628.70）mm3，健側(cè)睪丸容積的中位數(shù)為727.04（498.42，965.60）mm3，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝－0.346，P＝0.001）。患側(cè)睪丸容積與患側(cè)睪丸附件AR的平均光密度之間無明顯相關（P＝0.098）。患側(cè)睪丸長徑與對應睪丸附件AR平均光密度值有線性關系（R2＝0.264，P＝0.035）?；紓?cè)與健側(cè)睪丸長徑比、健側(cè)睪丸的長徑與患側(cè)睪丸附件AR的平均光密度值之間無明顯相關性（P＝0.893；P＝0.071），見圖2。在獲得病理標本后，經(jīng)大體測量，睪丸附件體積與睪丸附件AR平均光密度值之間無明顯相關性（P＝0.401），見圖3。

圖2 睪丸附件AR平均光密度與睪丸長徑、容積的相關性Fig.2 Correlations between mean optical density of AR in appendix testis，testis length and testis volume

圖3 睪丸附件免疫組化結(jié)果 注 A：單側(cè)隱睪睪丸附件圖（×200）；B：先天性雙側(cè)隱睪睪丸附件圖，黑色箭頭標注為AR陽性區(qū)域（×200）Fig.3 Immunochemical staining of appendix testis

討 論

睪丸的下降分兩個階段，第一階段為腹腔－腹股溝下降階段，大約發(fā)生于胚胎第8～15周［8］。目前認為睪丸leydig細胞分泌的胰島素樣因子3（insulin-like peptide 3，INSL-3）在這一過程中起主要作用，其作用的發(fā)揮可能與睪丸引帶上的INSL-3受體有關。睪丸下降的第二階段為腹股溝－陰囊階段，這一過程大約發(fā)生于胚胎第25～35周，雄激素在這個過程中可能控制著睪丸懸韌帶的退化以及睪丸引帶的發(fā)育，并通過雄激素受體介導［9］。此外，睪丸Sertoli細胞分泌的抗苗勒氏激素（anti-Mullerian hormone，AMH）也可能對睪丸的下降產(chǎn)生一定的影響［10］。目前研究顯示，胚胎時期暴露于環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物可能與許多泌尿生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關，這些內(nèi)分泌干擾物在結(jié)構(gòu)上類似于雌激素，并與睪丸生殖障礙綜合征（testicular dysgenesis syndrome，TDS）有直接聯(lián)系，而隱睪則是TDS的一種表現(xiàn)［11－13］。由于雄激素與睪丸下降之間關系緊密，隱睪的發(fā)生可能與雄激素的紊亂有關。近年來一些研究顯示隱睪患者促性腺激素升高，但是雄激素水平與正常兒童之間無明顯差異［14］。有動物實驗顯示隱睪睪丸的AR表達水平較正常下降，隱睪的發(fā)生可能與雄激素受體表達缺陷有關［15］。還有文獻顯示隱睪患者的睪丸引帶、陰囊皮膚和陰囊肉膜中的AR呈低水平表達，睪丸下降不全可能與患者AR的表達異常有關［16］。但是，目前這方面的研究仍以動物實驗為主，近來有文獻報道隱睪患者的睪丸附件發(fā)生率較正常兒童低，且睪丸的位置越高，睪丸附件發(fā)生率越低，而在一些苗勒氏管永存綜合征患者中，常伴有隱睪［17，18］。因此，睪丸附件作為苗勒氏管的退化殘基，其與睪丸的下降可能有一定聯(lián)系。睪丸附件作為睪丸周圍組織之一，其AR的表達或許能反映隱睪患者的睪丸或睪丸周圍組織AR表達情況。既往研究顯示先天性隱睪患者的睪丸附件上皮不表達AR，而在獲得性隱睪患者中，睪丸附件上皮均表達AR。但在對先天性隱睪患者的睪丸附件進行PCR測定后同樣發(fā)現(xiàn)了AR的mRNA表達［19，20］。先天性隱睪患者睪丸附件的AR呈陰性表達，而mRNA呈陽性表達，提示先天性隱睪患者可能存在AR的蛋白表達缺陷，致使雄激素不能發(fā)揮應有的作用，而導致睪丸下降不全。本研究觀察到先天性隱睪患者和獲得性隱睪患者的睪丸附件上皮均存在AR的表達。但是，在雙側(cè)先天性隱睪患者中，僅部分睪丸附件表達AR。而既往研究發(fā)現(xiàn)，相較于單側(cè)隱睪患者，雙側(cè)隱睪患者伴有更低的抑制素B和更高的黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）［21］。該研究提示雙側(cè)隱睪患者存在睪丸激素的分泌異常，更高的LH和FSH可能提示性激素分泌不足。同時，對單側(cè)隱睪的研究發(fā)現(xiàn)，其存在正常的小青春期雄激素分泌峰和青春期雄激素分泌峰，且在6～12個月的單側(cè)隱睪患者中，AMH和抑制素B水平以及睪丸容積均與正常兒童無明顯差異［22，23］。單側(cè)隱睪的發(fā)生機制或許與激素的關系不緊密。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)隱睪睪丸的AR表達水平下降，雙側(cè)隱睪的發(fā)生與母親孕期間吸煙導致的激素水平改變以及胎盤功能受損有關［24，25］。同樣，有研究發(fā)現(xiàn)在一些雙側(cè)未觸及睪丸的隱睪患者中，抑制素B水平會顯著下降，而促性腺激素水平則顯著高于可觸及睪丸組，該研究提示雙側(cè)未觸及睪丸患者的睪丸功能低下，睪丸生精上皮以及Sertoli細胞發(fā)育不全［26］。而長期隨訪發(fā)現(xiàn)，睪丸的生育功能主要依賴于一個正常的小青春期的建立。雙側(cè)隱睪患者在接受激素治療后，原本“有缺陷”的小青春期激素水平得到改善［27］。而單純手術(shù)治療并不能避免生育功能的下降［28］。這些研究均提示雙側(cè)隱睪的發(fā)生與激素水平關系緊密，且可能同時伴有AR表達異常。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙側(cè)先天性隱睪睪丸附件AR表達陽性率低于單側(cè)隱睪睪丸附件。該結(jié)果再次提示雙側(cè)隱睪患者存在激素水平異?；蛐奂に厥荏w表達缺陷，而單側(cè)隱睪的發(fā)生則可能與激素或激素受體的相關性較弱。此外，雄激素在睪丸的腹腔－腹股溝下降階段中也有一定作用，在一些雄激素不敏感綜合征患者中，常伴有腹腔型隱睪［29，30］。Sinopidis采用Allred評分方法對睪丸附件的AR表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)AR的表達水平與睪丸的位置無關［31］。本研究中，不同隱睪睪丸位置下，睪丸附件AR值無明顯差異，可能與本研究樣本量較少有關。

苗勒氏管由胚胎時期體腔上皮向著中腎管的頭端內(nèi)陷形成。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)外層的苗勒氏表層上皮細胞（Mullerian surface epithelia，MSE）和內(nèi)層的苗勒氏管上皮細胞（Mullerian duct epithelium，MDE）均來自胚胎體腔上皮細胞［32］。睪丸附件為苗勒氏管的退化殘基，其上皮細胞來源于胚胎體腔上皮。既往研究發(fā)現(xiàn)睪丸sertoli細胞可能部分來源于胚胎體腔上皮［33，34］，Sertoli細胞的發(fā)育與AR的表達相關［35］。這些研究結(jié)果可能提示睪丸附件上皮與Sertoli細胞具有同源性，睪丸附件上皮AR的表達情況或許能反映Sertoli細胞以及睪丸的發(fā)育情況。本研究發(fā)現(xiàn)隱睪患者的睪丸附件AR的平均光密度值與患側(cè)睪丸長徑成正比，提示睪丸附件AR的表達水平可能與睪丸的發(fā)育有關。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)先天性雙側(cè)隱睪患者中，僅部分睪丸附件上皮細胞表達AR，可能再次提示雙側(cè)隱睪患者存在Sertoli細胞功能不全以及睪丸發(fā)育不良［36，37］。與睪丸位置較低的隱睪患者相比，腹腔型隱睪患者成年后的生育能力會降低［38］。這與本研究結(jié)果類似，睪丸的位置越高，睪丸的發(fā)育情況可能越差。

既往研究顯示，在單側(cè)未觸及隱睪患者中，健側(cè)睪丸的長徑增大，健側(cè)睪丸長徑＞1.7 cm可用于預測患側(cè)未觸及睪丸的發(fā)育情況［39，40］。在本研究中，僅患側(cè)睪丸的長徑與睪丸附件的AR表達水平具有相關性，這可能與本研究中健側(cè)睪丸代償肥大程度較小有關。

本研究還存在以下不足。首先，本研究最終納入的睪丸附件標本數(shù)量仍較少。其次，本研究中缺少與睪丸發(fā)育相關的血液激素指標，對睪丸發(fā)育情況的判定可能存在偏差。最后，超聲檢查對睪丸大小的測量精確度稍差，睪丸容積的計算誤差較大，這可能是本研究中睪丸容積與睪丸附件AR平均光密度無相關性的原因之一。今后研究需要增加樣本量，同時建議對睪丸附件AR的mRNA水平進行測定。

隱睪患者睪丸附件雄激素受體的表達水平可能與睪丸位置以及睪丸的發(fā)育情況有關。雙側(cè)隱睪的發(fā)生可能與激素關系緊密，通過對隱睪睪丸附件AR的研究，能在一定程度上反映隱睪的發(fā)生機制。本研究提示了睪丸附件雄激素表達與睪丸下降及睪丸發(fā)育之間有相關性，這為研究隱睪的發(fā)生機制提供了新思路。