miR-126基因啟動子甲基化狀態(tài)與高危低級別膠質(zhì)瘤同步放化療后生存結(jié)局的關(guān)系

平建峰 麻來峰 林昌福

低級別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma，LGG）具有顯著的個(gè)體差異性，生存時(shí)間可長達(dá)10 年以上[1]。目前，其最佳治療方案仍有爭議。近年來，染色體1p/19q 聯(lián)合缺失以及異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）基因突變等與LGG 更好的預(yù)后和放化療反應(yīng)有關(guān)[2]。越來越多的研究顯示微小核糖核酸（microRNA，miRNA）有望成為腫瘤病人臨床靶向治療和個(gè)體化治療的潛在生物標(biāo)志物。miR-126 是位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7 宿主基因第9q34.3 號染色體上的重要miRNA，與腦膠質(zhì)瘤的放化療敏感性有關(guān)[3]。本文探討miR-126 基因啟動子甲基化狀態(tài)與高危LGG 病人同步放化療后生存結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ級，病理檢查證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤或混合膠質(zhì)細(xì)胞瘤，未行腫瘤全切術(shù)，且存在以下3種或以上高危因素（年齡≥40歲；術(shù)前腫瘤直徑≥6 cm；腫瘤越過中線；星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤/混合型組織學(xué)特征；術(shù)前神經(jīng)功能狀態(tài)＞1級，即中、重度）；②術(shù)前未接受放、化療；③術(shù)前Zubrod-ECOG-WHO 評分0～2 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙或其他部位原發(fā)惡性腫瘤；②伴有嚴(yán)重高血壓病史、出血傾向、抗凝治療；③既往接受過頭頸部放療或化療。

前瞻性收集2015年7月至2016年9月術(shù)后病理證實(shí)為高危LGG 共69 例。選取同期因顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)切除的非腫瘤腦組織樣本20 例為對照。本研究經(jīng)本院倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 術(shù)后均接受同步放化療。使用西門子加速器精確調(diào)強(qiáng)技術(shù)或三維適形技術(shù)進(jìn)行放療，根據(jù)頭顱CT/MRI 確定勾畫靶區(qū)，放療劑量為2 Gy/次，2次/d，5d/周，共持續(xù)6周，總劑量為60 Gy。放療前開始口服替莫唑胺，采用stupp方案。若不良反應(yīng)較嚴(yán)重，且對癥治療無效，則減量[替莫唑胺劑量最低不得＜100 mg/（m2·d）]或停藥處理。

1.3 檢測方法

1.3.1 采用RT-qPCR 法檢測miR-126 表達(dá) 使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）提取組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（美國Promega 公司）合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（美國Applied Biosystems公司），擴(kuò)增條件：95 ℃1 min，62 ℃1 min，72 ℃1.5 min；共35 個(gè)循環(huán)。以U6 mRNA 為內(nèi)源性參考基因。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行量化分析。每個(gè)樣本進(jìn)行3次PCR檢測。

1.3.2 miR-126 啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)分析 使用DNeasy 血液和組織試劑盒提取基因組DNA。根據(jù)EpiTect Bisulfite Kit（德國Qiagen 公司）說明書對DNA樣本進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，并用Wizard DNA純化樹脂（美國Promega公司）對修飾后的DNA進(jìn)行純化。以CpGenome Universal Methylated DNA（美國MilliporeSigma公司）作為陽性對照，使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA 為模板，采用Pyromark PCR 試劑盒（德國Qiagen 公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（95 ℃初始變性10 min，共35個(gè)循環(huán)：94 ℃15 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，最終延伸在72 ℃10 min）。PCR產(chǎn)物經(jīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用PyromarkTMQ24 焦磷酸測序儀進(jìn)行焦磷酸測序，測序結(jié)果采用PyromarkTMQ24v2.0.6軟件（德國Qiagen公司）進(jìn)行分析。

1.4 近期療效 根據(jù)實(shí)體腫瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[4]：完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（partial remission，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展期（progressive disease，PD）。CR+PR 為放化療敏感組，SD+PD為不敏感組。

1.5 隨訪 隨訪截止時(shí)間為2021年5月31日，69例膠質(zhì)瘤隨訪19～55 個(gè)月，中位時(shí)間27 個(gè)月。主要終點(diǎn)為無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）。PFS 定義為手術(shù)至觀察到疾病進(jìn)展的時(shí)間，OS定義為手術(shù)至發(fā)生任何原因死亡的時(shí)間或隨訪截止時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)；采用Spearman 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性；采用多因素logistic回歸分析放化療敏感性的影響因素；采用多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析生存結(jié)局的影響因素；繪制Kaplan-Meier 生存曲線分析生存時(shí)間，采用log 檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高危LGG組織miR-126表達(dá)水平和甲基化狀態(tài)LGG 組織miR-126 表達(dá)水平顯著低于非腫瘤腦組織（P＜0.001），同時(shí)miR-126 基因啟動子甲基化率（49.28%，34/69）明顯高于非腫瘤腦組織組（20.00%，4/20；P＜0.05）。見圖1。

圖1 高危低級別膠質(zhì)瘤組織miR-126水平及其基因啟動子甲基化水平檢測

2.2 高危LGG組織miR-126表達(dá)和基因啟動子甲基化狀態(tài)的關(guān)系miR-126 基因啟動子甲基化組miR-126 表達(dá)水平（0.496±0.174）明顯低于非甲基化組（0.868±0.187；P＜0.001）。高危LGG組織miR-126表達(dá)水平和其基因啟動子甲基化水平呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.722；P＜0.001）。

2.3 高危LGG組織miR-126表達(dá)水平和基因啟動子甲基化狀態(tài)與同步放化療敏感性的關(guān)系69例中，放化療敏感33例，不敏感36例。敏感組高危LGG組織miR-126表達(dá)水平（0.912±0.131）明顯高于不敏感組（0.476±0.147；P＜0.05）。敏感組高危LGG組織miR-126啟動子甲基化率（18.18%，6/33）明顯低于不敏感組（77.78%，28/36；P＜0.05）。多因素logistic 回歸分析顯示膠質(zhì)瘤組織miR-126基因啟動子高甲基化率是高危LGG 同步放化療不敏感的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=1.078；95%CI 1.023～1.268；P＜0.001）。

2.4 高危LGG病人生存結(jié)局的影響因素 多因素Cox回歸分析顯示，膠質(zhì)瘤組織miR-126 基因啟動子高甲基化是高危LGG同步放化療生存結(jié)局不良的獨(dú)立危 險(xiǎn) 因 素（HR=1.212；95% CI 1.093～1.645；P=0.001）。

2.5 膠質(zhì)瘤組織miR-126甲基化狀態(tài)與高危LGG病人同步放化療后生存時(shí)間的相關(guān)性 根據(jù)miR-126基因啟動子甲基化狀態(tài)，甲基化組和非甲基化組。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，膠質(zhì)瘤組織miR-126基因啟動子甲基化組OS、PFS 較非甲基化組明顯延長（P＜0.001；圖2）。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析miR-126基因啟動子甲基化狀態(tài)與高危LGG同步放化療生存結(jié)局的關(guān)系

3 討論

目前，LGG多采取手術(shù)治療，但大部分病人仍會復(fù)發(fā)或進(jìn)展，尤其是高危LGG；因此絕大多數(shù)高危LGG更傾向于術(shù)后進(jìn)行同步放化療。我們發(fā)現(xiàn)高危LGG 組織miR-126 呈低表達(dá)，且與近期放化療療效和遠(yuǎn)期生存結(jié)局有關(guān)，因此，miR-126可能在預(yù)測高危LGG病人預(yù)后中有一定價(jià)值。

在腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞與周圍成分間的通信可能直接影響腦膠質(zhì)瘤的特征，如腫瘤細(xì)胞可以通過微環(huán)境改變非腫瘤性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表型，進(jìn)而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的生長和侵襲[5]，而細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的miRNA 可通過調(diào)節(jié)鄰近細(xì)胞甚至遙遠(yuǎn)細(xì)胞的表型在細(xì)胞-細(xì)胞通信中發(fā)揮重要作用。目前，已有多種miRNA 被證實(shí)參與腦膠質(zhì)瘤的病理機(jī)制[6，7]。miR-126 被證實(shí)具有一定的抑癌基因活性，其下游靶基因，如整聯(lián)蛋白α-6、高爾基體磷蛋白3、成熟T細(xì)胞增殖蛋白1、GATA74 等在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞骨架形成等過程中具有重要作用[8～11]。有學(xué)者認(rèn)為高危LGG 預(yù)后與IDH1/2 突變相關(guān)，IDH突變會導(dǎo)致STAT1蛋白降低，通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞吸引趨化因子、影響CD8+T 細(xì)胞的累積影響LGG免疫環(huán)境[12]。

DNA 甲基化、組蛋白修飾在內(nèi)的表觀遺傳機(jī)制的基因表達(dá)調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，異常的表觀遺傳調(diào)控可以導(dǎo)致基因表達(dá)改變和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Cui等[13]研究發(fā)現(xiàn)，40%的腦膠質(zhì)瘤miR-126啟動子存在高甲基化狀態(tài)。本文證實(shí)腦膠質(zhì)瘤組織miR-126基因啟動子甲基化率明顯高于正常腦組織組，且膠質(zhì)瘤組織miR-126 水平和其基因啟動子甲基化呈明顯負(fù)相關(guān)。這說明表觀遺傳修飾是影響miR-126在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的重要機(jī)制之一。此外，本文結(jié)果表明膠質(zhì)瘤組織miR-126 基因啟動子非甲基化病人比甲基化病人擁有更長的PFS及OS。

總之，DNA 甲基化是調(diào)節(jié)miR-126 表達(dá)的重要機(jī)制之一，兩者呈負(fù)相關(guān)。膠質(zhì)瘤組織miR-126 高甲基化率是導(dǎo)致高危LGG 病人同步放化療不良結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此檢測膠質(zhì)瘤組織miR-126基因啟動子甲基化狀態(tài)有助于臨床對高危LGG 病人同步放化療效果及預(yù)后的評估。