周 珊，劉向榮，范秀珍

（邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南 邵陽(yáng) 422000）

過(guò)敏性鼻炎（AR）是臨床常見(jiàn)耳鼻喉科變應(yīng)性疾病，發(fā)病率較高，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的鼻腔瘙癢、流鼻涕、噴嚏陣發(fā)性發(fā)作、鼻塞聲重等癥狀[1－3]，臨床多使用抗組胺藥治療，但會(huì)產(chǎn)生中樞抑制作用，長(zhǎng)期用藥療效欠佳，且副作用較多。鼻淵軟膠囊可用于AR 及鼻竇炎的治療，現(xiàn)代臨床研究顯示，其可有效改善AR 患者機(jī)體的組胺水平，減輕炎性應(yīng)激反應(yīng)。由于中藥的多成分特性[4－6]，目前關(guān)于其作用機(jī)制鮮有研究。近年來(lái)興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為闡明中藥復(fù)方作用機(jī)制提供了思路，其融合了藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)等多學(xué)科，從多靶點(diǎn)的研究策略出發(fā)將藥物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，強(qiáng)調(diào)多個(gè)成分對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)，這與中藥多成分－多靶點(diǎn)的特點(diǎn)不謀而合[7－9]。本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 可能的作用機(jī)制，為該藥進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 研究方法

1.1 有效成分篩選

通過(guò)中草藥系統(tǒng)藥理學(xué) 平臺(tái)（TCMSP）（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）捕捉藥物、靶標(biāo)與疾病間可能存在的關(guān)系。數(shù)據(jù)庫(kù)中包括499 味中草藥與每味中草藥的化合物約29 000 個(gè)。以鼻淵軟膠囊各個(gè)單味藥為關(guān)鍵詞，在TCMSP 上檢索其化學(xué)成分。鼻淵軟膠囊為口服制劑，服用后需經(jīng)吸收、分布、代謝、排泄（ADME），故可根據(jù)化合物的類藥性（DL）、口服生物利用度（OB）、血腦屏障(BBB)、半衰期（HL）快速篩選出可能的活性成分，借助TCMSP 平臺(tái)，將DL≥0.18，OB≥30，BBB≥－0.3，HL≥4h 作為篩選5 味藥有機(jī)小分子活性成分的重要指標(biāo)。

1.2 潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及化合物－潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的潛在活性成分在有機(jī)小分子數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）中下載其Smile 格式文件，將轉(zhuǎn)化好的格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：／ ／swisstargetprediction.ch／），選擇限定物種為Homo sapiens。運(yùn)行后獲得其潛在靶點(diǎn)，通過(guò)P 值選取其潛在靶點(diǎn)。將獲得的潛在靶點(diǎn)名稱導(dǎo)入U(xiǎn)niport（https：／ ／www.uniprot.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其official name。

1.3 AR 相關(guān)靶標(biāo)篩選

通 過(guò) 檢 索GeneCards（www.genecards.org）／OMIM（http：／ ／www.omim.org／），TTD（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／），CTD（http：／ ／ctdbase.org／）等 數(shù) 據(jù)庫(kù)，將“過(guò)敏性鼻炎”“allergic rhinitis”作為檢索關(guān)鍵詞，通過(guò)P 值和靶點(diǎn)得分篩選高分靶點(diǎn)，作為與AR 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.4 活性成分－潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和AR 疾病核心靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

通過(guò)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于從生物化學(xué)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等系統(tǒng)的角度詮釋治療疾病分子調(diào)控機(jī)制。將1.3 項(xiàng)下收集的鼻淵軟膠囊活性成分潛在靶點(diǎn)和AR 疾病靶點(diǎn)上傳至韋恩圖在線繪圖軟件Venny 2.1（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），獲 取 其潛在靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，將重合的靶點(diǎn)作為鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 的核心靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入String（https：／ ／string－db.org／），得到交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建鼻淵軟膠囊活性成分－潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和AR PPI。

1.5 核心靶點(diǎn)基因本體論（GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集

將鼻淵軟膠囊干預(yù)的AR 核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)可將生物信息資源融為一體，綜合闡述蛋白或基因的生物學(xué)功能。對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路分析，其中GO 富集包括分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞組成三部分，設(shè)定閾值P ＜0.05，保存結(jié)果，并按涉及的靶點(diǎn)數(shù)目多少進(jìn)行排序，篩選排名靠前的生物過(guò)程或通路，選取排名前20的GO 富集結(jié)果及KEGG 通路富集結(jié)果，采用Python 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析，總結(jié)鼻淵軟膠囊調(diào)節(jié)AR 可能的作用機(jī)制，并構(gòu)建化合物－核心靶點(diǎn)－通路圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

共收集到40 個(gè)化學(xué)成分，其中蒼耳子6 個(gè)、金銀花8 個(gè)、野菊花4 個(gè)、辛夷12 個(gè)、茜草10 個(gè)，詳見(jiàn)表1(因篇幅有限，省去Molecule Name)。

表1 鼻淵軟膠囊中活性成分篩選結(jié)果Tab.1 Results of screening active ingredients of Biyuan Soft－Capsules

2.2 潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及PPI 構(gòu)建

獲得潛在活性成分靶點(diǎn)421 個(gè)，去重后得到244 個(gè)。構(gòu)建化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 鼻淵軟膠囊潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及化合物－潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Prediction of potential targets and the network of compound－potential targets of Biyuan Soft－Capsules

2.3 活性成分干預(yù)AR 的核心靶點(diǎn)篩選

通過(guò)Genecard，OMIM，CTD 等靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)篩選AR 相關(guān)靶點(diǎn)，去重后獲得AR 靶點(diǎn)294 個(gè)，將2.2 項(xiàng)下預(yù)測(cè)的潛在靶點(diǎn)與AR 疾病靶點(diǎn)相互映射，最終獲得鼻淵軟膠囊可能干預(yù)AR 的相關(guān)靶點(diǎn)52 個(gè)，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)的度值和介值中心度為描述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的指標(biāo)[10]，這2 個(gè)指標(biāo)調(diào)節(jié)顏色深淺和大小，以表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度，詳見(jiàn)圖2。通過(guò)Cytoscape 3.7.1 中的NetworkAnalyzer 功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，經(jīng)計(jì)算該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)共有67 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 238 條邊，網(wǎng)絡(luò)介度中心度為0.454。

圖2 鼻淵軟膠囊活性成分干預(yù)過(guò)敏性鼻炎核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of core targets of active ingredients of Biyuan Soft－Capsules in the intervention of allergic rhinitis

2.4 核心靶點(diǎn)GO 富集和KEGG 通路分析

對(duì)獲得的67 個(gè)鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路注釋分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。生物學(xué)過(guò)程富集到P≤0.01 的生物過(guò)程有375 條。主要涉及對(duì)多肽反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、循環(huán)系統(tǒng)過(guò)程等；分子功能富集結(jié)果中，富集到P≤0.01 的分子功能有92 條，主要涉及激酶結(jié)合、核受體活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等；細(xì)胞組成富集結(jié)果中，富集到P≤0.01 的細(xì)胞組成有18 個(gè)，涉及細(xì)胞組成受體復(fù)合物、膜筏、質(zhì)膜等。以上結(jié)果分別選取前20 條（其中GO 富集選取18 條），以對(duì)數(shù)(－lg P)值排序，繪制柱狀圖。其中，縱坐標(biāo)為GO 條目名稱，橫坐標(biāo)為靶點(diǎn)數(shù)目值，其值表示富集在該GO 條目上的靶點(diǎn)數(shù)，柱狀長(zhǎng)度代表P 值，以－lg P 表示。67 個(gè)核心靶點(diǎn)主要參與調(diào)控炎癥通路、氧化應(yīng)激通路?？梢?jiàn)，鼻淵軟膠囊的活性成分可能通過(guò)參與調(diào)控上述信號(hào)通路干預(yù)AR。

圖3 鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 作用靶點(diǎn)生物學(xué)分析結(jié)果Fig.3 Results of biological analysis of target of Biyuan Soft－Capsules in the intervention of allergic rhinitis

3 討論

AR 屬常見(jiàn)鼻黏膜非感染性炎性疾病，患者接觸變應(yīng)原后由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的炎性應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致組胺釋放增加及多種免疫活性細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的鼻黏膜慢性非感染性炎性疾病[11]，可引發(fā)陣發(fā)性打噴嚏、鼻癢、鼻塞等癥狀，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)其他疾病，甚至使患者喪失勞動(dòng)力。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、變應(yīng)原暴露、環(huán)境等因素，涉及炎性刺激、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等各個(gè)方面[12－13]。因此，單一使用化學(xué)藥難以獲得滿意的療效。AR 屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，多見(jiàn)于肺氣、脾氣、腎氣虛衰，導(dǎo)致抵御外邪不足、情志失調(diào)，鼻竅失養(yǎng)，肺氣宣發(fā)肅降受阻[14]。鼻淵軟膠囊，由蒼耳子、金銀花、野菊花、辛夷、茜草制成，有清熱解毒、發(fā)散風(fēng)寒、通鼻竅等功效。臨床常用來(lái)治療AR 的鼻塞等癥狀。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鼻淵軟膠囊具有收縮鼻黏膜血管的作用，并能促進(jìn)分泌物吸收，從而改善鼻孔的通氣功能。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以“活性成分－靶點(diǎn)－疾病”多層次的相互作用網(wǎng)絡(luò)為理念，結(jié)合對(duì)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選和預(yù)測(cè)，運(yùn)用可視化網(wǎng)絡(luò)分析軟件，綜合觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，具有整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，鼻淵軟膠囊可能干預(yù)AR 的52 個(gè)核心靶點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其有效成分為揮發(fā)油類。通過(guò)進(jìn)行“藥效成分－靶標(biāo)－通路”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，鼻淵軟膠囊的有效成分可作用于不同靶點(diǎn)與同一通路相連，相同靶點(diǎn)也可與不同通路相連，說(shuō)明該藥可能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)及多途徑發(fā)揮藥效。

本研究中，鼻淵軟膠囊中40 個(gè)潛在活性成分共涉及40 個(gè)成分、128 條通路，52 個(gè)核心靶標(biāo)蛋白和15 條通路與AR 相關(guān)。分析結(jié)果表明，鼻淵軟膠囊可能通過(guò)作用于神經(jīng)活性受體配體相互作用通路、HIF－1 通路、鈣信號(hào)通路、膽堿能突觸通路等通路相關(guān)的靶標(biāo)起到通鼻竅的功效。初步揭示了鼻淵軟膠囊的潛在活性成分及其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。本研究雖采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)鼻淵軟膠囊主要藥效成分的機(jī)制作了預(yù)測(cè)分析，但還需通過(guò)生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。