黃振, 李強, 李玉華, 李佳蔓, 陳炙, 楊勇智, 慕長龍*

1.四川省林業(yè)科學研究院，森林和濕地生態(tài)恢復與保育四川重點實驗室，四川 成都 610081；

2.高縣月江國有林場，四川 宜賓 645152

杉 木 [(Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook)]是我國特有的用材林樹種，是南方各省區(qū)最重要的鄉(xiāng)土造林樹種之一，我國人民使用杉木的歷史逾8 000年[1]。因此，對杉木進行持續(xù)、多目標的遺傳改良，對于提高杉木遺傳增益，培育多用途杉木品種具有重要意義。

杉木種子園是生產(chǎn)杉木良種的主要單元，也是進行杉木育種的重要載體，開展種子園人工控制授粉和遺傳評價，建立世代清晰的高世代種子園和高改良輪次種子園是有效利用杉木遺傳增益并保持種子園較高遺傳基礎的途徑，為了充分發(fā)揮種子園的效能，育種工作者對杉木生殖發(fā)育、花粉散布規(guī)律進行了研究，對杉木大小孢子發(fā)育進程有較為完整的了解。而杉木在長期的進化過程中，為適用各地的氣候，導致不同種源之間物候期的特征差異較大[2]，四川是杉木分布的西部核心分布區(qū)，與東部和中部分區(qū)的杉木在物候上存在差異，而四川杉木減數(shù)分裂時期，小孢子葉球與小孢子發(fā)育的行為特征未見報道，杉木雄球花采集過早，小孢子尚處于發(fā)育階段，干燥過程中容易失活死亡，采完了，則花粉開始散落，收集效果不佳。

以四川杉木種子園為研究對象，對同一小孢子葉球、同一小孢子葉上花粉的發(fā)育成熟狀態(tài)進行了研究，并比較了不同基因型杉木花粉散布時期，以期為杉木雜交授粉中的花粉精準采收奠定基礎。

1 研究區(qū)概況

供試杉木位于宜賓市高縣月江國有林場的杉木2代種子園，屬中亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫 16.5 ℃，≥10 ℃ 的年積溫 5 288 ℃，年降水量1 214.4 mm，多集中在 4—9 月，年蒸發(fā)量 1 034.3 mm，相對濕度 85%，年平均日照時數(shù) 1 064.6 h，熱量高，雨量豐沛，無霜期長，四季分明，下半年雨熱同季。基地土壤主要由磚紅色砂巖發(fā)育而成的山地黃壤和少量酸性紫色土構成。土層厚度60~80 cm，pH值4.60~5.05，土壤質(zhì)地黏性，立地指數(shù)10~12，土層深厚、疏松、肥力中等[3]。

該杉木二代無性系種子園于1992年整地造林，1994年嫁接，由220個無性系采用順序錯位排列的方式進行配置。

2 研究方法

2016年2月底，當最高氣溫達到9 ℃且持續(xù)7~10 d，在杉木種子園優(yōu)樹收集區(qū)內(nèi)選擇相鄰的4棵不同基因型母株開始觀察小孢子葉和小孢子葉球的發(fā)育過程，直至單株上的雄球花上不能飄散出花粉為止。

采集新鮮樣品用醋酸洋紅染色10 min后壓片，在奧林巴斯BX-31顯微鏡下觀察并拍照。

每個樣品隨機選擇3個視野，某個時期的小孢子數(shù)量占比>80%則視此時期為取樣小孢子葉球的發(fā)育時期。

2016—2019 年，連續(xù)3年觀察候選母株的散粉情況，記錄散粉開始時期。

3 結果與分析

3.1 小孢子發(fā)育進程與外部特征

觀察發(fā)現(xiàn)，小孢子葉球的發(fā)育程度與其主軸長度相關，當小孢子葉球發(fā)育至5 mm長、呈青色時，醋酸洋紅染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，中部小孢子囊中的小孢子進入四分體時期，可以清晰地發(fā)現(xiàn)，四分體的4個獨立細胞排列成四面體型，萌發(fā)溝朝外（見圖1A、B）。

同一個小孢子葉球上不同部位的小孢子葉發(fā)育進程基本同步，頂部小孢子葉的發(fā)育稍微比基部小孢子葉的發(fā)育快，但不會超過1個時期，即頂部小孢子的發(fā)育狀態(tài)在基部小孢子中均能找到。

隨著小孢子葉的伸長生長，小孢子葉顏色由青綠色轉(zhuǎn)為淡黃色（見圖1D），同時四分體解體為4個單核中央期的花粉粒，此時可見細胞核排列在細胞中央，細胞質(zhì)稠密，沒有液泡或只有小液泡出現(xiàn)（見圖1C），此階段的轉(zhuǎn)化需要7~10 d，轉(zhuǎn)化時長與天氣狀況緊密相關，晴天時間最短，陰雨天需要時間最長。采集此狀態(tài)的小孢子葉球，放置在干燥溫室內(nèi)12~24 h，小孢子葉球干癟，沒有花粉釋放。

當小孢子葉之間的鱗片逐步失水變黃，小孢子囊壁由青色變?yōu)榈S色，花粉粒內(nèi)形成了中央大液泡，細胞核被擠到細胞壁附近，細胞質(zhì)所占比重少，小孢子發(fā)育至單核靠邊期（見圖1E）。小孢子從單核中央期發(fā)育至單核靠邊期的時間為3~7 d。采集此狀態(tài)的小孢子葉球，放置在干燥溫室內(nèi)12~24 h，可促進小孢子囊干燥并釋放出花粉，鏡檢發(fā)現(xiàn)此類花粉的形態(tài)與自然狀態(tài)下的釋放的花粉完全一致，活力相當。

杉木花粉完全成熟時，花粉表面沉積物增多，醋酸洋紅無法透過細胞壁進入花粉內(nèi)。通過明場觀察，可以發(fā)現(xiàn)花粉形似扁球體，花粉長40 μm左右，部分花粉的萌發(fā)溝上有一個乳頭狀突起，有的萌發(fā)溝內(nèi)凹（見圖1F）。單核靠邊期小孢子發(fā)育成熟需要 3~5 d。

當花粉發(fā)育成熟時，鱗片變?yōu)榛液稚ㄒ妶D3A）、小孢子囊壁由黃色變成白色，小孢子葉球拉長至2~5 cm，小孢子間隔可達2~5 mm，陽光直射時，可見外翻的白色小孢子囊（見圖2B，白色箭頭），小孢子囊壁破裂后即可釋放花粉。

圖2 同一簇上的小孢子葉球發(fā)育進程展示Fig.2 Display of microstrobilus development process on the same cluster

圖3 即將進入散粉期的雄球花（A）和收集到的花粉（B）Fig.3 Male cones in the pollinating period (A)and collected pollen (B)

來源于不同基因型母株上的雄球花發(fā)育規(guī)律一致，但進入散粉期的時間差3~7 d。2016—2019年散粉期觀察發(fā)現(xiàn)同一基因型母株在不同年份散粉日期與氣溫相關，但不同年份各基因型進入散粉期的先后順序一致。

3.2 雄球花發(fā)育特征

同一個雄球花上的小孢子葉球表現(xiàn)為：位于中間部位的小孢子葉球發(fā)育最快，四周小孢子葉球發(fā)育較慢，而最外圍小孢子葉球發(fā)育最慢（見圖2A），但發(fā)育落差不會超過2個時期，從時間上分析，差6~12 d。

若雄球花所處環(huán)境太陽直射、通風條件好，則小孢子葉發(fā)育較快，有的小孢子葉完全成熟開始釋放花粉（見圖2B，白色箭頭），而有的小孢子葉的小孢子囊排列緊密（見圖2B，黑色箭頭）收集處理此類雄球花的費效比較高，不建議采集。

因此，在收集雄球花時，應選擇狀態(tài)一致的雄球花，即小孢子葉球的顏色基本一致，鱗片為黃色、小孢子囊壁為淡黃色的雄球花，以及顏色比以上狀態(tài)更深的雄球花均可。此時，大部分小孢子處于單核靠邊期及花粉早期，溫室處理能加快花粉的成熟（見圖3B）。

干燥后的花粉，含水量低，可采用注射器噴施的方法進行雜交授粉。

4 結論與討論

采用人工控制授粉是建立子代測定林、測算遺傳參數(shù)、篩選優(yōu)良家系和單株的主要方法。本研究通過小孢子葉球外部形態(tài)與小孢子發(fā)育進程的對應關系，試驗了各個發(fā)育階段的雄球花干燥后收集花粉的比例，發(fā)掘適宜于溫室干燥處理的雄球花采摘時期。

杉木生殖生物學研究豐富，從大小孢子發(fā)育[4]、花粉飄散規(guī)律到種子園花粉發(fā)育特征等各層面均有研究。本研究認為四川杉木四分體為四面體結構，與董金生[5]在江西的研究結論一致，而徐進[6]則認為杉木四分體主要是單平面分裂的方式，推測四分體狀態(tài)與杉木種源有關系。

花粉飄散規(guī)律方面，張卓文對浙江、湖北多個種子園的花粉散發(fā)規(guī)律進行了研究[7]，陳曉陽對貴州黎平杉木種子園花粉飛散進行了研究，提出半同胞子代測定的球果要從樹冠上部采集[8]。陳波濤等研究了3個杉木種子園花粉釋放和花粉密度，發(fā)現(xiàn)花粉飛散持續(xù)時間長短與天氣狀況緊密相關[9]，本研究也得出了類似的結論。

不同地區(qū)杉木花芽開始分化的時期不同，如貴州黎平杉木5月下旬出現(xiàn)雄球花原基，而福建杉木6月下旬出現(xiàn)雄球花原基[10]，湖北崇陽杉木5月中下旬開始雄球花分化[7]。而異地引種后杉木長時間栽培能改變其原有物候，與本地杉木的物候有一定程度的“趨同”現(xiàn)象[7]。杉木小孢子發(fā)生時期在單株之間的差異每年都一致[5]，因此，人們所期望的種子園內(nèi)完全隨機交配很難發(fā)生，這與本研究連續(xù)3年的觀察結果一致。