UPLC-ESI-MS/MS法測定苗藥隔山消中8個成分含量*

秦蘭， 孫佳， 劉春花， 陸苑， 潘潔， 李勇軍， 王永林， 林昌虎***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

苗藥隔山消又名飛來鶴、過山消及白首烏等，為蘿藦科白前屬植物耳葉牛皮消[Cynanchumauriculatum (C.auriculatum)Royle ex Wight]的干燥塊根，主產(chǎn)于湖南、湖北、四川及貴州等地，始載于宋朝《開寶本草》，現(xiàn)收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003 年版)，在我國已有悠久的藥用歷史[1-5]。根據(jù)苗醫(yī)藥理論, 隔山消為和性、屬慢經(jīng)，具有甜、淡的質(zhì)征，走中關(guān)，具有健胃消食、補虛弱及通氣催乳的功效，臨床主用治胃痛、食積胞脹、小兒疳積、多年老胃病及少乳、虛勞性損傷及痢疾等，在苗族地區(qū)應(yīng)用較廣，為常用治療胃腸疾病的藥物[6]?，F(xiàn)代研究表明隔山消中主要含有苯乙酮類、甾體苷類、有機酸類、香豆素類及木脂素類等多種化學(xué)成分，具有促進胃腸道運動、抗抑郁、抗腫瘤、抗功能性消化不良及保肝等作用[7-10]?！顿F州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)中僅對隔山消的性狀、鑒別、薄層色譜鑒別、性味、功能主治、用法用量及儲藏條件等方面制定了標(biāo)準(zhǔn)，而對其主要成分的含量測定方法暫未制定標(biāo)準(zhǔn)[3]。目前隔山消的研究主要集中在化學(xué)成分的分析與分離提取上，而對于化學(xué)成分的含量測定報道較少，且主要是對單個指標(biāo)或同類別化合物進行含量測定，如曹雨等[11]應(yīng)用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive)技術(shù)快速歸屬和鑒定隔山消抗神經(jīng)氨酸酶最佳活性部位中的化學(xué)成分；謝凱強[12]利用超高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)和核磁共振氫譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)對隔山牛皮消、耳葉牛皮消和戟葉牛皮消三種民間稱之為“隔山消”的植物中C21-甾體苷元類化學(xué)成分進行分析并建立了指紋圖譜；孫佳等[13]采用HPLC同時測定隔山消中5個同類成分的含量；肖培云等[14]采用HPLC法測定隔山消中沒食子酸的含量。由于中藥的化學(xué)成分具有復(fù)雜性與多樣性的特點，在中藥有效成分尚不明確的情況下若只采用一個或幾個少數(shù)指標(biāo)進行質(zhì)量評價，不能全面真實反映藥材的質(zhì)量狀況。本課題組前期研究中已證明隔山消水溶性部位提取物能促進小鼠胃排空和腸推進，其主要成分為告達亭、松脂素、白首烏二苯酮、阿魏酸、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯、丁香酸及綠原酸等[15]。因此，為完善隔山消的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究選擇上述8個成分作為含量測定的指標(biāo)成分，并結(jié)合超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-high-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS)技術(shù)的高分辨、高分辨性、高靈敏度、專屬性好及檢測周期短等特點[16-23]，建立同時測定苗藥隔山消中告達亭、松脂素、白首烏二苯酮、阿魏酸、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯、丁香酸及綠原酸 8 個成分含量的檢測分析方法，以期進一步為隔山消的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1藥材來源 13批次隔山消藥材購自貴州省、甘肅省、四川省及云南省等地(表1)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室劉春花副教授鑒定為蘿藦科植物耳葉牛皮消(C.auriculatum)的干燥塊根。

表1 藥材來源Tab.1 Source of medicinal materials

1.1.2主要試劑與儀器 ACQUITY 系統(tǒng)超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)量分析器和 Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站(美國 Waters 公司)，Allegra 64R 型低溫高速離心機(Beckman Coulter 公司)，ZH-2 型渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)，AE240 型十萬分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，F(xiàn)L-UP-YZ-20 型超純水儀(蘇州飛鹿環(huán)?？萍加邢薰?，KQ-250E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)化合物白首烏二苯酮(由實驗室自制，經(jīng)HPLC檢查，用面積歸一化法計算，純度大于98%)，告達亭、松脂素、芹菜素(成都埃法生物科技有限公司，批號AF8071803、AF9052003、AF7061813，純度均≥98%)，東莨菪內(nèi)酯、丁香酸、阿魏酸、沒食子酸(成都普思生物科技股份有限公司，批號PS010525、PS010564、PS010591、PS000688，純度均≥98%)，甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck 公司)，水為超純水(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)，其余試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，保護柱為 Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～0.5 min、90%～85%A，0.5～3.0 min、85%～75%A，3.0～3.2 min、75%～70%A，3.2～4.0 min、70%～68%A；4.0～4.5 min，68%～10%A；4.5～5.0 min，10%A，5.0～5.5 min、90%A)；流速 0.35 mL /min；柱溫40 ℃；進樣量1 μL。電噴霧電離源(electrospray ionization source，ESI)、去溶劑氣(氮氣1 000 L/h)及其溫度(600 ℃)，碰撞氣(氬氣50 L/h)，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM；表2)。

1.2.2供試品和混合對照品溶液的制備 隔山消藥材經(jīng)粉碎(過5號篩)，精密稱取2.0 g，置于圓底燒瓶，加70%甲醇25 mL，稱定重量，水浴加熱回流提取1.5 h，放置室溫；再稱定重量，70%甲醇補足失重，搖勻、濾過，取續(xù)濾液1 mL 置于2 mL 容量瓶，加50%甲醇定容；14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。分別取1～8 種對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解、搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為95.238 1 mg/L(白首烏二苯酮)、23.809 5 mg/L(阿魏酸 )、9.523 8 mg/L(松脂素)、4.761 9 mg/L(沒食子酸、丁香酸)、1.904 8 mg/L(東莨菪內(nèi)酯、告達亭)及0.952 4 mg/L(綠原酸)的混合對照品儲備液。

1.2.3專屬性考察 取混合對照品溶液及 50%甲醇水空白溶劑按照“1.2.1”項下的液質(zhì)聯(lián)用條件進樣分析。

1.2.4線性關(guān)系及定量限考察 取“1.2.2”項下混合對照品儲備液適量，加 50%甲醇水稀釋成6個濃度的系列混合對照品溶液，按照“1.2.1”項下的液質(zhì)聯(lián)用方法進樣分析。以各待測成分質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以檢測成分峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)；配制混合對照品溶液，成比例稀釋，進樣分析，按待測成分信噪比S/N=10計算定量限。

1.2.5精密度考察 取混合對照品溶液，按照“1.2.1”項下的液質(zhì)聯(lián)用條件連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，計算8種成分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)，評估儀器精密度。

1.2.6重復(fù)性考察 按照“1.2.2”項下方法制備同一批樣品(編號A3)的供試品溶液6 份，按照“1.2.1”下的液質(zhì)聯(lián)用條件進樣分析，測得各成分峰面積，計算8種成分平均含量及RSD，評估方法重復(fù)性。

1.2.7穩(wěn)定性 取A3樣品按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12及24 h 按照“1.2.1”項下的液質(zhì)聯(lián)用條件進樣檢測峰面積，計算8種成分RSD，評估供試品溶液在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.8加樣回收率 精密稱取已知含量的隔山消藥材粉末(A3)9 份、1.00 g/份，均分為3 組，根據(jù)已知藥材含量按比例1.00 ∶0.50、1.00 ∶1.00及1.00 ∶1.50精密加混合對照品溶液，制成低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定。

1.2.9樣品測定 分別取13批隔山消藥材，按照“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-ESI-MS的建立

本研究設(shè)定的色譜條件和質(zhì)譜條件可測得隔山消中8種成分的色譜峰(圖1)，隔山消中告達亭、松脂素、白首烏二苯酮、阿魏酸、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯、丁香酸及綠原酸在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(表3)，8種成分的回收率為95.247%～102.432%，RSD為0.553%～2.590%(表4)，提示本研究建立的方法可用于隔山消中8種成分含量的測定。

混合對照品溶液 供試品溶液 空白溶液注 ：A為告達亭，B為松脂素，C為綠原酸，D為白首烏二苯酮，E為丁香酸，F(xiàn)為阿魏酸，G為東莨菪內(nèi)酯，H為沒食子酸。圖1 混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶液中8個成分的提取Fig.1 Extracted ion chromatograms of 8 compounds in mix-reference solutio,test solution , and blank solution

表3 隔山消8種成分的回歸曲線方程及定量限Tab.3 Regression equation and quantitation limits of 8 components

表4 隔山消8種成分回收率試驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery rate tests of 8 components in radix cynanchi

2.2 精密度試驗、重復(fù)性試驗及穩(wěn)定性試驗

精密度試驗中，告達亭、松脂素、白首烏二苯酮、阿魏酸、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯、丁香酸及綠原酸的峰面積RSD分別為1.14%、0.84%、0.59%、1.09%、0.81%、1.36%、0.42%及0.63%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性試驗中告達亭、松脂素、白首烏二苯酮、阿魏酸、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯、丁香酸、綠原酸的平均含量分別為 1.33、11.76、130.82、4.64、0.19、4.10、3.16及18.17 μg/g，RSD分別為 2.02%、2.14%、2.35%、1.92%、1.30%、1.40%、1.64%及2.13%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗中，告達亭、松脂素、白首烏二苯酮、阿魏酸、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯、丁香酸及綠原酸的峰面積RSD分別為 0.61%、1.44%、0.35%、1.38%、1.76%、1.29%、1.11%及0.62%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 隔山消中8種成分含量

不同批次樣品間各成分的含量差異較大，同時白首烏二苯酮的含量最高，松脂素、阿魏酸和綠原酸的含量相對較高，其余成分含量較低。見表5。

表5 樣品中8種成分含量Tab.5 Determination results of 8 components in samples

3 討論

隔山消為少數(shù)民族地區(qū)的傳統(tǒng)習(xí)用藥物，也是中藥白首烏的主要品種之一，具有清熱解毒、散結(jié)行瘀、生肌止痛、消食的功效，可治療刀傷出血、毒瘡紅腫、隔食飽脹、小兒肺炎及腎炎等[24]?，F(xiàn)代研究證實隔山消為健胃藥，具有改善腸胃運動、提高消化及攝納食物功效，主要應(yīng)用于胃腸疾病的治療[25]。本實驗考察了不同溶劑提取(水、30%甲醇、50%甲醇 、70%甲醇、100%甲醇、30%乙醇、50%乙醇 、70%乙醇及100%乙醇溶液)和不同提取方式(加熱回流和超聲提取)對隔山消成分提取效果的影響，結(jié)果顯示用 70%甲醇水溶液回流提取的方式，提取效果最佳；提取時間考察嘗試了加熱回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0及4.0 h，結(jié)果顯示回流提取1.5 h的成分峰形較好且提取成分較豐富，因此本研究確定隔山消最佳提取工藝為70%甲醇水溶液回流提取1.5 h。

中藥作為一種多療效多靶點的復(fù)雜天然藥物，單一成分的含量并不能體現(xiàn)其真實藥效[26]。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展和儀器性能的提高，多成分含量測定方法已成為中藥現(xiàn)代化質(zhì)量控制的手段和趨勢[27]。因此建立一種靈敏、快速及可靠的定量分析方法同時測定隔山消藥材中主要成分的含量是極其有必要的。研究前期嘗試使用HPLC法測定，但各成分之間分離度低，耗時長，且各成分響應(yīng)較低，尤其是含量較低的告達亭類和沒食子酸類成分，無法實現(xiàn)定量分析，因此考慮選擇具有耗時短、選擇性高、靈敏度高及專屬性好的UPLC-ESI-MS法進行分析。UPLC-ESI-MS/MS技術(shù)集分離、定性和定量于一體，可同時對同一樣品中多種成分進行檢測。因此本研究建立了適當(dāng)?shù)腢PLC-ESI-MS/MS分析方法用于同時測定不同產(chǎn)地隔山消藥材中告達亭等8個成分的含量。

本實驗在優(yōu)化色譜條件時本實驗在優(yōu)化色譜條件時，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相的色譜行為，結(jié)果表明0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水具有更好的色譜分析效果，基線更加平穩(wěn)、峰形更加尖銳、分離度也較好，適當(dāng)酸的加入可以維持樣品在流動相中的電離狀態(tài)，有助于增強各成分的響應(yīng)，同時可以改善峰型。因此，本實驗將0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫，實驗結(jié)果表明不同批次間各成分的含量差異較大，可能與不同采收時間、不同氣候及不同地理位置等因素有關(guān)；同時白首烏二苯酮的含量最高，松脂素、阿魏酸和綠原酸的含量相對較高，可考慮將這些成分作為隔山消藥材質(zhì)量控制的重要指標(biāo)性成分。

綜上所述，本研究建立了UPLC-ESI-MS/MS法同時測定隔山消藥材中告達亭、松脂素、白首烏二苯酮、阿魏酸、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯、丁香酸及綠原酸8個成分的含量，該方法簡單、快捷，靈敏度高，專屬性好，可為隔山消藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。