高效降解1，2-丙二醇菌株的篩選及其性能研究

司景， 邊俠玲

（1.安徽環(huán)境科技研究院股份有限公司， 合肥 230088； 2.安徽安生生物化工科技有限責(zé)任公司， 合肥 230088）

1，2－丙二醇為無色無味、 黏稠性較大的液體，與水、 乙醇及多種有機(jī)溶劑混溶， 是重要的化工原料或助劑［1］。 由于其吸濕性和特殊的溶解性， 被廣泛應(yīng)用于印染和抗凍劑等領(lǐng)域［2］。 不論是1，2－丙二醇的生產(chǎn)過程還是將其作為原料使用， 都會(huì)產(chǎn)生大量含1，2－丙二醇的廢水［3］， 當(dāng)其排放濃度較高時(shí)， 對(duì)環(huán)境有害且會(huì)對(duì)動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制［4］。

生物法處理廢水具有成本低、 效率高、 操作簡(jiǎn)單、 無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。 生物法處理含高濃度1，2－丙二醇廢水的關(guān)鍵在于微生物菌種的篩選， 篩選具有高效降解性能的微生物已成為廢水生物法處理的核心工作［5－7］。 本研究從化工廠廢水處理站活性污泥中篩選得到6 株耐受1，2－丙二醇的菌株， 經(jīng)進(jìn)一步篩選與馴化， 從中得到1 株能高效降解1，2－丙二醇、 除醇能力較好的菌株， 對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定， 并考察了不同因素對(duì)該菌株降解1，2－丙二醇的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

（1） 菌種來源。 菌種取自安徽省銅陵市某化工廠廢水處理站的活性污泥。

（2） 模擬廢水。 按照新鮮污泥與水體積比為9 ∶20 共配制1 000 mL， 向其中加入5 mL 營(yíng)養(yǎng)液（淀粉、 尿素、 磷酸鈣的質(zhì)量比為20 ∶2 ∶1）， 混合均勻， 加入1，2－丙二醇（體積分?jǐn)?shù)為0.5%）， pH 值控制在7.0±0.2。 經(jīng)測(cè)定， 模擬廢水COD 初始質(zhì)量濃度為12 801 mg／L。

（3） 富集培養(yǎng)基。 酵母粉10 g／L， 蛋白胨20 g／L， 葡萄糖20 g／L， 瓊脂20 g／L（配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入）， 其余為蒸餾水。 121 ℃滅菌20 min。

（4） 篩選培養(yǎng)基。 在富集培養(yǎng)基加入1，2－丙二醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為0.5%）。

1.2 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)裝置為活性污泥生化反應(yīng)器， 該反應(yīng)器內(nèi)徑為12 cm， 高度為120 cm， 通過循環(huán)水浴控制反應(yīng)器溫度。 反應(yīng)器設(shè)置有污泥循環(huán)管道， 便于優(yōu)勢(shì)菌群的富集； 反應(yīng)器上配有溫度計(jì)和pH 計(jì)， 實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

（1） 菌種分離與純化。 將取自化工廠廢水處理站的活性污泥樣品置于錐形瓶中， 搖勻后取1 mL稀釋至106倍。 吸取稀釋后的樣品100 μL 涂布在富集培養(yǎng)基中， 30 ℃培養(yǎng)3 d， 挑取單菌落至新的富集培養(yǎng)基中劃線分離得純種菌。

（2） 篩選與馴化。 將上述分離所得純種菌接種至篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)， 挑選出長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株，并進(jìn)行保存。

（3） 菌株的鑒定。 采用16S rDNA 方法對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行鑒定。

（4） 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。 將已活化的菌液按2.0%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接至富集培養(yǎng)基中， 于30 ℃、 200 r／min 條件下培養(yǎng)， 在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定菌液的OD600值。 以時(shí)間為橫坐標(biāo)， 吸光度為縱坐標(biāo)繪制出生長(zhǎng)曲線。

（5） 最佳除醇pH 值的確定。 向反應(yīng)體系中加入適量NaOH 和HCl 溶液， 調(diào)節(jié)模擬廢水pH 值分別為3、 5、 7、 9、 11， 并加入5.0%（體積分?jǐn)?shù)）菌液， 于30 ℃條件下培養(yǎng)6 d 后， 取樣分別測(cè)定COD濃度和OD600值， 根據(jù)COD 降解率確定最佳pH 值。

（6） 最佳除醇溫度的確定。 調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值至最佳pH 值， 向其中加入5.0%（體積分?jǐn)?shù)）菌液， 在溫度分別為25、 30、 35、 40、 45 ℃， 培養(yǎng)6 d 后， 取樣分別測(cè)定COD 濃度和OD600值， 根據(jù)COD 降解率確定最佳溫度。

（7） 最佳除醇時(shí)間的確定。 在上述所得最佳pH 值和溫度條件下， 向反應(yīng)體系中加入5.0%（體積分?jǐn)?shù)）活化后的菌液， 每24 h 取樣。 取樣后測(cè)定COD 濃度并進(jìn)行氣相色譜（GC）分析。

1.4 分析方法

COD 濃度采用重鉻酸鉀法［8］。

1，2－丙二醇的檢測(cè)方法為氣相色譜法。 采用Inert Cap 系列氣相色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）； 進(jìn)樣口溫度： 250 ℃； 程序升溫： 80 ℃（1 min）→200 ℃（3 min）→250 ℃（3 min）。 載氣： 高純空氣， 流量： 0.5 mL／min； 進(jìn)樣方式： 分流進(jìn)樣， 分流比30 ∶1； 進(jìn)樣量： 1.0 μL。

模擬廢水中有機(jī)污染物只有1，2－丙二醇， 因此采用COD 降解率（η）來說明1，2－丙二醇被微生物降解的情況， 公式如下：

式中： C0、 Ct分別為初始、 處理后的COD 質(zhì)量濃度， mg／L。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

從活性污泥樣品中共篩得6 株生長(zhǎng)情況較好的微生物， 分別記為GLY－1， GLY－2， GLY－3， GLY－4， GLY－5， GLY－6。 將這6 株微生物分別接入篩選培養(yǎng)基中， 于30 ℃、 200 r／min 的條件培養(yǎng)3 d 后，取樣測(cè)定COD 濃度和OD600值， 結(jié)果見表1。

從表1 可以看出， 6 株菌在篩選培養(yǎng)基中都可以降解1，2－丙二醇， 其中以GLY－4 菌株的降解效果 最 好， COD 降 解 率 可 達(dá)99.32%。 因 此 選 擇GLY－4 菌株為后續(xù)試驗(yàn)菌。

表1 6 株微生物的COD 降解率和OD600 值Tab. 1 COD degradation rate and OD600 value of 6 strains

2.2 菌株鑒定

將GLY－4 菌株的16S rDNA 序列與NCBI 中的序列進(jìn)行比較， 該菌株與Pseudomonas nitroreducens同源性達(dá)到99%。 初步鑒定GLY－4 為硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens）。

2.3 GLY－4 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

GLY－4 菌株的生長(zhǎng)曲線如圖1 所示。 由圖1可以看出， GLY－4 在3 h 左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 在34 ～72 h 處于平穩(wěn)期， 72 h 后進(jìn)入衰亡期。

圖1 CLY-4 菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of CLY-4 strain

2.4 pH 值對(duì)GLY－4 除醇效果的影響

pH 值對(duì)GLY－4 除醇效果的影響如圖2 所示。由圖2 可以看出， 當(dāng)pH 值過高（pH=11）或者過低（pH=3）時(shí)， COD 降解率均低于70%， 這是因?yàn)閜H值過高或者過低， 對(duì)GLY－4 的生長(zhǎng)不利， 菌株無法良好生長(zhǎng)， 從而對(duì)1，2－丙二醇的降解效果變差，COD 降解率不高。 因此確定GLY－4 的最佳除醇pH值為7。

圖2 pH 值對(duì)GLY-4 除醇效果的影響Fig. 2 Influence of pH value on 1,2-propylene glycol removal by GLY-4

2.5 溫度對(duì)GLY－4 除醇效果的影響

不同溫度對(duì)GLY－4 除醇效果的影響如圖3 所示。 由圖3 可以看出， 當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)， GLY－4對(duì)1，2－丙二醇的降解效果最好， COD 降解率可達(dá)99% 以上。 結(jié)合OD600值可知， 在其他溫度時(shí)GLY－4 的生長(zhǎng)沒有30 ℃時(shí)好， GLY－4 對(duì)1，2－丙二醇的降解效果變差， COD 降解率也相應(yīng)降低。因此確定GLY－4 最佳除醇溫度為30 ℃。

圖3 溫度對(duì)GLY-4 除醇效果的影響Fig. 3 Influence of temperature on 1,2-propylene glycol removal by GLY-4

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)GLY－4 除醇效果的影響

COD 降解率隨時(shí)間的變化情況如圖4 所示。由圖4 可以看出， 反應(yīng)1 d 后COD 的質(zhì)量濃度為10 632 mg／L， 6 d 后COD 的質(zhì)量濃度降至81 mg／L， 低于100 mg／L。 其中1～2 d 內(nèi)COD 濃度快速降低， 結(jié)合圖1 的生長(zhǎng)曲線可知， 此時(shí)微生物處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平穩(wěn)期， 微生物快速增長(zhǎng)并維持在較高濃度， 降解1，2－丙二醇的速率較快， 3 d 后微生物進(jìn)入衰亡期， 菌體大量自溶、 菌濃較低， 降解1，2－丙二醇的速率變慢。

圖4 COD 降解率隨時(shí)間的變化情況Fig. 4 COD degradation rate changes along with time

1，2－丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品（0.5%）的GC 圖譜如圖5（a）所示， 模擬廢水經(jīng)GLY－4 處理不同時(shí)間后所得樣品的GC 圖譜如圖5（b）所示。

圖5 1，2－丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品與處理后樣品的GC 圖譜Fig. 5 GC spectrums of 1，2-propylene standard sample and treated sample

由圖5 可以看出， 所得樣品中均含有1，2－丙二醇， 并無其他雜峰； 與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積相比， 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)， 1，2－丙二醇特征峰的峰面積顯著降低， 由此可知模擬廢水中1，2－丙二醇含量越來越低； 6 d 后1，2－丙二醇無檢出， GLY－4 對(duì)1，2－丙二醇的降解效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而越來越好。

3 結(jié)論

（1） 以某化工廠廢水處理站的活性污泥為菌源， 篩選出6 株耐受1，2－丙二醇的微生物， 其中GLY－4 菌株微生物可對(duì)1，2－丙二醇具有較高的降解率， 經(jīng)鑒定為硝基還原假單胞菌。

（2） 在pH 值為7、 溫度為30 ℃的條件下，利用GLY－4 菌株處理1，2－丙二醇（體積分?jǐn)?shù)為0.5%）模擬廢水， 反應(yīng)6 d 后COD 的降解率達(dá)到99.37%， 該菌株對(duì)1，2-丙二醇的降解效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而越來越好。